유세포측정에 의한 조혈줄기세포 및 T세포의 미토콘드리아 질량 및 막 전위 측정

요약

여기서 우리는 생체배양조 조혈줄기세포 및 T세포에서 미토콘드리아 질량 및 막 전위를 측정하는 신뢰할 수 있는 방법을 설명한다.

초록

정지, 자기 재생 및 분화의 미세 한 균형은 조혈 줄기 세포를 보존하는 열쇠 (HSC) 풀과 모든 성숙한 혈액 세포의 평생 생산을 유지. 최근 몇 년 동안 세포 대사HSC 기능과 운명의 중요 한 레 귤 레이 트로 등장 했다. 우리는 이전에 미토콘드리아 대사의 변조가 HSC 운명에 영향을 미친다는 것을 입증했습니다. 특히, 전자 수송 사슬을 화학적으로 분리함으로써 우리는 일반적으로 급속한 분화를 유도하는 배양 조건에서 HSC 기능을 유지할 수 있었습니다. 그러나, HSC 수를 제한하는 것은 수시로 HSC 물질 대사를 측정하고 그러므로 그들의 기능을 예측하기 위하여 표준 측정법의 사용을 배제합니다. 여기에서, 우리는 HSC와 같은 희소한 세포에 있는 미토콘드리아 막 전위 그리고 미토콘드리아 질량의 믿을 수 있는 측정을 허용하는 간단한 교류 세포 분석분석서를 보고합니다. 우리는 마우스 골수에서 HSC의 격리 및 미토 콘 드리 아 질량 및 막 잠재적인 포스트 생체 배양의 측정을 논의. 예를 들어, 우리는 대사 변조기로 치료를 통해 HSC에서 이러한 매개 변수의 변조를 보여줍니다. 더욱이, 우리는 인간 말초 혈액 유래 T 세포 및 인간 종양침투 림프구 (TILs)에 이 방법의 응용 프로그램을 확장하여 미토콘드리아 프로필에 극적인 차이를 보이며 아마도 다른 T 세포를 반영합니다. 기능. 우리는 이 분석이 다른 문맥에 있는 각종 세포 모형에 있는 미토콘드리아 물질 대사의 변조기를 확인하기 위하여 검열에서 채택될 수 있다는 것을 믿습니다.

서문

조혈 줄기 세포 (HSCs)는 유기체의 일생 내내 혈액 생산 및 항상성을 지키는 골수에 거주하는 세포의 작은 인구입니다. HSCs는 세포 분열및 잘 조율된 분화 단계^1을통해 말단분화 된 성숙한 혈액 세포 혈통을 생성하는 선조를 초래함으로써 이러한 과정을 중재한다. 중요한 것은, HSC는 혐기성 glycolysis를 통해 그들의 에너지를 생성합니다. 대조적으로, 더 헌신적이고 적극적인 조혈 선조는 미토콘드리아 물질 대사를 향해 그들의 신진 대사를 전환^2,3,4. 이러한 뚜렷한 대사 상태는 활성 미토콘드리아에 의해 생성된 반응성 산소 종(ROS)에 의해 가해지는 세포 손상으로부터 HSC를 보호하는 것으로 여겨지며, 이에 따라 생체 내에서 장기간 의 기능^5,6,7,8을유지한다. HSC 대사 상태의 직접 측정은 그들의 제한된 수로 인해 도전적이고 종종 낮은 처리량입니다. 여기서, 우리는 HSCs에서 녹색 형광 미토콘드리아 스테인(Mitotracker Green)을 이용한 테트라메틸호다민 메틸 에스테르(TMRM) 형광 및 미토콘드리아 질량을 이용한 미토콘드리아 막 전위(ΔΘm)의 강력한 측정을 위한 유세포분석기반 분석기를 기술한다. 우리는 이전에 낮은 ΔΔm이 고도로 정제 된 HSCs^9및 ΔΘm을 낮출 수있는 대사 변조기의 보나 - 선의 기능 마커가 HSC 기능^9,10을향상시키는 것을 입증했습니다. 여기에서 우리는 HSC의 장기 혈액 재구성 잠재력을 향상할 수 있는 새로운 분자를 확인하기 위한 전략으로 HSCs 미토콘드리아 프로파일링에 대한 우리의 방법을 제안합니다.

