Hematopoetik Kök Hücrelerde ve T-Hücrelerinde Mitokondriyal Kitle ve Membran Potansiyelinin Akış Sitometrisi ile Ölçülmesi

Özet

Burada ex vivo kültürlü hematopoetik kök hücreler ve T hücrelerinde mitokondriyal kitle ve membran potansiyelini ölçmek için güvenilir bir yöntem açıklanmaktadır.

Özet

Quiescence ince bir denge, kendini yenileme, ve farklılaşma hematopoetik kök hücre korumak için anahtar (HSC) havuzu ve tüm olgun kan hücrelerinin ömür boyu üretimini korumak. Son yıllarda hücresel metabolizma HSC fonksiyonu ve kaderinin önemli bir düzenleyicisi olarak ortaya çıkmıştır. Daha önce mitokondriyal metabolizma modülasyonunun HSC kaderini etkilediğini göstermiştir. Özellikle, elektron taşıma zincirini kimyasal olarak ayırarak hsc işlevini normalde hızlı farklılaşmaya neden olan kültür koşullarında sürdürebildik. Ancak, HSC sayılarını sınırlamak genellikle HSC metabolizmasını ölçmek ve bu nedenle işlevlerini tahmin etmek için standart tahlillerin kullanılmasını engellemez. Burada, HSC'ler gibi kıt hücrelerde mitokondriyal membran potansiyelinin ve mitokondriyal kitlenin güvenilir ölçümüne olanak tanıyan basit bir akış sitometri sitometrisi tayini sitoz raporu. HSC'lerin fare kemik iliğinden izolasyonu ve mitokondriyal kütle ve membran potansiyeli post ex vivo kültürünün ölçülmesi tartışılmaktadır. Örnek olarak, metabolik modülatör ile tedavi yoluyla HSC'lerde bu parametrelerin modülasyon göstermek. Ayrıca, insan periferik kan türetilmiş T hücreleri ve insan tümörü lenfositler (TILs) infiltrasyon, onların mitokondriyal profillerinde dramatik farklılıklar gösteren, muhtemelen farklı T hücre yansıtan bu metodolojinin uygulama genişletmek Işlevsel -liği. Bu töbyenin farklı bağlamlarda çeşitli hücre tiplerinde mitokondriyal metabolizmamodülatörlerini belirlemek için yapılan taramalarda işe yadabileceğine inanıyoruz.

Giriş

Hematopoetik kök hücreler (HSCs) bir organizmanın ömrü boyunca kan üretimi ve homeostaz sağlayan kemik iliğinde yaşayan hücrelerin küçük bir popülasyonvardır. HSC'ler bu süreci, hücre bölünmesi ve iyi düzenlenmiş farklılaşma adımları¹ile ölümcül farklılaşmış olgun kan hücresi soyları üreten atalara yol açarak aracılık etmektedir. Daha da önemlisi, HSC'ler enerjilerini anaerobik glikoli yoluyla üretirler. Buna karşılık, daha kararlı ve aktif hematopoetik atalar mitokondriyal metabolizma doğru metabolizmageçiş^2,3,4. Bu farklı metabolik durum aktif mitokondri tarafından üretilen reaktif oksijen türlerinin (ROS) neden olduğu hücresel hasara karşı HSC'leri korumak için inanılmaktadır, böylece in vivo fonksiyonu^uzunvadeli korumak 5^,6,7,8. HSC metabolik durumunun doğrudan ölçümü, sınırlı sayıdan dolayı zordur ve genellikle düşük iş üretimidir. Burada, tetrametilloidamin metil ester (TMRM) floresan kullanarak mitokondriyal membran potansiyelinin (ΔM) sağlam ölçümü için akış sitometri sitometrisi esaslı bir test ve HSC'lerde yeşil floresan mitokondriyal leke (Mitotrackerrül) kullanılarak mitokondriyal kütleyi tanımlıyoruz. Daha önce düşük ΔSm son derece saflaştırılmış HSCs iyi niyetli fonksiyonel belirteç olduğunu göstermiştir⁹ ve metabolik modülatörler ΔSC fonksiyonu geliştirmek^{geliştirmek 9,10}. Burada, HSC'lerin uzun vadeli kan yeniden yapılanma potansiyelini geliştirebilen yeni molekülleri belirlemek için strateji olarak HSC'ler mitokondriyal profilleme yöntemimizi kullanmayı öneriyoruz.

