A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.
Method Article
يصف البروتوكول الحالي منهجية محسنة لعزل ADSC مما يؤدي إلى عائد خلوي هائل مع زيادة الوقت مقارنة بالأدبيات. توفر هذه الدراسة أيضا طريقة مباشرة للحصول على عدد كبير نسبيا من الخلايا القابلة للحياة بعد الحفظ بالتبريد على المدى الطويل.
أصبحت الخلايا الجذعية الوسيطة البشرية المشتقة من الأنسجة الدهنية جذابة بشكل متزايد لأنها تظهر ميزات مناسبة وهي مصدر يمكن الوصول إليه للتطبيقات السريرية التجديدية. تم استخدام بروتوكولات مختلفة للحصول على الخلايا الجذعية المشتقة من الدهون. توضح هذه المقالة الخطوات المختلفة لبروتوكول توفير الوقت المحسن للحصول على كمية أكثر أهمية من ADSC، مما يوضح كيفية حفظ ADSC وإذابته بالتبريد للحصول على خلايا قابلة للحياة لتوسيع الثقافة. تم جمع مائة ملليلتر من شفط الدهون باستخدام شفط الدهون بحقنة من عيار 26 سم وثلاث ثقوب وعيار 3 مم ، من منطقة البطن لتسعة مرضى خضعوا لاحقا لعملية شد البطن الاختيارية. تم عزل الخلايا الجذعية بسلسلة من الغسلات باستخدام محلول ملحي مخزن للفوسفات (DPBS) من Dulbecco مع الكالسيوم واستخدام الكولاجيناز. تم حفظ خلايا الكسر الوعائي اللحمي (SVF) بالتبريد ، وتم فحص صلاحيتها عن طريق التنميط المناعي. كان العائد الخلوي SVF 15.7 × 105 خلايا / مل ، يتراوح بين 6.1-26.2 خلية / مل. وصلت خلايا SVF الملتصقة إلى التقاء بعد متوسط 7.5 (±4.5) يوما ، بمتوسط عائد خلوي يبلغ 12.3 (± 5.7) × 105 خلايا / مل. تراوحت صلاحية SVF المذاب بعد 8 أشهر و 1 سنة و 2 سنة بين 23.06٪ -72.34٪ بمتوسط 47.7٪ (±24.64) مع أدنى جدوى مرتبطة بحالات التجميد لمدة عامين. أدى استخدام محلول DPBS المكمل بالكالسيوم وأوقات استراحة الكيس لترسيب الدهون مع وقت أقصر من هضم الكولاجيناز إلى زيادة العائد الخلوي النهائي للخلايا الجذعية. كان الإجراء التفصيلي للحصول على غلات عالية من الخلايا الجذعية القابلة للحياة أكثر كفاءة فيما يتعلق بالوقت والعائد الخلوي من التقنيات من الدراسات السابقة. حتى بعد فترة طويلة من الحفظ بالتبريد ، تم العثور على خلايا ADSC قابلة للحياة في SVF.
الخلايا الجذعية الوسيطة البشرية مفيدة في كل من البحوث الأساسية والتطبيقية. يتجاوز استخدام هذا النوع من الخلايا البالغة القضايا الأخلاقية - مقارنة باستخدام الخلايا الجنينية أو غيرها - كونه أحد أكثر مجالات الدراسة الواعدة في هندسة تجديد الأنسجة الذاتية والعلاج الخلوي1 ، مثل منطقة الأورام ، وعلاج الأمراض التنكسية ، والتطبيقات العلاجية في منطقة الجراحة الترميمية2،3،4 ، 5. تم الإبلاغ سابقا عن وجود مصدر وفير للخلايا الجذعية متعددة القدرات ومتعددة القدرات في جزء الخلايا الوعائية اللحمية من الأنسجة الدهنية 6,7. تعتبر هذه ADSC مرشحة رائعة للاستخدام في العلاج بالخلايا والزرع / التسريب حيث يمكن الحصول بسهولة على عدد كبير من الخلايا ذات القدرة القوية على التوسع خارج الجسم الحي بعائد مرتفع من إجراء طفيف التوغل 5,8.