일례로, 우리는 이 분석이 비타민 B3 아날로그 니코틴아미드 리보사이드(NR)에 노출될 때 HSC ΔΘm의 하강을 안정적으로 측정한다는 것을 입증한다. 따라서, 최근 발표된 연구에서 NR은 조혈줄기 및 전구 기능을 직접 개선하여 마우스 및 인간화된 마우스 시스템 모두에서 혈액 회복 후 이식을 강력하게 개량한다는 것을 입증한다^10. 이러한 대사 조절제의 용량은 이식 후 환자에서 25%의 사망률이 혈액 및 면역 회복의 지연과 관련이 있다는 점을 고려할 때 임상적 가치가^{크다(11,12).}

더욱이, 우리는 이 방법론이 인간 T 세포의 신진 대사 단면도 및 기능의 특성화를 위해 적용될 수 있다는 증거를 제공합니다. 최근 몇 년 동안, 자가 종양 침윤 림프구 (TILs)를 이용한 입양 세포 치료 (ACT)의 개발은 매우 불리한 예후를 가진 특정 유형의 고급 암에 가장 효과적인 접근법이되었습니다 (예를 들어, 전이성 흑색종, 환자의 >50 %가 치료에 반응하고 환자의 최대 24 %가 완전한 회귀를 가지고^{있습니다).} 그러나, 충분한 항종양 활성을 수용하는 TILs는^14를생성하기 어렵다. EX 생체 확장 동안 TIL이 겪는 광범위한 증식 및 자극은 T 세포 항종양 반응을 극적으로 손상시키는 T 세포 고갈 및 노화를 야기한다^15. 중요한 것은, TILs의 항종양 용량은 그들의 신진대사에 밀접하게 연결되어^{있으며, 17및} PI3K/Akt 통로의 억제를 통해 신진대사를 조절하기 위한 접근법은 고무적인 결과를^18,19로생성했다. 이러한 이유로, 우리는 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC) 및 환자 유래 TiLs에서 파생 된 T 세포의 ΔΘm을 비교하고, 덜 분화 된 PBMC 유래 T 세포가 말기 분화 된 TiLs에 비해 더 낮은 ΔΔ및 미토콘드리아 질량을 가지고 있음을 보여줍니다.

우리는 이 분석이 ΔΘm의 변조를 통해 HSC와 T 세포 기능을 향상시키는 새로운 대사 조절기를 식별하는 데 사용될 수 있다는 것을 구상합니다.

프로토콜

원고에 기재된 모든 실험은 우리 기관의 지침을 따르며 동물 실험에 대한 스위스 법(승인: VD3194) 및 인간 시료와 관련된 연구에 따라 수행되었다(프로토콜: 235/14; CER-VD 2017-00490)