Örnek olarak, b3 vitamini analog nikotinr riboside (NR) maruz kaldıktan sonra bu titreşinin HSC ΔSm'nin alçaltMasını güvenilir bir şekilde ölçtettiğini gösteriyoruz. Buna göre, yakın zamanda yayınlanan çalışmamızda NR'nin hem fare hem de insanlaştırılmış fare sistemlerinde kan kurtarma sonrası naklini doğrudan hematopoetik kök ve ata fonksiyonlarını geliştirerek güçlü bir şekilde iyileştirdiğini gösteriyoruz¹⁰. Bu tür metabolik modülatörlerin kapasitesi, nakledilen hastalarda %25'lik bir ölüm oranının kandaki gecikmeye ve immün iyileşmeye bağlı olduğu düşünülürse klinik değeri yüksektir^11,12.

Ayrıca, bu metodolojinin insan T hücrelerinin metabolik profilinin ve fonksiyonunun karakterizasyonu için uygulanabildiği kanıtlarını saklı tmaktadır. Son yıllarda, otolog tümör infiltrasyon lenfositler (TILs) kullanarak benimseyen hücre tedavisi (ACT) gelişimi son derece olumsuz prognoz ile ileri kanser bazı türleri için en etkili yaklaşım haline gelmiştir (örneğin, metastatik melanom, nerede >50% hastaların tedaviye yanıt ve hastaların% 24 kadar tam regresyon var)¹³. Ancak, yeterli antitümör aktivitesi barındıran TILs oluşturmak zordur¹⁴. TILs ex vivo genişleme sırasında geçmesi geniş proliferasyon ve stimülasyon T hücre yorgunluğu ve önemli ölçüde T hücre antitümör yanıtı bozan senescence neden¹⁵. Daha da önemlisi, TILs 'antitümöral kapasitesi sıkıca^{metabolizma16}bağlı^,17 ve PI3K / Akt yolunun inhibisyonu ile metabolizma modüle amaçlayan yaklaşımlar cesaret verici sonuçlar üretti^18,19. Bu nedenle periferik kan mononükleer hücreleri (PBMCs) ve hasta kaynaklı TIL'lerden elde edilen T hücrelerinin ΔMm'sini karşılaştırıyoruz ve daha az diferansiye PBMC türetilmiş T hücrelerinin ölümcül farklılaştırılmış TIL'lere kıyasla δM ve mitokondriyal kütleye sahip olduğunu gösteriyoruz.

Bu tözün, ΔDm modülasyonu ile HSC ve T hücre fonksiyonunu iyileştiren yeni metabolik modülatörleri tanımlamak için kullanılabileceğini öngörüyoruz.

Protokol

El yazmasında açıklanan tüm deneyler kurumumuzun yönergelerine uyar ve İsviçre hayvan deneyleri (Yetki: VD3194) ve insan örneklerini içeren araştırmalar için İsviçre yasalarına uygun olarak yürütülmüştür (Protokol: 235/14; CER-VD 2017-00490)