كما ثبت أن الأنسجة الدهنية تقدم قدرة أكبر على توفير الخلايا الجذعية الوسيطة من مصدرين آخرين (نخاع العظام وأنسجة الحبل السري)9. إلى جانب كونه ضعيف المناعة ولديه قدرة عالية على الاندماج في الأنسجة المضيفة والتفاعل مع الأنسجة المحيطة4،10 ، يتمتع ADSC بقدرة متعددة القدرات على التمايز في خطوط الخلايا ، مع تقارير عن تمايز غضروفي ، عظمي ، وعضلي المنشأ في ظل ظروف الثقافة المناسبة11،12،13 ، وفي الخلايا ، مثل البنكرياس ، خلايا الكبد ، والخلايا العصبية14،15،16.
يتفق المجتمع العلمي على أن التأثير المناعي للخلايا الجذعية الوسيطة هو آلية عمل أكثر صلة بالعلاج الخلوي17،18،19 من خاصية تمايزها. واحدة من أهم مزايا استخدام ADSC هي إمكانية التسريب الذاتي أو التطعيم ، لتصبح علاجا بديلا للعديد من الأمراض. بالنسبة للطب التجديدي ، تم استخدام ADSC بالفعل في حالات تلف الكبد ، وإعادة بناء عضلة القلب ، وتجديد الأنسجة العصبية ، وتحسين وظيفة العضلات الهيكلية ، وتجديد العظام ، وعلاج السرطان ، وعلاج مرض السكري20,21.
وحتى هذا التاريخ، هناك 263 تجربة سريرية مسجلة لتقييم إمكانات مركز أبوظبي للأبحاث، مدرجة على الموقع الإلكتروني للمعاهد الوطنية الأمريكية للصحة22. تم وضع بروتوكولات مختلفة لحصاد الأنسجة الدهنية ، ولكن لا يوجد إجماع في الأدبيات حول طريقة موحدة لعزل ADSC للاستخدام السريري23،24. يمكن أن تؤثر طرق معالجة Lipoaspirate أثناء الجراحة وبعدها بشكل مباشر على صلاحية الخلية ، والعائد الخلوي النهائي25 ، وجودة مجموعة ADSC20. فيما يتعلق بالمعالجة الجراحية المسبقة ، ليس من الثابت جيدا أي تقنية جراحية مسبقة المعالجة تنتج عددا أكبر من الخلايا القابلة للحياة بعد العزل أو ما إذا كان محلول التخدير المحقون في الأنسجة الدهنية يؤثر على إنتاجية الخلية ووظائفها26. وبالمثل ، يمكن أن يؤدي الفرق بين تقنيات الحصول على الخلايا الدهنية إلى انخفاض بنسبة 70٪ في عدد ADSC20 القابل للحياة. وفقا للأدبيات ، يجب تجنب العلاجات الميكانيكية للحصول على مجموعات الخلايا ذات القدرة العالية - بما في ذلك الموجات فوق الصوتية - لأنها يمكن أن تكسر الأنسجة الدهنية20. ومع ذلك ، فإن طريقة شفط الدهون اليدوية باستخدام المحاقن أقل ضررا ، مما يتسبب في تدمير أقل للخلايا ، حيث ينتج عن شفط الدهون المنتفخ عدد كبير من الخلايا بأفضل جودة26.
تستخدم هذه التقنية محلول ملحي مع يدوكائين وإبينفرين يتم حقنه في منطقة شفط الدهون. لكل 3 مل من حجم المحلول المحقون ، يتم استنشاق 1 مل. في هذه الدراسة ، تم إجراء تقنية شفط الدهون الرطب ، حيث يتم شفط 0.2 مل من الأنسجة الدهنية لكل 1 مل من الأدرينالين والمحلول الملحي المحقون. يعد استخدام الإنزيمات الهاضمة ، وخاصة الكولاجيناز ، أمرا شائعا في عملية عزل ADSC.