1. 조혈 줄기 세포 추출

1. 야생 형 C57BL6/J 마우스를 구입하고 운송 관련 스트레스를 줄이기 위해 적어도 일주일 동안 동물의 집에 보관하십시오.
2. 실험 당일,_CO2 질식을 사용하여 마우스를 안락사시한다.
3. 모피를 살균하고 뒷다리에서 대퇴골과 경골 뼈를 잘라 해부 가위와 집게와 같은 표준 수술 도구를 사용하여 뱃속에서 마우스를 잘라 70 % 에탄올로 마우스를 스프레이.
4. 부드러운 종이 타월을 사용하여 대퇴골, 경골 및 골반에 부착 된 근육을 제거하고 얼음에 1 mMEDA (완충제)가있는 PBS가 들어있는 50 mL 튜브에 깨끗한 뼈를 놓습니다.
5. 박격포와 유봉에 70 % 에탄올을 뿌리고 세포 배양 후드에 놓습니다. 자외선으로 30분 동안 살균하십시오.
6. 박격포에 약간의 완충액 (~ 10 mL)으로 깨끗한 뼈를 넣고 부드럽게 현탁액에서 골수를 얻기 위해 그들을 분쇄. 이제, 세포 현탁액을 수집하고 단일 세포 현탁액을 얻기 위해 50 mL 튜브로 70 μm 세포 스트레이너를 통과시다.
7. 모든 골수가 추출되고 뼈 파편이 하얗게 변할 때까지 1.6 단계를 반복합니다.
8. 골수 단세포 현탁액을 포함하는 50 mL 튜브(들)를 원심분리기에 놓는다. 300 x g에서 4 °C에서 10 분 동안 원심 분리기를 실행하여 세포를 펠렛합니다.
9. 한편, 오토클레이브 증류수에서 10 mL의 RBC 용해 버퍼를 준비합니다. 0.22 μm 필터를 통해 용액을 필터링합니다.
10. 원심분리기에서 샘플 튜브를 수집하고 상급체를 제거합니다. 1x RBC 리시스버퍼(재료 표)를세포 펠릿상에 피펫합니다. 펠릿을 빼내고 몇 번 위아래로 파이펫팅하여 균일한 용액을 준비합니다. RBC 용해가 발생할 수 있도록 튜브가 실온에서 1-2 분 동안 되도록 하십시오. 버퍼로 튜브를 채우면 용해 과정을 중지합니다.
11. 튜브를 원심분리기에 놓고 4°C에서 5분 동안 300 x g으로 돌입니다. 원심 분리기에서 튜브를 수집하고 상급을 장식합니다. 10 mL의 버퍼를 추가하여 펠릿을 다시 중단하고 RBC 용해로 인한 이물질을 제거하기 위해 70 μm 셀 스트레이너를 통해 새로운 50 mL 튜브에 용액을 필터링합니다.
12. 4 °C에서 5 분 동안 300 x g에서 튜브를 원심 분리합니다. 원심 분리기에서 튜브를 수집하고 상급을 장식합니다. 500 μL의 버퍼로 펠릿을 다시 일시 중단합니다.
13. 100 μL aliquot를 제거하고 별도의 1.5 mL 튜브에 보관하십시오. 50 μL의 비오틴 계보 고갈 항체 칵테일을 전구 농축키트(재료 표)에서나머지 450 μL의 세포 현탁액에 추가합니다. 15 분 동안 셰이커에 4 °C에서 배양.
14. 버퍼 15 mL를 추가하고 4 °C에서 5 분 동안 300 x g의 튜브를 원심 분리합니다. 원심 분리기에서 튜브를 수집하고 상급을 장식합니다. 460 μL의 버퍼로 펠릿을 다시 일시 중단합니다. 10 μL aliquot를 제거하고 별도의 1.5 mL 튜브에 보관하십시오.
15. 선조 농축 키트(재료 표)에서스트렙타비딘 자기 비드 50 μL을 나머지 450 μL 세포 현탁액에 추가하십시오. 15 분 동안 셰이커에 4 °C에서 배양.
16. 버퍼 15 mL를 추가하고 4 °C에서 5 분 동안 300 x g의 튜브를 원심 분리합니다. 원심 분리기에서 튜브를 수집하고 상급을 장식합니다. 5 mL의 버퍼로 펠릿을 다시 일시 중단하고 용액을 15 mL 튜브로 옮김.
17. 튜브를 자동 셀 분리기(재료표)로가져가십시오. 세척 프로그램을 실행하여 셀 분리기의 튜브를 헹구고 프라이밍합니다. 샘플과 두 개의 수집 튜브를 튜브 홀더에 놓습니다. "고갈"프로그램을 사용하여 분리를 수행합니다. 실행이 종료되면 자동화된 셀 구분 기호에서 양수 및 음수 분수를 수집합니다.
    참고: 자동 셀 분리기의 부재에서 사용자는 사용자 매뉴얼에 따라 수동 자기 열과 해당 자석을 사용할 수 있습니다. 사용자는 수동 분리 프로세스가 자동화된 분리 프로세스보다 느리다는 것을 명심해야 합니다. 또한 수동 열이 막히는 경향이 있습니다. 따라서 사용자는 샘플을 희석하고 컬럼에 천천히 로드하는 것이 좋습니다.
18. 양수 분수를 삭제합니다. 음의 분획 튜브를 버퍼로 채웁니다. 4 °C에서 5 분 동안 300 x g에서 튜브를 원심 분리합니다.
19. 한편, 최종 부피 용액의 1 mL에서 항체 혼합을 준비하고 최종 부피 용액의 200 μL에서 단일 색상 제어를 재료 표 1에기재한다.
    참고: TMRM과 녹색 형광 미토콘드리아 얼룩이 줄기 세포 마커 염색과 결합될 경우 CD150-PE를 CD150-PEcy5 및 스트렙타비딘-Tx 레드와 스트렙타비딘-팩 오렌지로 대체합니다.
20. 원심분리기에서 샘플 튜브를 수집하고 상급체를 제거합니다. 항체 혼합물 1 mL에서 펠릿을 다시 중단하십시오. 각 단일 색상 제어 튜브(계보 제외)에 10 μL의 셀(단계 1.13에서)을 추가합니다. 리니지 단일 컬러 튜브에 10 μL의 셀(단계 1.14에서)을 추가합니다.
21. 시료와 단색 제어 튜브를 셰이커에서 4°C에서 45분 동안 배양합니다.
22. 모든 튜브를 버퍼와 원심분리기로 300 x g에서 4°C에서 5분 동안 채웁니다. 상급을 폐기하고 버퍼의 200 μL에서 버퍼 및 단일 색상 컨트롤의 1 mL에서 샘플을 다시 일시 중단합니다.
23. 샘플 및 단일 색상 컨트롤을 5 mL 필터 상단 FACS 튜브로 전송합니다.
24. 튜브를 선별 기계로 가져가 서 줄기 세포 확장 배지의 400 μL을 포함하는 1.5 mL 튜브에서 HSC 인구 (그림 1A의게이팅 전략)를 분류합니다.