1. Hematopoetik Kök Hücre Ekstraksiyonu

1. Yabani tip C57BL6/J fareler satın alın ve taşımayla ilgili stresi azaltmak için en az bir hafta hayvan evinde saklayın.
2. Deney günü, CO₂ boğulması kullanarak fareyi ötenazi edin.
3. Kürk sterilize etmek için% 70 etanol ile fare sprey ve arka bacaklardan femur ve tibia kemikleri kesmek için, diseksiyon makas ve forceps gibi standart cerrahi araçlar kullanarak karın fare açık kesti.
4. Femur, tibia ve pelvis'e bağlı kasları yumuşak bir kağıt havlu kullanarak çıkarın ve temizlenmiş kemikleri buz üzerinde 1 mM EDTA (tampon) içeren PBS içeren 50 mL'lik bir tüpe yerleştirin.
5. Sprey bir harç ve havaneli ile 70% etanol ve bir hücre kültürü başlık yerleştirin. 30 dk. Post sterilizasyon etanol izlerini kaldırmak için tampon ile havan ve havaneli durulamak IÇIN UV ile sterilize.
6. Havan içine bazı tampon (~ 10 mL) ile temiz kemikleri koyun ve yavaşça süspansiyon kemik iliği almak için onları ezmek. Şimdi, hücre süspansiyonu toplamak ve tek bir hücre süspansiyon almak için 50 mL tüp içine 70 μm hücreli süzgeç ile geçmek.
7. Tüm kemik iliği çıkarılana ve kemik enkazı beyaza dönene kadar 1.6.
8. Kemik iliği tek hücre süspansiyonu içeren 50 mL tüp(ler) bir santrifüj üzerine yerleştirin. Hücreleri peletlemek için 4 °C'de 10 dk için 300 x g'de santrifüj çalıştırın.
9. Bu arada, otoklavlı distile suda 1x RBC lysis tampon 10 mL hazırlayın. Çözeltiyi 0,22 m'lik bir filtreden filtreleyin.
10. Santrifüjden örnek tüpü toplayın ve supernatant decant. Pipet hücre pelet üzerinde 1x RBC lysis tampon(Malzeme Tablosu). Peleti yerinden çıkarve birkaç kez yukarı ve aşağı borular oluşturarak homojen bir çözelti hazırlayın. Tüpün RBC lysis'in insa edilmesi için 1-2 dk oda sıcaklığında olmasını bekleyin. Tüpü tamponla doldurarak lysis işlemini durdurun.
11. Tüpü bir santrifüjüzerine yerleştirin ve 4 °C'de 5 dk için 300 x g'de döndürün. Santrifüj den tüp toplamak ve supernatant decant. 10 mL tampon ekleyerek peleti yeniden askıya alın ve çözeltiyi 70 μm'lik bir süzgeç le yeni bir 50 mL tüpe filtreuygulayArak RBC lysis nedeniyle enkazı temizleyin.
12. Tüpü 300 x g'de 4 °C'de 5 dk santrifüj edin. Santrifüj den tüp toplamak ve supernatant decant. 500 μL arabellekte peleti yeniden askıya alın.
13. 100 μL aliquot çıkarın ve ayrı bir 1,5 mL tüp te saklayın. Kalan 450 μL hücre süspansiyonuna progenitor zenginleştirme kitinden(Malzeme Tablosu)50 μL biotin soy tükenmesi antikor kokteyli ekleyin. 4 °C'de 15 dakika çalkalayıcı ile kuluçkaya yatırın.
14. 4 °C'de 5 dk için 300 x g'de 15 mL tampon ve santrifüj tüp ekleyin. Santrifüj den tüp toplamak ve supernatant decant. 460 μL arabellekte peleti yeniden askıya alın. 10 μL aliquot çıkarın ve ayrı bir 1,5 mL tüp te saklayın.
15. Kalan 450°L hücre süspansiyonuna ata zenginleştirme kitinden(Malzeme Tablosu)50 μL streptavidin manyetik boncuk ekleyin. 4 °C'de 15 dakika çalkalayıcı ile kuluçkaya yatırın.
16. 4 °C'de 5 dk için 300 x g'de 15 mL tampon ve santrifüj tüp ekleyin. Santrifüj den tüp toplamak ve supernatant decant. 5 mL tamponpe pelet resuspend ve 15 mL tüp için çözelti aktarın.
17. Tüpü otomatik bir hücre ayırıcısına(Malzeme Tablosu) götürün. Durulama ve hücre ayırıcısının tüp astar için bir yıkama programı çalıştırın. Numuneyi ve iki toplama tüpünü tüp tutucuya yerleştirin. " Deplete " programını kullanarak ayırmagerçekleştirin. Çalışma sona erdikten sonra otomatik hücre ayırıcısından pozitif ve negatif kesirleri toplayın.
    NOT: Otomatik hücre ayırıcısı yokluğunda kullanıcılar kullanım kılavuzuna göre manuel manyetik sütunları ve ilgili mıknatısları kullanabilirler. Kullanıcılar, el ile ayırma işleminin otomatik olandan daha yavaş olduğunu unutmamalıdır. Ayrıca, manuel sütunlar tıkanma ya da daha yatkındır. Bu nedenle, kullanıcıların numuneyi seyreltmeleri ve sütuna yavaşça yüklemeleri önerilir.
18. Pozitif kesir atın. Negatif kesir tüpünü tamponla doldurun. Tüpü 300 x g'de 4 °C'de 5 dk santrifüj edin.
19. Bu arada, tablo malzemeler ve Tablo 1'deaçıklandığı gibi, antikor karışımını 1 mL nihai hacim çözeltisi ve 200 μL nihai hacim çözeltisinde tek renkli kontroller halinde hazırlayın.
    NOT: TMRM ve yeşil floresan mitokondriyal leke kök hücre marker boyama ile kombine edilecekise, o zaman CD150-PE CD150-PEcy5 ve Streptavidin-Tx streptavidin-Pac Orange ile kırmızı değiştirin.
20. Santrifüjden örnek tüpü toplayın ve supernatant decant. 1 mL antikor karışımında peleti yeniden askıya alın. Tek renkli kontrol tüplerinin her birine (soy hariç) 10 μL hücre (adım 1.13'ten) ekleyin. Lineage tek renkli tüp 10 μL hücreleri (adım 1.14) ekleyin.
21. Numuneyi ve tek renkli kontrol tüplerini 4 °C'de 45 dakika çalkalayıcı üzerinde kuluçkaya yatırın.
22. Tüm tüpleri tampon ve santrifüj ile 300 x g'da 4 °C'de 5 dk doldurun. Supernatant atın ve tampon 200 μL tampon 1 mL örnek resuspend.
23. Numuneyi ve tek renkli kontrolleri 5 mL filtre üstü FACS tüplerine aktarın.
24. Tüpleri ayırma makinesine götürün ve 400 μL kök hücre genişletme ortamı içeren 1,5 mL tüplerde HSC popülasyonu (Şekil 1A'dakigating stratejisi) sıralayın.

