流细胞测定方法测量造血干细胞和T细胞的线粒体质量及膜电位

摘要

在这里，我们描述了一种可靠的方法来测量线粒体质量和膜电位在体外培养造血干细胞和T细胞。

摘要

保持静止、自我更新和分化的精细平衡是保存造血干细胞（HSC）池和维持所有成熟血细胞的终身生产的关键。近年来，细胞代谢已成为HSC功能和命运的重要调节器。我们之前已经证明，线粒体代谢的调制会影响HSC的命运。具体来说，通过化学分离电子传输链，我们能够在通常诱导快速分化的培养条件下保持HSC功能。然而，限制HSC数通常阻止使用标准测定来测量HSC代谢，从而预测其功能。在这里，我们报告一个简单的流式细胞测定，允许可靠地测量在稀缺细胞（如HSC）中的线粒体膜电位和线粒体质量。我们讨论了从小鼠骨髓中分离HSC和线粒体质量的测量和膜电位在体外培养。例如，我们通过代谢调制器治疗，在HSC中显示了这些参数的调制。此外，我们扩展了这种方法在人类外周血源T细胞和人类肿瘤渗透淋巴细胞（TLL）中的应用，显示其线粒体特征的显著差异，可能反映不同的T细胞功能。我们相信，这种测定可用于筛选，以识别不同环境中不同细胞类型的线粒体代谢的调节剂。

引言

造血干细胞 （HSCs） 是存在于骨髓中的少量细胞，可确保在生物体的整个生命周期内产生血液和平衡。HSC通过产生后代来调解这个过程，这些后代又通过几轮细胞分裂和精心编排的分化步骤¹产生最终分化的成熟血细胞谱系。重要的是，HSC通过厌氧糖解产生能量。相反，更坚定和活跃的造血原体将新陈代谢转向线粒体代谢^2，3，4。这种独特的代谢状态被认为可以保护HSC免受活性线粒体产生的活性氧物种（ROS）造成的细胞损伤，从而保持其长期体内功能^{5、6、7、8。}直接测量 HSC 代谢状态具有挑战性，并且由于数量有限，通常吞吐量较低。在这里，我们描述了一种基于流式细胞学的测定，用于使用四甲基二甲胺甲基酯（TMRM）荧光和线粒体质量在HSC中使用绿色荧光线粒体染色（Mitotracker Green）对线粒体膜电位（μm）进行可靠测量。我们之前已经证明，低μm是高度纯化的HSCs⁹和代谢调制器的一个真正的功能标记，能够降低μm增强HSCs功能^9，10。在这里，我们建议使用我们的方法在HSC线粒体分析作为策略，以确定能够提高HSC的长期血液重组潜力的新分子。

例如，我们证明，这种测定在接触维生素B3模拟烟酰胺（NR）时，能可靠地测量HSCμm的降低。因此，在我们最近发表的研究中，我们证明NR通过直接改善造血干细胞和祖细胞功能^10，大力改善小鼠和人化小鼠系统的血液恢复后。考虑到25%的死亡率与移植^{后患者血液}延迟和免疫恢复有关，这种代谢调节器的能力具有很大的临床^价值。

此外，我们提供了证据，这种方法可用于表征人类T细胞的代谢特征和功能。近年来，采用自体肿瘤渗透淋巴细胞（TILs）的采用细胞疗法（ACT）的发展已成为某些类型的晚期癌症最有效的方法，其预后极不利（例如，转移性黑色素瘤，其中>50%的患者对治疗有反应，高达24%的患者有完全的回归^）13。然而，具有足够抗肿瘤活性的TILs很难产生^14。TILs在体外扩张期间经历的广泛增殖和刺激导致T细胞耗尽和衰老，从而显著削弱T细胞抗肿瘤反应^15。重要的是，TL的抗肿瘤能力与其代谢^16、17和旨在通过抑制PI3K/Akt途径调节新陈代谢的方法紧密相连，产生了令人鼓舞的结果^18、19。因此，我们比较了从外周血单核细胞（PBMC）和患者衍生的TLS中提取的T细胞的μm，并表明与最终分化的TL相比，分化较少的PBMC衍生T细胞具有较低的μμm和线粒体质量。

我们设想，这种测定可用于识别新的代谢调节剂，通过βm的调制改善HSC和T细胞功能。

研究方案

手稿中描述的所有实验均遵循我们机构的指导方针，并按照瑞士动物实验法（授权:VD3194）和涉及人类样本的研究（协议:235/14;CER-VD 2017-00490）