2. 조혈 줄기 세포의 전 생체 배양

1. 정렬된 셀이 포함된 튜브를 수집합니다(셀 추출의 경우 섹션 1 참조). 4 °C에서 5 분 동안 300 x g에서 튜브를 원심 분리합니다. 펠릿을 제거하지 않고 상한체의 대부분을 부드럽게 제거하고 세포 펠릿 위에 50-80 μL을 둡니다. 이렇게 하면 셀 손실이 최소화됩니다.
2. 테스트할 조건의 수에 의존하는 최종 부피로 줄기 세포 팽창 배지에서 세포 펠릿을 재중단합니다(배양 조건당 100 μL에 대한 카운트).
3. 줄기세포 확장배지, 줄기세포인자(200ng/mL), FLT3 리간드(4ng/mL) 및 펜-스트렙 항생제(1%)를 함유하는 2배 배양배지를 준비한다. (2배 기저 배지; 재료 표)를 참조하십시오.
4. 멸균 조직 배양처리된 96 U-bottom 웰플레이트(표 의 재료)를취하고 세포가 배양될 웰을 식별한다(도 1B의플레이트 디자인).
   참고: 사용자는 증발에 더 취약하기 때문에 한계 우물을 피하는 것이 좋습니다.
5. 이 우물에서 2.3단계에서 이전에 제조된 2x 기저 배지의 100 μL을 넣습니다. 100x NR 용액(재료 표)의2 μL을 잘 추가 표시된 NR. 24시간마다 NR을 보충하십시오.
   참고: 보충은 NR에만 해당됩니다. 다른 대사 변조기 는 보충을 필요로 할 수도 있거나 필요하지 않을 수도 있습니다.
6. 종자 100 μL의 세포는 2x 기저 배지를 함유하는 웰 위에 단계 2.2에서 제조하였다. 본 실험에서 웰당 종자된 HSC의 수는 800-1,000개의 세포 사이였다.
7. 기저 배지 2개가 들어 있는 5개의 추가 우물을 준비합니다. 이들 각각에서 100,000개의 전체 골수 세포(단계 1.13로부터)를 100 μL의 줄기세포 팽창 배지에 재중단하여 배양 후 유동 세포 분석분석의 염색 대조군으로 사용한다.
   참고: 사용자가 포스트 배양 분석을 위한 줄기 세포 마커 및 미토콘드리아 마커를 결합하려는 경우 전구 집단(Ckit+ 세포 또는 LKSCD150-세포)을 추가로 정렬하는 것이 좋습니다. 종자 이러한 정렬된 선조는 포스트 배양 유세포 분석용 스테인링 제어 웰에서. 단일 얼룩 색상당 1개의 웰을 준비합니다.
8. 200 μL의 오토클레이브 수를 모든 주변 우물에 넣어 세포를 포함하는 우물에서 증발을 줄입니다. 배양 기간(72h)의 기간 동안 플레이트를 37°C 및 5%_CO2에서 인큐베이터에 방해받지 않고 방치한다. 플레이트를 제거하여 24시간마다 NR을 보충하고 인큐베이터에 다시 놓습니다.