2. Hematopoetik Kök Hücrelerin Ex Vivo Kültürü

1. Sıralanmış hücreler içeren tüpleri toplayın (hücre ekstraksiyonu için bölüm 1'e bakın). Tüpleri 300 x g'de 4 °C'de 5 dk santrifüj edin. Peleti çıkarmadan süpernatantın çoğunu nazikçe çıkarın ve hücre peletinin üzerine 50-80°L bırakın. Bu hücre kaybını en aza indirir.
2. Kök hücre genişletme ortamındaki hücre peletini test edilecek koşullara bağlı olarak son bir hacme geri alın (kuyu/kültür durumu başına 100 μL olarak say).
3. Kök hücre genleşme ortamı, kök hücre faktörü (200 ng/mL), FLT3 ligand (4 ng/mL) ve kalem-strep antibiyotikler (%1) içeren 2 x kültür ortamı hazırlayın (2x bazal orta; Malzeme Tablosu).
4. 96 U-alt kuyu plakası(Malzeme Tablosu)tedavi steril doku kültürü alın ve hücrelerin kültürlenecek kuyuları tanımlayın (Şekil 1B'dekiplaka tasarımı).
   NOT: Kullanıcılar marjinal kuyulardan uzak durmaları tavsiye edilir, çünkü buharlaşmaya daha yatkındırlar.
5. Bu kuyulara daha önce 2.3 adımda hazırlanmış 100 μL 2x bazal orta koyun. NR işaretli de 100x NR çözeltisi(Malzeme Tablosu)2 μL ekleyin. NR'yi her 24 saatte bir yeniler.
   NOT: Stok yenileme NR'ye özgüdür. Diğer metabolik modülatörlerin ikmale ihtiyacı olabilir veya gerekmeyebilir.
6. 2x bazal orta içeren kuyuların üzerine 2.2 adımda hazırlanan hücrelerin 100 μL'sini tohum. Bu deneyde kuyu başına tohumlanan HSC sayısı 800-1.000 arasındaydı.
7. 2x bazal orta içeren beş ekstra kuyu hazırlayın. Bunların her birinde 100.000 tam kemik iliği hücresi (adım 1.13)'den itibaren 100 μL'lik kök hücre genişletme ortamında yeniden askıya alınarak kültür sonrası akış sitometrisi analizi için boyama kontrolleri olarak kullanılır.
   NOT: Kullanıcılar post kültür analizi için kök hücre belirteçleri ve mitokondriyal işaretleri birleştirmek istiyorsanız ayrıca ata popülasyonu (Ckit + hücreleri veya LKSCD150 hücreleri) sıralamak için tavsiye edilir. Post kültür akışı sitometri analizi için boyama kontrol kuyularında bu sıralanmış ataları tohum. Tek leke rengi başına bir iyi hazırlayın.
8. Hücreleri içeren kuyulardan buharlaşmayı azaltmak için çevredeki tüm kuyulara 200 μL otoklavlı su koyun. 37 °C ve %5 CO_2'de bir kuluçka makinesinde plakayı rahatsız edilmeden kültür süresi boyunca (72 saat) bırakın. NR'yi her 24 saatte bir doldurmak için plakayı çıkarın ve kuvöze geri yerleştirin.