1. 造血干细胞提取

1. 购买野生型C57BL6/J小鼠，并将其保存在动物之家至少一周，以减少运输相关的压力。
2. 在实验当天，使用_CO2窒息对小鼠实施安乐死。
3. 用70%乙醇喷洒小鼠，对毛皮进行消毒，并使用标准手术工具（如解剖剪刀和钳子）切开小鼠腹部，从后腿切下股骨和骨骼。
4. 使用软纸巾去除附着在股骨、骨质和骨盆上的肌肉，并将清洁的骨头放入含有 PBS 的 50 mL 管中，带 1 mM EDTA（缓冲器）放在冰上。
5. 用70%乙醇喷洒砂浆和虫子，并将其放入细胞培养罩中。用紫外线消毒30分钟。绝育后用缓冲液冲洗砂浆和虫子，去除乙醇的痕迹。
6. 将带有一些缓冲液（±10 mL）的干净骨骼放入砂浆中，轻轻粉碎，使骨髓悬浮出来。现在，收集细胞悬浮液，并通过70μm细胞过滤器进入50 mL管，以获得单个细胞悬浮液。
7. 重复步骤1.6，直到提取所有骨髓，骨屑变白。
8. 将含有骨髓单细胞悬浮液的50 mL管置于离心机上。在 300 x g下运行离心机 10 分钟，在 4°C 下对细胞进行颗粒。
9. 同时，在高压蒸馏水中制备10 mL的1x RBC莱沙缓冲液。通过 0.22 μm 过滤器过滤溶液。
10. 从离心机收集样品管，并去上清液。在细胞颗粒上移液1xRBC莱沙缓冲液（材料表）。清除颗粒，并准备均匀溶液，上下移液几次。让管子在室温下1⁄2分钟，以便发生RBC分发。用缓冲液填充管子，停止莱沙过程。
11. 将管子放在离心机上，在 300 x g下旋转 5 分钟，温度为 4°C。从离心机收集管子，并去上清液。通过加入 10 mL 的缓冲液来重新悬浮颗粒，并通过 70 μm 细胞过滤器将溶液过滤到新的 50 mL 管中，以清除由于 RBC 解液引起的碎屑。
12. 在 4°C 下将管在 300 x g下离心 5 分钟。从离心机收集管子，并去上清液。将颗粒重新悬浮在 500 μL 的缓冲液中。
13. 取出 100 μL 等分，并保存在单独的 1.5 mL 管中。从祖料浓缩试剂盒（材料表）加入50μL的生物素系耗性抗体鸡尾酒，以剩余的450μL细胞悬浮液。在4°C下在摇床上孵育15分钟。
14. 加入15 mL缓冲液，在300 x g下将管离心5分钟，在4°C下。从离心机收集管子，并去上清液。在460 μL的缓冲液中重新悬浮颗粒。取出 10 μL 等分，并保存在单独的 1.5 mL 管中。
15. 从祖原浓缩试剂盒（材料表）加入50μL的链球蛋白磁珠，加入剩余的450μL细胞悬浮液中。在4°C下在摇床上孵育15分钟。
16. 加入15 mL缓冲液，在300 x g下将管离心5分钟，在4°C下。从离心机收集管子，并去上清液。将颗粒重新悬浮在5 mL的缓冲液中，并将溶液转移到15 mL管中。
17. 将管子带到自动细胞分离器（材料表）。运行洗涤程序，冲洗和给细胞分离器的管子注脚。将样品和两个收集管放在管架上。使用"耗尽"程序执行分离。运行结束后，从自动单元格分离器收集正数和负分数。
    注:在没有自动电池分离器的情况下，用户可以根据用户手册使用手动磁柱和相应的磁体。用户应记住，手动分离过程比自动分离过程慢。此外，手动列更容易堵塞。因此，建议用户稀释样品并缓慢加载到柱上。
18. 放弃正分数。用缓冲液填充负分数管。在 4°C 下将管在 300 x g下离心 5 分钟。
19. 同时，在1mL的最终体积溶液中制备抗体混合物，在200μL的最终体积溶液中制备抗体混合物，如材料表和表1所述。
    注:如果TMRM和绿色荧光线粒体染色与干细胞标记染色相结合，则用CD150-Pecy5和链球菌-Tx红色与链球菌-Pac橙替换CD150-PE。
20. 从离心机收集样品管，并去上清液。在1 mL的抗体混合物中重新悬浮颗粒。在每个单色控制管中添加 10 μL 的细胞（从步骤 1.13 开始）（系系除外）。在血统单色管中加入10μL的细胞（从步骤1.14开始）。
21. 在摇床上4°C下孵育样品和单色控制管45分钟，用盖子或铝箔盖住冰桶。
22. 在 4°C 下以 300 x g的速度填充所有管材和离心机 5 分钟。丢弃上清液，在 200 μL 的缓冲液中重新悬浮在 1 mL 的缓冲液和单色对照中。
23. 将样品和单色控件转移到 5 mL 滤镜顶部 FACS 管。
24. 将管子带到分拣机，在含有400μL干细胞扩张介质的1.5 mL管中对HSC总体（图1A中的门控策略）进行分类。