3. 미토콘드리아 질량 및 멤브레인 전위 측정

1. 배양 기간이 끝나면 줄기 세포 확장배지(표)에서TMRM(20 μM) 및 미토트래커 그린(10 μM)(녹색 형광 얼룩)의 100x 용액을 준비한다.
2. 각 테스트 웰에 100x TMRM 용액 2 μL과 100x 녹색 형광 얼룩 용액 2 μL을 추가합니다. TMRM 컨트롤에 100x TMRM 의 2 μL을 잘 추가합니다. 미토트래커 컨트롤에 100x 녹색 형광 얼룩 2 μL을 추가합니다. 플레이트를 37°C및 5%_CO2에서 45분 동안 인큐베이터에 다시 놓습니다.
   참고: ABC 펌프 매개 염료 유출을 테스트해야 하는 경우 Verapamil(ABC 펌프 억제제)을 사용하여 추가적인 제어를 준비할 수 있습니다. 이를 위해 TMRM 및 녹색 형광 얼룩에 대한 염색 전에 테스트 웰 1 시간 중 하나에 50 μM Verapamil을 추가하십시오.
3. 인큐베이터에서 플레이트를 제거하고 300 x g에서 5 분 동안 원심 분리하십시오. 표준 FACS 버퍼(PBS-1 mM EDTA-P/S-2% FBS)를 200 μL 추가하고 플레이트를 300 x g에서 5분 동안 원심분리합니다. 이 세탁 단계를 3x 반복합니다. 사용자는 직접 적인 빛에 최소한의 노출을 제공하기 위해 플레이트가 항상 호일로 덮여 있는지 확인해야합니다.
   참고: 사용자가 줄기 세포 염색과 미토콘드리아 염색을 결합해야하는 경우, 샘플은 모든 줄기 세포 마커의 항체 혼합으로 배양되어야하며 단색 컨트롤은 30-45 분 동안 4 °C에서 개별 항체로 별도로 염색해야합니다.
   참고: 모든 단계에서 사용자는 알루미늄 호일로 덮인 판을 유지해야합니다. 사용자는 이 추가 염색 단계 및 후속 세척 단계는 추가 세포 손실을 초래할 수 있다는 점에 유의해야 합니다.
4. FACS 버퍼의 200 μL에서 세포를 다시 중단하고 FACS 튜브로 옮김.
5. 유량 세포계에서 샘플을 실행합니다(그림 1참조). WBM을 포함하는 단 하나 색깔 관은 다음을 포함한다: (1) 얼룩이 없는; (2) DAPI; (3) TMRM (PE); (4) 녹색 형광 얼룩 (FITC); (5) 전체 얼룩 (PE 및 FITC).
6. 먼저 단일 색상 컨트롤을 획득하여 컴퓨터를 설정합니다. 컴퓨터에서 실행 중인 소프트웨어를 사용하여 보정을 계산합니다. 보정이 적용되면 HSC 샘플을 획득하고 가능한 한 많은 이벤트를 기록합니다.
   참고: 줄기 세포와 미토콘드리아 마커가 결합되는 경우, 사용자는 TMRM (PE), CD150 (PE-Cy5) 및 Sca-1 (APC) 사이의 보상에 특히 주의해야합니다. 또한, 샘플은 즉시 얼룩 후 실행되어야한다.
7. 세포계에서 FACS 파일을 내보내고 분석소프트웨어(재료 표)에서데이터를 분석합니다.
   1. 분석을 위해 분석 소프트웨어에서 파일을 엽니다. FSC-A 및 SSC-A 게이팅을 사용하여 세포 집단을 식별합니다. DAPI 음수 분수(라이브 셀)를 플로팅하기 전에 다음 게이트에서 싱글을 식별합니다. 라이브 셀 게이트에서 TMRM 및 녹색 형광 얼룩 채널에서 윤곽 플롯을 만들어 ΔΘm 및 질량을 각각 측정한다(도2A). 라이브 셀 게이트에서 이들 두 채널의 평균 형광 강도(MFI)를 내보냅니다.
   2. TMRM 로우 게이트는 TMRM 채널의 어깨 모집단에 기초하여 설정됩니다. TMRM 단색 컨트롤은 게이트를 설정하기 위해 이 어깨 모집단을 식별하는 데 사용할 수 있습니다. TMRM 로우 게이트에서 셀의 수분 비율을 제어및 플롯에 대한 테스트 샘플로 내보냅니다.