3. Mitokondriyal Kütle ve Membran Potansiyelinin Ölçülmesi

1. Kültür döneminin sonunda kök hücre genleşme ortamında(Malzeme Tablosu)TMRM (20 μM) ve Mitotracker yeşili (10 μM) (yeşil floresan leke) 100 x'lik bir çözüm hazırlayın.
2. Test kuyularının her birine 2 μL 100x TMRM çözeltisi ve 2 μL 100x yeşil floresan leke çözeltisi ekleyin. TMRM kontrolüne 2 μL 100x TMRM ekleyin. Mitotracker kontrol kuyusu 100x yeşil floresan leke 2 μL ekleyin. Plakayı 37 °C'de bir kuvöze yerleştirin ve 45 dk.
   NOT: ABC pompa aracılı boya efflux test edilmesi gerekiyorsa Verapamil (ABC pompa inhibitörü) ile ek bir kontrol hazırlanabilir. Bunun için, TMRM ve yeşil floresan lekesi için boyama önce test kuyularından biri 1 saat 50 μM Verapamil ekleyin.
3. Plakayı kuvözden çıkarın ve 5 dk. Standart FACS tampon (PBS-1 mM EDTA-P/S-2% FBS) 200 μL ekleyin, 5 dk için 300 x g plaka santrifüj. Bu yıkama adım 3x tekrarlayın. Kullanıcılar, doğrudan ışığa en az maruz kalma sağlamak için plakanın her zaman folyo ile kaplı olduğundan emin olmalıdır.
   NOT: Eğer kullanıcıların mitokondriyal lekele kök hücre boyama ile birleştirmeleri gerekiyorsa, numunenin tüm kök hücre belirteçlerinin antikor karışımıyla kuluçkaya yatırılması ve tek renkli kontrollerin 4 °C'de 30-45 dakika boyunca ayrı ayrı antikorlarla boyanması gerekir.
   NOT: Her adımda kullanıcılar plaka alüminyum folyo ile kaplı tutmak gerekir. Kullanıcılar bu ek boyama adımı ve sonraki yıkama adımları ek hücre kaybına neden olabilir dikkat etmelisiniz.
4. 200 μL'lik FACS tamponundaki hücreleri yeniden askıya alın ve FACS tüplere aktarın.
5. Akış sitometresindeki örnekleri çalıştırın (bkz. Şekil 1). WBM içeren tek renkli tüpler şunlardır: (1) Lekesiz; (2) DAPI; (3) TMRM (PE); (4) yeşil floresan leke (FITC); (5) Tam leke (PE ve FITC).
6. Önce makineyi kurmak için tek renkli denetimleri edinin. Telafiyi hesaplamak için makinede çalışan yazılımı kullanın. Tazminat uygulandıktan sonra, HSC örneğini edinin ve mümkün olduğunca çok olay kaydedin.
   NOT: Kök hücre ve mitokondriyal belirteçler birleştirilirse, kullanıcıların TMRM (PE), CD150 (PE-Cy5) ve Sca-1 (APC) arasındaki tazminatkonusunda özellikle dikkatli olması gerekir. Ayrıca, örnekler hemen boyama sonrası çalıştırılmalıdır.
7. Facs dosyalarını sitometreden dışa aktarın ve bir analiz yazılımındaki(Malzeme Tablosu)verileri analiz edin.
   1. Analiz için, analiz yazılımı nın dosyasını açın. FSC-A ve SSC-A gating kullanarak hücre popülasyonu tanımlayın. DAPI negatif fraksiyonu (canlı hücreler) çizmeden önce sonraki kapılardaki singlet'leri tanımlayın. Canlı hücre kapısında, sırasıyla ΔDm ve kütleyi ölçmek için TMRM ve yeşil floresan leke kanalında bir kontur çizimi yapılır (Şekil 2A). Canlı hücre kapısında bu iki kanalın ortalama floresan yoğunluğunu (MFI) dışa aktarın.
   2. TMRM alçak kapısı, TMRM kanalındaki omuz popülasyonuna göre ayarlanır. TMRM tek renkli kontrol, kapıyı ayarlamak için bu omuz popülasyonu tanımlamak için kullanılabilir. TMRM alçak kapısındaki hücrelerin canlı oranını kontrol ve çizim için test numuneleri olarak dışa aktarın.