2. 造血干细胞的外维培养

1. 收集包含已分拣细胞的管（参见第 1 节，了解细胞提取）。在 4°C 下在 300 x g下离心管 5 分钟。轻轻去除大部分上清液，不去除颗粒，并将50~80 μL留在细胞颗粒顶部。这最大限度地减少了细胞损失。
2. 根据要测试的条件数（每个孔/培养条件为 100 μL），将干细胞扩张培养基中的细胞颗粒重新悬浮到最终体积。
3. 制备含有干细胞扩张培养基、干细胞因子（200纳克/千升）、FLT3配体（4纳克/mL）和笔链球菌抗生素（1%）的2倍培养基（2x 基底介质;材料表）。
4. 以无菌组织培养处理96U-底部井板（材料表）和确定将培养细胞的孔（图1B中的板设计）。
   注:建议用户避免使用边际井，因为他们更容易蒸发。
5. 将步骤 2.3 中先前制备的 2x 基底介质的 100 μL 置于这些井中。在标有N的NR中，添加2μL的100倍NR溶液（材料表）。每 24 小时补充 NR。
   注:补充特定于 NR。其他代谢调节器可能或可能不需要补充。
6. 在步骤 2.2 中制备的细胞种子 100 μL，在含有 2x 基底培养基的井顶部。在这个实验中，每口井播种的HSC数量在800-1，000个细胞之间。
7. 准备五口额外的井，包含2x基底介质。在每个添加100，000整个骨髓细胞（从步骤1.13）重新悬浮在100μL的干细胞扩张介质，作为染色控制后培养流细胞测定分析。
   注:如果用户希望将干细胞标记和线粒体标记组合用于培养后分析，建议对祖体群体（Ckit® 细胞或 LKSCD150-细胞）进行额外排序。在染色控制井中播种这些分类的祖子，用于培养流细胞测定分析。每一个单色颜色准备一个井。
8. 将200 μL的高压灭水放入周围所有井中，以减少含有细胞的油井的蒸发。在培养期（72小时）期间，在培养期（72小时）期间，在培养箱中保持37°C和5%CO₂的培养层不受干扰。取下板，每 24 小时补充 NR，并将其放回培养箱中。

3. 线粒体质量和膜电位的测量

1. 在培养期结束时，在干细胞扩张培养基（材料表）中制备100倍TMRM（20μM）和Mitotracker绿色（10μM）（绿色荧光染色）的溶液。
2. 在每个测试井中加入 2 μL 的 100x TMRM 溶液和 2 μL 的 100x 绿色荧光染色溶液。在 TMRM 控制井中添加 2 μL 的 100x TMRM。在 Mitotracker 控制井中加入 2 μL 的 100x 绿色荧光染色。将板放回 37°C 和 5% CO₂的培养箱中 45 分钟，用铝箔盖住板的顶部。
   注:如果需要测试 ABC 泵介导染料 exlux，则可以准备使用 Verapamil（ABC 泵抑制剂）的附加控制。为此，在测试井中加入 50 μM Verapamil，在染色 TMRM 和绿色荧光染色之前 1 小时。
3. 从培养箱中取出板，以 300 x g将其离心 5 分钟，反转板以去除上清液。加入200 μL的标准FACS缓冲液（PBS-1 mM EDTA-P/S-2%FBS），在300 x g下离心5分钟，去除上清液。重复此洗涤步骤 3 倍。用户必须确保板始终覆盖铝箔，以提供最小的接触直光。
   注:如果用户需要将线粒体染色与干细胞染色相结合，则样品需要与所有干细胞标记的抗体混合进行孵育，单色对照组需要在4°C下分别与单个抗体染色30-45分钟。
   注:在所有步骤中，用户必须保持板盖铝箔。用户必须注意，这个额外的染色步骤和随后的洗涤步骤可能会导致额外的细胞损失。
4. 在200 μL的FACS缓冲液中重新悬浮细胞，并转移到FACS管中。
5. 在流式细胞仪上运行样本（参见图1）。含有WBM的单色管包括:（1）未染色;（2） DAPI;（3） TMRM （PE）;（4）绿色荧光染色（FITC）;（5） 完全染色（PE 和 FITC）。
6. 首先获取单色控件来设置机器。使用机器上的运行软件计算补偿。应用补偿后，获取 HSC 样本并记录尽可能多的事件。
   注:如果将干细胞和线粒体标记组合在一起，用户需要特别注意 TMRM （PE）、CD150 （PE-Cy5） 和 Sca-1 （APC） 之间的补偿。此外，样品应在染色后立即运行。
7. 从细胞仪导出FACS文件，并分析分析软件（材料表）上的数据。
   1. 对于分析，打开分析软件上的文件。使用 FSC-A 和 SSC-A 门控识别细胞总体。在绘制 DAPI 负分数（活细胞）之前，识别下一个门中的单点。在活细胞门中，在TMRM和绿色荧光染色通道中分别绘制一个轮廓图，以测量μm和质量（图2A）。在活细胞门中导出这两个通道的平均荧光强度 （MFI）。
   2. TMRM 低门基于 TMRM 通道中的肩部总体设置。TMRM 单色控制可用于识别此肩部填充以设置门。在控件和测试样本中导出 TMRM 低门中细胞的活值比例以进行绘图。