결과

도 1에서 우리는 마우스 골수로부터 조혈 줄기 세포의 분리를 위한 게이팅 전략과 그들의 생체 배양에 대한 플레이트의 레이아웃을 보여준다. 도 1A는 SSC-A/FSC-A 플롯에서 림프구 분획의 식별을 나타낸다. 더블ts는 DAPI 신호의 부재에 의해 살아있는 세포의 식별에 이어 단일 게이트에서 제거되었다. 계보-Sca1⁺cKit^+로정의된 LKS ?...

토론

HSC 기능의 엄격한 조절은 유기체의 일생 동안 안정적인 조혈을 유지하는 것이 중요합니다. 본문에 다양 한 다른 세포 유형 처럼, HSC 기능의 조절에 기여 하는 주요 구성 요소는 세포 대사. 우리의 실험실에서 이전 연구⁹ 그리고 다른^{사람 2,3} HSC에서 뚜렷한 대사 상태를 유지에 미토 콘 드리 아의 중요성을 연루 했다. murine 골수에서 분리 ...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
5 mL FACS tubes	Falcon	352235	Sample preparation
96-U bottom plate	Corning	3799	Cell culture
AutoMACS pro separator	Miltenyi Biotec		Automatic Cell separation
BD FACS AriaIII	Becton and Dickinson		Cell sorting
BD IMag mouse hematopoietic progenitor cell enrichment kit	BD	558451	Lineage depletion
BD LSRII	Becton and Dickinson		FACS acquisition machine
BD-DIVA	Becton and Dickinson		Acquisition software
CD150 PE	Biolegend	115904	Antibody staining mix
CD150 PE-Cy5	Biolegend	115912	Antibody staining mix
CD48 PB	Biolegend	103418	Antibody staining mix
Centrifuge- 5810R	Eppendorf		Centrifugation
Ckit PeCy7	Biolegend	105814	Antibody staining mix
Flow jo	FlowJo LLC		FACS Analysis software
GraphPad-Prism	GraphPad		Plotting data into graphs
Mitotracker Green	Invitrogen	M7514	Green-fluorescent mitocondrial stain to measure mitochondrial mass; working concentration = 100 nM; stock concentration = 1 mM
Nicotinamide Riboside (NR)	Custom synthesized in house		Metabolic modulator; working concentration = 500 µM; stock concentration = 50 mM
PBS	CHUV	1000324	Buffer preparation; working concentration = 1x; stock concentration = 1x
Pen-Strep (P/S)	Life technologies	15140122	Ex vivo culture; working concentration = 1x; stock concentration = 1x
RBC Lysis buffer	Biolegend	420301	Lysing Red blood cells; working concentration = 1x; stock concentration = 10x
Recombinant Mouse Flt-3 Ligand (FLT3)	RnD	427-FL-005/CF	Ex vivo culture; working concentration = 2 ng/mL; stock concentration = 10 µg/mL
Recombinant mouse stem cell factor (SCF)	RnD	455-MC-010/CF	Ex vivo culture; working concentration = 100 ng/mL; stock concentration = 50 µg/mL
Sca1 APC	Thermo Fisher Scientific	17-5981-82	Antibody staining mix
StemlineII Hematopoietic Stem Cell Expansion Medium	SIGMA	S0192	Ex vivo culture
Streptavidin Pac orange	Life Technologies	S32365	Antibody staining mix
Streptavidin Tx red	Life Technologies	S872	Antibody staining mix
TMRM	Invitrogen	T668	Staining mitochondrial membrane potential; working concentration = 200 nM; stock concentration = 10 mM
Ultra pure EDTA	Invitrogen	15575-038	Buffer preparation; working concentration = 0.5 M; stock concentration = 1 mM