Sonuçlar

Şekil 1'de fare kemik iliğindeki hematopoetik kök hücrelerin izolasyonu ve eksvivo kültürleri için plakanın düzeni için gating stratejisini gösteriyoruz. Şekil 1A, SSC-A/FSC-A çizimindeki lenfosit fraksiyonunun tanımlanmasını gösterir. Doublets dapi sinyal yokluğu ile canlı hücrelerin belirlenmesi takip singlet kapıda kaldırıldı. Sca1⁺cKit⁺, soyu ile tanımlanan LKS popülasyonu tanımlanmıştır. B...

Tartışmalar

HSC fonksiyonunun sıkı bir düzenleme bir organizmanın ömrü boyunca istikrarlı hematopoiesis korumak için önemlidir. Vücuttaki diğer çeşitli hücre tipleri gibi, HSC fonksiyonunun düzenlenmesine katkıda bulunan önemli bir bileşen hücre metabolizmasitir. Bizim laboratuvar⁹ ve diğerleri²önceki^{çalışmalarda}mitokondri hscs ayrı bir metabolik devlet bakımında önemini ima var. İdris kemik iliği izole HSC'lerin son derece düşük sayıda nede...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
5 mL FACS tubes	Falcon	352235	Sample preparation
96-U bottom plate	Corning	3799	Cell culture
AutoMACS pro separator	Miltenyi Biotec		Automatic Cell separation
BD FACS AriaIII	Becton and Dickinson		Cell sorting
BD IMag mouse hematopoietic progenitor cell enrichment kit	BD	558451	Lineage depletion
BD LSRII	Becton and Dickinson		FACS acquisition machine
BD-DIVA	Becton and Dickinson		Acquisition software
CD150 PE	Biolegend	115904	Antibody staining mix
CD150 PE-Cy5	Biolegend	115912	Antibody staining mix
CD48 PB	Biolegend	103418	Antibody staining mix
Centrifuge- 5810R	Eppendorf		Centrifugation
Ckit PeCy7	Biolegend	105814	Antibody staining mix
Flow jo	FlowJo LLC		FACS Analysis software
GraphPad-Prism	GraphPad		Plotting data into graphs
Mitotracker Green	Invitrogen	M7514	Green-fluorescent mitocondrial stain to measure mitochondrial mass; working concentration = 100 nM; stock concentration = 1 mM
Nicotinamide Riboside (NR)	Custom synthesized in house		Metabolic modulator; working concentration = 500 µM; stock concentration = 50 mM
PBS	CHUV	1000324	Buffer preparation; working concentration = 1x; stock concentration = 1x
Pen-Strep (P/S)	Life technologies	15140122	Ex vivo culture; working concentration = 1x; stock concentration = 1x
RBC Lysis buffer	Biolegend	420301	Lysing Red blood cells; working concentration = 1x; stock concentration = 10x
Recombinant Mouse Flt-3 Ligand (FLT3)	RnD	427-FL-005/CF	Ex vivo culture; working concentration = 2 ng/mL; stock concentration = 10 µg/mL
Recombinant mouse stem cell factor (SCF)	RnD	455-MC-010/CF	Ex vivo culture; working concentration = 100 ng/mL; stock concentration = 50 µg/mL
Sca1 APC	Thermo Fisher Scientific	17-5981-82	Antibody staining mix
StemlineII Hematopoietic Stem Cell Expansion Medium	SIGMA	S0192	Ex vivo culture
Streptavidin Pac orange	Life Technologies	S32365	Antibody staining mix
Streptavidin Tx red	Life Technologies	S872	Antibody staining mix
TMRM	Invitrogen	T668	Staining mitochondrial membrane potential; working concentration = 200 nM; stock concentration = 10 mM
Ultra pure EDTA	Invitrogen	15575-038	Buffer preparation; working concentration = 0.5 M; stock concentration = 1 mM