结果

在图1中，我们显示了从小鼠骨髓中分离造血干细胞的浇注策略及其体外培养板的布局。图 1A显示了 SSC-A/FSC-A 图中淋巴细胞分数的标识。在单门中取出双子细胞，然后由于没有DAPI信号，识别了活细胞。LKS种群，由血统-Sca1^+cKit+定义，被识别。已知该种群含有干细胞和祖细胞。HSCs在LKS种群中形成大约5-10%的细胞，并通过CD150+ C...

讨论

严格调节HSC功能对于维持生物体寿命期间稳定的造体非常重要。与体内其他各种细胞类型一样，促进HSC功能调节的一个关键成分是细胞代谢。我们实验室⁹和其他^2，3的研究已经暗示了线粒体在HSCs中维持一种独特的代谢状态的重要性。 由于从鼠骨髓中分离出的HSCs数量极少，很难通过标准代谢检测（例如，用SeaHorse消耗氧气）来分析它们...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
5 mL FACS tubes	Falcon	352235	Sample preparation
96-U bottom plate	Corning	3799	Cell culture
AutoMACS pro separator	Miltenyi Biotec		Automatic Cell separation
BD FACS AriaIII	Becton and Dickinson		Cell sorting
BD IMag mouse hematopoietic progenitor cell enrichment kit	BD	558451	Lineage depletion
BD LSRII	Becton and Dickinson		FACS acquisition machine
BD-DIVA	Becton and Dickinson		Acquisition software
CD150 PE	Biolegend	115904	Antibody staining mix
CD150 PE-Cy5	Biolegend	115912	Antibody staining mix
CD48 PB	Biolegend	103418	Antibody staining mix
Centrifuge- 5810R	Eppendorf		Centrifugation
Ckit PeCy7	Biolegend	105814	Antibody staining mix
Flow jo	FlowJo LLC		FACS Analysis software
GraphPad-Prism	GraphPad		Plotting data into graphs
Mitotracker Green	Invitrogen	M7514	Green-fluorescent mitocondrial stain to measure mitochondrial mass; working concentration = 100 nM; stock concentration = 1 mM
Nicotinamide Riboside (NR)	Custom synthesized in house		Metabolic modulator; working concentration = 500 µM; stock concentration = 50 mM
PBS	CHUV	1000324	Buffer preparation; working concentration = 1x; stock concentration = 1x
Pen-Strep (P/S)	Life technologies	15140122	Ex vivo culture; working concentration = 1x; stock concentration = 1x
RBC Lysis buffer	Biolegend	420301	Lysing Red blood cells; working concentration = 1x; stock concentration = 10x
Recombinant Mouse Flt-3 Ligand (FLT3)	RnD	427-FL-005/CF	Ex vivo culture; working concentration = 2 ng/mL; stock concentration = 10 µg/mL
Recombinant mouse stem cell factor (SCF)	RnD	455-MC-010/CF	Ex vivo culture; working concentration = 100 ng/mL; stock concentration = 50 µg/mL
Sca1 APC	Thermo Fisher Scientific	17-5981-82	Antibody staining mix
StemlineII Hematopoietic Stem Cell Expansion Medium	SIGMA	S0192	Ex vivo culture
Streptavidin Pac orange	Life Technologies	S32365	Antibody staining mix
Streptavidin Tx red	Life Technologies	S872	Antibody staining mix
TMRM	Invitrogen	T668	Staining mitochondrial membrane potential; working concentration = 200 nM; stock concentration = 10 mM
Ultra pure EDTA	Invitrogen	15575-038	Buffer preparation; working concentration = 0.5 M; stock concentration = 1 mM