بعد خطوة العزل الأولى في المختبر ، تسمى الحبيبات النهائية الكسر الوعائي اللحمي (SVF). يحتوي على أنواع مختلفة من الخلايا27 ، بما في ذلك خلايا السلائف البطانية ، والخلايا البطانية ، والبلاعم ، وخلايا العضلات الملساء ، والخلايا الليمفاوية ، والخلايا المحيطة ، والخلايا الشحمية المسبقة ، و ADSCs ، القادرة على الالتصاق. بمجرد الانتهاء من العزل النهائي من الثقافات في المختبر ، يتم التخلص من الخلايا التي لم تلتصق بالبلاستيك في التبادلات المتوسطة. بعد ثمانية أسابيع من التوسع والتغيرات المتوسطة والممرات، تمثل ADSCs معظم عدد الخلايا في القوارير20. واحدة من أهم مزايا استخدام الخلايا الجذعية المعزولة المشتقة من الدهون لعلاج مستقبلي محتمل هي إمكانية الحفظ بالتبريد. وقد ثبت أن شفاطات الدهون المحفوظة بالتبريد هي مصدر محتمل لخلايا SVF حتى بعد 6 أسابيع من التجميد28 ، مع النشاط البيولوجي حتى بعد عامين من الحفظ بالتبريد29 ، والقدرة الكاملة على النمو والتمايز في الثقافة30. ومع ذلك ، أثناء عملية الذوبان ، عادة ما يتم فقدان نسبة كبيرة من الخلايا31. لذلك ، يجب أن تضمن عملية إزالة شفط الدهون والطرق التالية لعزل الخلايا أعلى إنتاجية للخلايا.
تصف هذه الدراسة منهجية أسرع لجمع وعزل كالوريمتر المسح الضوئي التفاضلي، مما يدل على ارتفاع الإنتاجية الخلوية والجدوى لتحسين كفاءة العلاجات الخلوية. علاوة على ذلك ، تم تقييم تأثير هذه التقنية المحسنة بعد الحفظ بالتبريد SVF على المدى الطويل.
تمت الموافقة على هذه الدراسة من قبل لجنة الأخلاقيات التابعة ل UNIFESP (رقم البروتوكول: 0029/2015 CAAE: 40846215.0.0000.5505) ، والتي أجريت بعد الحصول على موافقة خطية مستنيرة من المرضى وفقا لإعلان هلسنكي (2004). تتكون عينة الدراسة الحالية من تسع مريضات ، تتراوح أعمارهن بين 33-50 عاما (متوسط العمر 41.5) ومتوسط مؤشر كتلة الجسم الأولي (BMI) 24.54 (يتراوح بين 22.32-26.77) (الجدول 1) الذين خضعوا لعملية شد البطن التجميلية بسبب زيادة الجلد بعد الحمل ، في قسم الجراحة التجميلية بجامعة ساو باولو الفيدرالية (UNIFESP) ، البرازيل. للحد من التحيز ، تم اختيار المرضى كمجموعة متجانسة مع مراعاة الجنس والعمر ومؤشر كتلة الجسم. مجموعات البيانات المستخدمة و / أو التي تم تحليلها خلال هذه الدراسة متاحة من المؤلف المقابل بناء على طلب معقول.
1. مجموعة من ليبواسبيرات
ملاحظة: يجب إجراء هذه الخطوة في مركز الجراحة.
2. معالجة ليبواسبات
ملاحظة: يجب تنفيذ هذه الخطوة في المختبر.
3. عد خلايا SVF
4. عملية ذوبان الخلايا
5. تقنية قياس التدفق الخلوي (وضع العلامات المتعددة للنمط المناعي)
6. بذر الممر 1 (P1)
7. التحليل الإحصائي
8. مقايسة التمايز
يوضح الجدول 1 توصيف الأفراد التسعة الذين تمت دراستهم ، بما في ذلك العمر والوزن والطول ومؤشر كتلة الجسم.
وفقا للعائد الخلوي المقدم في البداية ، تم حساب حجم الخلية الملقحة في الثقافة ليكون أقرب ما يمكن إلى سعة دورق الثقافة 75 سم2 . ويرد في الجدول 2 وصف لحج?...
عائد العزلة
من الثابت أن عملية الحفظ بالتبريد ، المطلوبة بشكل متكرر في العلاج الخلوي ، تؤدي إلى فقدان كبير للخلايا ، وأحيانا أكبر من 50٪ 29،30،35. وبالتالي ، فإن التحسين التقني للحصول على عائد خلوي أولي مرتفع بمعزل عن غيره أمر أساس?...
يعلن المؤلفون عدم وجود مصالح مالية متنافسة.
نشكر المرضى الذين تطوعوا للمشاركة والطاقم الطبي والتمريضي في مستشفى ساو باولو. تم دعم هذه الدراسة من قبل مؤسسة أمبارو في بيسكيزا دو إستادو دي ساو باولو (FAPESP) والمجلس الوطني للتنمية العلمية والتكنولوجيا (CNPq) ، البرازيل.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
1.8 mL cryovials | Nunc Thermo Fisher Scientific | 340711 | |
150 mL polyvinyl chloride transfer bag | JP FARMA | 80146150059 | |
2% Alizarin Red S Solution, pH 4.2 | Sigma Aldrich | A5533 | |
Adrenaline (1 mg/mL) | Hipolabor | NA | |
Alcian Blue solution | Sigma Aldrich | 1,01,647 | |
Antibiotic-Antimycotic 100x | Gibco | 15240062 | |
BD FACSCalibur Flow Cytometer using BD CellQues Pro Analysis | BD BioSciences | NA | |
Calcium chloride 10% | Merck | 102379 | |
Chlorhexidine gluconate 4% | VIC PHARMA | NA | |
Collagenase, Type I, powder | Gibco | 17018029 | |
DMEM (Dulbecco's modified Eagle's medium) | Gibco | 11966025 | |
DPBS no calcium, no magnesium (Dulbecco's Phosphate Buffered Saline Gibco Cell Therapy Systems) | Gibco | A1285801 | |
DPBS with calcium (Dulbecco's Phosphate Buffered Saline Gibco Cell Therapy Systems) | Gibco | A1285601 | |
Fetal bovine serum | Gibco | 10500056 | |
Formaldehyde 4% | Sigma Aldrich | 1,00,496 | |
Inverted light microscope | Nikon Eclipse TS100 | NA | |
Live and Dead Cell Assay | Thermofisher | 01-3333-41 | 01-3333-42 | |
Monoclonal antibody: CD105 | BD BioSciences | 745927 | |
Monoclonal antibody: CD11B | BD BioSciences | 746004 | |
Monoclonal antibody: CD19 | BD BioSciences | 745907 | |
Monoclonal antibody: CD34 | BD BioSciences | 747822 | |
Monoclonal antibody: CD45 | DAKO | M0701 | |
Monoclonal antibody: CD73 | BD BioSciences | 746000 | |
Monoclonal antibody: CD90 | BD BioSciences | 553011 | |
Monoclonal antibody: HLA-DR | BD BioSciences | 340827 | |
Mr. Frosty Freezing Container | Thermo Fisher Scientific | 5100-0001 | |
PBS (phosphate buffered saline) 1x pH 7.4 | Gibco | 10010023 | |
StemPro Adipogenesis Differentiation Kit | Gibco | A1007001 | |
StemPro Chondrogenesis Differentiation Kit | Gibco | A1007101 | |
StemPro Osteogenesis Differentiation Kit | Gibco | A1007201 | |
Sterile connector with one spike with needle injection site | Origen Biomedical Connector, USA | NA | Code mark: IBS |
Trypan blue solution 0.4% | Sigma Aldrich | 93595 | |
Trypsin-EDTA 0.25% 1x, phenol red | Gibco | 25200056 |
Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article
Request PermissionThis article has been published
Video Coming Soon
Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved