Technik zur Gewinnung mesenchymaler Stammzellen aus Fettgewebe und stromaler vaskulärer Fraktion Charakterisierung in der Langzeitkryokonservierung

Zusammenfassung

Das vorliegende Protokoll beschreibt eine verbesserte Methodik zur ADSC-Isolierung, die im Vergleich zur Literatur zu einer enormen zellulären Ausbeute mit Zeitgewinn führt. Diese Studie bietet auch eine einfache Methode, um eine relativ große Anzahl lebensfähiger Zellen nach langfristiger Kryokonservierung zu erhalten.

Zusammenfassung

Humane mesenchymale Stammzellen aus Fettgewebe sind zunehmend attraktiver geworden, da sie geeignete Merkmale aufweisen und eine zugängliche Quelle für regenerative klinische Anwendungen darstellen. Verschiedene Protokolle wurden verwendet, um aus Fett gewonnene Stammzellen zu erhalten. Dieser Artikel beschreibt verschiedene Schritte eines verbesserten zeitsparenden Protokolls, um eine signifikantere Menge an ADSC zu erhalten, und zeigt, wie ADSC kryokonserviert und aufgetaut wird, um lebensfähige Zellen für die Kulturexpansion zu erhalten. Einhundert Milliliter Lipoaspirate wurden mit einer 26 cm langen Dreiloch- und 3-mm-Spritzen-Fettabsaugung aus dem Bauchbereich von neun Patienten entnommen, die sich anschließend einer elektiven Bauchdeckenstraffung unterzogen. Die Isolierung der Stammzellen wurde mit einer Reihe von Wäschen mit Dulbeccos Phosphate Buffered Saline (DPBS) -Lösung, ergänzt mit Kalzium und der Verwendung von Kollagenase, durchgeführt. Zellen der stromalen vaskulären Fraktion (SVF) wurden kryokonserviert und ihre Lebensfähigkeit wurde durch Immunphänotypisierung überprüft. Die SVF-Zellausbeute betrug 15,7 x 10⁵ Zellen / ml, zwischen 6,1-26,2 Zellen / ml. Adhärente SVF-Zellen erreichten nach durchschnittlich 7,5 (±4,5) Tagen eine Konfluenz mit einer durchschnittlichen Zellausbeute von 12,3 (± 5,7) x 10⁵ Zellen/ml. Die Lebensfähigkeit von aufgetautem SVF nach 8 Monaten, 1 Jahr und 2 Jahren lag zwischen 23,06% und 72,34% mit einem Durchschnitt von 47,7% (±24,64), wobei die niedrigste Lebensfähigkeit mit Fällen von zweijährigem Einfrieren korrelierte. Die Verwendung von DPBS-Lösung, ergänzt mit Kalzium und Beutelruhezeiten für die Fettfällung mit einer kürzeren Zeit der Kollagenase-Verdauung, führte zu einer erhöhten Zellendausbeute der Stammzellen. Das detaillierte Verfahren zur Erzielung hoher Ausbeuten lebensfähiger Stammzellen war in Bezug auf Zeit und Zellertrag effizienter als die Techniken aus früheren Studien. Selbst nach einer langen Zeit der Kryokonservierung wurden lebensfähige ADSC-Zellen im SVF gefunden.

Einleitung

Humane mesenchymale Stammzellen sind sowohl in der Grundlagenforschung als auch in der angewandten Forschung von Vorteil. Die Verwendung dieses adulten Zelltyps überwindet ethische Fragen - verglichen mit der Verwendung embryonaler oder anderer Zellen - und ist eines der vielversprechendsten Forschungsgebiete in der autologen Geweberegeneration und Zelltherapie¹, wie der neoplastische Bereich, die Behandlung degenerativer Erkrankungen und therapeutische Anwendungen im Bereich der rekonstruktiven Chirurgie ^{2,3,4, 5}. Es wurde bereits berichtet, dass es eine reichliche Quelle von mesenchymalen multipotenten und pluripotenten Stammzellen in der stromalen vaskulären Zellfraktion des Fettgewebes^{gibt 6,7}. Diese ADSC gelten als hervorragende Kandidaten für den Einsatz in der Zelltherapie und Transplantation/Infusion, da eine beträchtliche Anzahl von Zellen mit einer starken Expansionskapazität ex vivo leicht mit einer hohen Ausbeute aus einem minimalinvasiven Verfahren gewonnen werden kann ^5,8.

Es wurde auch gezeigt, dass Fettgewebe eine größere Fähigkeit zur Bereitstellung mesenchymaler Stammzellen aufweist als zwei andere Quellen (Knochenmark und Nabelschnurgewebe)⁹. ADSC ist nicht nur schlecht immunogen und besitzt eine hohe Fähigkeit, sich in das Wirtsgewebe zu integrieren und mit dem umgebenden Gewebe zu interagieren^4,10, sondern hat auch eine multipotente Fähigkeit zur Differenzierung in Zelllinien, mit Berichten über chondrogene, osteogene und myogene Differenzierung unter geeigneten Kulturbedingungen^11,12,13, und in Zellen wie Pankreas, Hepatozyten^, und neurogene Zellen^14,15,16.

Die wissenschaftliche Gemeinschaft ist sich einig, dass die immunmodulatorische Wirkung der mesenchymalen Stammzellen ein relevanterer Wirkmechanismus für die Zelltherapie^{ist 17,18,19} als ihre Differenzierungseigenschaft. Einer der wichtigsten Vorteile der ADSC-Verwendung ist die Möglichkeit der autologen Infusion oder Transplantation, die zu einer alternativen Behandlung für mehrere Krankheiten wird. Für die regenerative Medizin wurden ADSC bereits bei Leberschäden, Rekonstruktion des Herzmuskels, Regeneration von Nervengewebe, Verbesserung der Skelettmuskelfunktion, Knochenregeneration, Krebstherapie und Diabetesbehandlung eingesetzt^20,21.

Bis heute gibt es 263 registrierte klinische Studien zur Bewertung des Potenzials von ADSC, die auf der Website der United States National Institutes of Health²² aufgeführt sind. Verschiedene Protokolle zur Entnahme von Fettgewebe wurden etabliert, aber es gibt keinen Konsens in der Literatur über eine standardisierte Methode zur Isolierung von ADSC für den klinischen Gebrauch^23,24. Lipoaspirate-Verarbeitungsmethoden während und nach der Operation können sich direkt auf die Zelllebensfähigkeit, die endgültige Zellausbeute²⁵ und die Qualität der ADSC-Population²⁰ auswirken. In Bezug auf die chirurgische Vorbehandlung ist nicht genau bekannt, welche chirurgische Vorbehandlungstechnik nach der Isolierung eine signifikantere Anzahl lebensfähiger Zellen ergibt oder ob die in das Fettgewebe injizierte Anästhesielösung die Zellausbeute und ihre Funktionen beeinflusst²⁶. In ähnlicher Weise kann der Unterschied zwischen den Techniken zur Gewinnung von Fettzellen zu einer Verringerung der Anzahl lebensfähiger ADSC 20 um bis zu⁷⁰% führen. Nach der Literatur sollten mechanische Behandlungen zur Gewinnung von Zellpopulationen mit hoher Lebensfähigkeit - einschließlich Ultraschall - vermieden werden, da sie das Fettgewebe abbauen können²⁰. Die manuelle Fettaspirationsmethode mit Spritzen ist jedoch weniger schädlich und verursacht weniger Zellzerstörung, wobei die Tumeszenzfettabsaugung eine signifikante Anzahl von Zellen mit der besten Qualität ergibt²⁶.

Diese Technik verwendet eine Kochsalzlösung mit Lidocain und Epinephrin, die in den Fettabsaugungsbereich injiziert wird. Für jedes injizierte 3-ml-Volumen der injizierten Lösung wird 1 ml aspiriert. In dieser Studie wurde die nasse Fettabsaugungstechnik durchgeführt, bei der für jeden injizierten 1 ml Adrenalin und Kochsalzlösung 0,2 ml Fettgewebe abgesaugt werden. Die Verwendung von Verdauungsenzymen, insbesondere Kollagenase, ist für den Prozess der Isolierung von ADSC üblich.

Nach dem ersten Isolationsschritt im Labor wird das endgültige Pellet als stromale vaskuläre Fraktion (SVF) bezeichnet. Es enthält verschiedene Zelltypen²⁷, einschließlich endothelialer Vorläuferzellen, Endothelzellen, Makrophagen, glatter Muskelzellen, Lymphozyten, Perizyten, Präadipozyten und ADSCs, die adhäsionsfähig sind. Sobald die endgültige Isolierung aus In-vitro-Kulturen abgeschlossen ist, werden Zellen, die nicht am Kunststoff haften, im Medienaustausch eliminiert. Nach acht Wochen Expansion, Mediumsveränderungen und Passagen repräsentieren ADSCs den größten Teil der Zellpopulation in den Kolben²⁰. Einer der wichtigsten Vorteile der Verwendung isolierter Stammzellen aus Fettgeweben für eine mögliche zukünftige Therapie ist die Möglichkeit der Kryokonservierung. Es wurde gezeigt, dass kryokonserviertes Lipoaspirate auch nach 6 Wochen des Einfrierens eine potenzielle Quelle von SVF-Zellen ist²⁸, mit biologischer Aktivität auch nach 2 Jahren Kryokonservierung²⁹ und voller Fähigkeit, in Kultur³⁰ zu wachsen und zu differenzieren. Während des Auftauvorgangs geht jedoch in der Regel ein erheblicher Prozentsatz der Zellen verloren³¹. Daher müssen der Prozess der Lipoaspirateentfernung und die folgenden Methoden der Zellisolierung die höchste Zellausbeute gewährleisten.

Diese Studie beschreibt eine schnellere Methodik zur Erfassung und Isolierung von ADSC und zeigt eine hohe Zellausbeute und Lebensfähigkeit für eine bessere Effizienz von Zelltherapeutika. Darüber hinaus wurde die Wirkung dieser verbesserten Technik nach Langzeit-SVF-Kryokonservierung evaluiert.

Protokoll

Die vorliegende Studie wurde von der Ethikkommission der UNIFESP genehmigt (Protokollnummer: 0029/2015 CAAE: 40846215.0.0000.5505), durchgeführt nach schriftlicher Einverständniserklärung der Patienten gemäß der Deklaration von Helsinki (2004). Die Stichprobe der vorliegenden Studie besteht aus neun Patientinnen im Alter von 33 bis 50 Jahren (Durchschnittsalter 41,5 Jahre) und einem durchschnittlichen anfänglichen Body-Mass-Index (BMI) von 24,54 (zwischen 22,32 und 26,77) (Tabelle 1), die sich einer ästhetischen Bauchdeckenstraffung aufgrund eines Hautüberschusses nach Schwangerschaften in der Abteilung für Plastische Chirurgie der Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP) unterzogen haben. Brazilien. Um Verzerrungen zu reduzieren, wurden die Patienten als homogene Gruppe unter Berücksichtigung von Geschlecht, Alter und BMI ausgewählt. Die während dieser Studie verwendeten und/oder analysierten Datensätze sind auf angemessene Anfrage beim korrespondierenden Autor erhältlich.

1. Sammlung von Lipoaspirate

HINWEIS: Dieser Schritt muss im Operationszentrum durchgeführt werden.

1. Verwenden Sie 4% Chlorhexidingluconat (siehe Materialtabelle) für die Hautvorbereitung und Asepsis.
   1. Führen Sie einen 2 mm subkutanen Hautschnitt durch (zwischen der Unterdermis und der Aponeurose). Führen Sie eine Klein-Kanüle von 26 mm 3 G Dreiloch- und 3-mm-Kaliber und eine Spritze ein, um ein Gesamtvolumen von 500 ml einer Adrenalinlösung (1 mg/ml) (siehe Materialtabelle) in Kochsalzlösung (1:1.000.000) im infraumbilicalen Bereich zu injizieren.
2. Schließen Sie eine 60-ml-Spritze an eine 26 mm 3 G Dreiloch- und 3-mm-Fettabsaugungskanüle an und führen Sie sie durch den Hautschnitt ein, wobei der Kolben verriegelt wird, um ein Vakuum zu erzeugen.
   1. Führen Sie Schiebe- und Zugbewegungen aus, so dass das Lipoaspirate mit dem erzeugten Vakuum in der 60-ml-Spritze verbleibt.
3. Die 100 ml des gesammelten Lipoaspirates werden mit einem sterilen Stecker mit einem Ventil in einen 150-ml-Polyvinylchlorid-Transferbeutel überführt (siehe Materialtabelle).
   1. Packen Sie den Transferbeutel in eine Styroporbox bei Raumtemperatur (~25 °C) und bringen Sie ihn sofort ins Labor. Nehmen Sie sich nicht länger als 30 Minuten Zeit, um mit der Gewebeverarbeitung zu beginnen.

2. Verarbeitung von Lipoaspirate

HINWEIS: Dieser Schritt muss im Labor durchgeführt werden.

1. Wiegen Sie zuerst den Beutel, messen Sie die Temperatur mit einem digitalen berührungslosen Infrarot-Klinikthermometer und lassen Sie den Beutel 5 Minuten in der Laminar-Flow-Kammer ruhen, um die fettigeren Schichten (Blasen) und die Gewebetrennung mit den interessierenden Zellen auszufällen.
   1. Führen Sie eine Reihe von Taschentüchern durch. Erstes Waschen: 100 ml DPBS mit Kalzium (1x) in den Transferbeutel injizieren und mit den Händen mischen.
   2. Lassen Sie es 5 Minuten stehen und entfernen Sie den größten Teil der Basalflüssigkeit, die ausfällt.
   3. Entsorgen Sie die Basalflüssigkeit mit einer 60-ml-Spritze, die am Beuteladapter befestigt ist. Dieser Vorgang muss zweimal wiederholt werden.
2. 100 ml Aufschlusslösung in den Beutel geben (93 ml kalziumfreies DPBS + 60 μL Calciumchlorid (1 g/L) + 7 ml 0,075% sterile Kollagenase, siehe Materialtabelle) und 30 min bei 37 °C unter langsamem Rühren stehen lassen.
3. Der gesamte Inhalt des Beutels wird in vier konische Röhrchen von 50 ml umgefüllt und bei 400 x g bei 22 °C für 10 min zentrifugiert.
   1. Entfernen und verwerfen Sie den Überstand und fügen Sie dem Zellpellet 5 ml Sulbeccos modifizierte Eagle's Medium (DMEM) niedrige Glukose hinzu, ergänzt mit 20% FBS (Fetal Rinderserum) (Abbildung 1).

3. Zählen der SVF-Zellen

1. Eine frische Lösung von 10 μL Trypanblau bei 0,05% in destilliertem Wasser mit 10 μL Zellsuspension für 5 min mischen.
2. Zählen Sie lebensfähige Zellen in einer Neubauer-Zellzählkammer³² mit einem Inverslichtmikroskop (siehe Materialtabelle) bei 20-facher Vergrößerung.
3. Resuspendieren Sie das Zellpellet in einem kryoprotektiven Medium (5 ml FBS + 10% Dimethylsulfoxid - DMSO) in einer Konzentration von 1 x 10⁶ Zellen/ml.
4. Geben Sie 1 ml dieser Mischung in Kryoeinheiten. Verwenden Sie einen Gefrierbehälter (siehe Materialtabelle) mit einer Abkühlgeschwindigkeit von (1 °C/min bis -80 °C).
   1. Bei -80 °C 1 Jahr lagern.
   2. Nach dieser Zeit in Standard-Kassettenboxen lagern, die in die flüssige Stickstoffdampfphase (-165 °C) eingetaucht sind.

4. Auftauprozess der Zellen

1. Nehmen Sie die Durchstechflaschen aus flüssigem Stickstoff und legen Sie sie sofort für 1 min in das 37 °C warme Wasserbad.
2. Legen Sie die SVF-Zellen in ein konisches Röhrchen mit 4 mL DMEM (niedrige Glukose ergänzt mit 20% FBS), vorgeheizt bei 37 °C.
3. Zentrifugieren bei 400 x g bei 22 °C für 5 min.
4. Entfernen Sie den Überstand und fügen Sie 1 ml DMEM (niedrige Glukose) + 10% FBS hinzu. Führen Sie eine Immunphänotypisierung durch, indem Sie die folgenden Schritte ausführen.

5. Durchflusszytometrie-Technik (Immunphänotyp-Mehrfachmarkierung)

1. 1 ml Zellpellet (Konzentration von 1.000 Zellen/μL) in fünf Zytometrieröhrchen (je 200 μL) geben.
2. Bei 400 x g bei 22 °C 5 min zentrifugieren und den Überstand mit einer Pipette verwerfen.
3. 300 μL phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) (10x) zugeben, bei 400 x g bei 22 °C zentrifugieren und den Überstand mit einer Pipette verwerfen.
4. Bereiten Sie fünf Röhrchen für verschiedene Markerkombinationen wie folgt vor: 5 μL CD11B/5 μL CD19/20 μL CD45; 5 μL CD73/20 μL CD90/5 μL CD105/20 μL CD45; 20 μL CD34/5 μL HLA-DR/20 μL CD45; Zelllebensfähigkeitstest-5 μL fluoreszierender Reaktivfarbstoff. (siehe Materialtabelle) und ein Röhrchen mit ungefärbten Zellen und PBS als Negativkontrolle. Im Wirbel homogenisieren und 30 min bei 4 °C inkubieren.
   1. Bei 400 x g bei 22 °C 5 min zentrifugieren, den Überstand mit einer Pipette verwerfen, 500 μL PBS (10x) hinzufügen und mit der Zellsortierung fortfahren.
      HINWEIS: Fünftausend Ereignisse werden pro Antikörpersatz im Durchflusszytometer mit vier Farben und fünf Parametern erfasst und mit der CellQuest-Software analysiert.

6. Aussaat von Passage 1 (P1)

1. Aussaat 2 x 10⁵ Zellen in einem 75 cm² Kulturkolben.
2. Fügen Sie 12 ml DMEM niedrige Glukose + 20% FBS + 10% Antibiotikum / Antimykotikum (mit 10.000 Einheiten Penicillin, 10 mg Streptomycin und 25 μg Amphotericin B pro ml, 0,1 μm) hinzu.
3. Wenn die Zellen zwischen 80% -90% Konfluenz erreichen, führen Sie eine Trypsinisierung der adhärenten Zellen mit 2 ml 0,25% EDTA-Trypsin für 3 min durch.
4. Zählen Sie die Zellen erneut (wie in Schritt 3 erwähnt).
5. Führen Sie die Immunphänotypisierung erneut durch (wie in Schritt 5 erwähnt).

7. Statistische Auswertung

1. Verwenden Sie Spearmans Rho-Rechner³³ , um die Stärke der Assoziation zwischen den folgenden Variablen mit P < 0,05 zu messen, wie unten erwähnt.
   1. Wählen Sie die SVF-Zellausbeute und die Anzahl der Tage, die SVF in Kultur in der ersten Passage (P1) bis 80%-90% Konfluenz (Tage bis P1) verbleibt.
   2. Wählen Sie SVF-Zellertrag vor und nach dem Wechsel zu P1.
   3. Berücksichtigen Sie Tage bis P1 und Zellertrag, bevor Sie zu P1 gehen.
   4. Wählen Sie SVF-Mobilfunkausbeute mit dem durchschnittlichen Prozentsatz der bestätigten ADSC.
   5. Berechnen Sie den Prozentsatz der bestätigten ADSC und die zelluläre Ausbeute, bevor Sie zu P1 gehen.
   6. Bestimmen Sie die BMI- und SVF-Zellausbeute.

8. Differenzierungstest

1. Führen Sie den Differenzierungstest nach einem Differenzierungskit-Protokoll durch (siehe Materialtabelle). Abbildung 4 zeigt die Ergebnisse für Fall 1.

Ergebnisse

Die Charakterisierung der neun untersuchten Personen, einschließlich Alter, Gewicht, Größe und BMI, ist in Tabelle 1 dargestellt.

Entsprechend der anfänglich dargestellten Zellausbeute wurde das in Kultur inokulierte Zellvolumen so berechnet, dass es so nah wie möglich an der Kapazität des 75^cm2 Kulturkolbens liegt. Das jeweils ausgesäte Probenvolumen ist in Tabelle 2 beschrieben. Dann wurde entsprechend der anfänglichen Zellausbeute ein var...

Diskussion

Isolationsausbeute
Es ist allgemein bekannt, dass der Kryokonservierungsprozess, der häufig in der Zelltherapie erforderlich ist, zu einem signifikanten Zellverlust führt, manchmal mehr als 50%29,30,35. Daher ist eine technische Verbesserung zur Erzielung einer hohen anfänglichen Zellausbeute in Isolation von grundlegender Bedeutung. Die Sammelmethode der Lipoaspirate und die Isolierungsmethode der Zellen ...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.8 mL cryovials	Nunc Thermo Fisher Scientific	340711
150 mL polyvinyl chloride transfer bag	JP FARMA	80146150059
2% Alizarin Red S Solution, pH 4.2	Sigma Aldrich	A5533
Adrenaline (1 mg/mL)	Hipolabor	NA
Alcian Blue solution	Sigma Aldrich	1,01,647
Antibiotic-Antimycotic 100x	Gibco	15240062
BD FACSCalibur Flow Cytometer using BD CellQues Pro Analysis	BD BioSciences	NA
Calcium chloride 10%	Merck	102379
Chlorhexidine gluconate 4%	VIC PHARMA	NA
Collagenase, Type I, powder	Gibco	17018029
DMEM (Dulbecco's modified Eagle's medium)	Gibco	11966025
DPBS no calcium, no magnesium (Dulbecco's Phosphate Buffered Saline Gibco Cell Therapy Systems)	Gibco	A1285801
DPBS with calcium (Dulbecco's Phosphate Buffered Saline Gibco Cell Therapy Systems)	Gibco	A1285601
Fetal bovine serum	Gibco	10500056
Formaldehyde 4%	Sigma Aldrich	1,00,496
Inverted light microscope	Nikon Eclipse TS100	NA
Live and Dead Cell Assay	Thermofisher	01-3333-41 | 01-3333-42
Monoclonal antibody: CD105	BD BioSciences	745927
Monoclonal antibody: CD11B	BD BioSciences	746004
Monoclonal antibody: CD19	BD BioSciences	745907
Monoclonal antibody: CD34	BD BioSciences	747822
Monoclonal antibody: CD45	DAKO	M0701
Monoclonal antibody: CD73	BD BioSciences	746000
Monoclonal antibody: CD90	BD BioSciences	553011
Monoclonal antibody: HLA-DR	BD BioSciences	340827
Mr. Frosty Freezing Container	Thermo Fisher Scientific	5100-0001
PBS (phosphate buffered saline) 1x pH 7.4	Gibco	10010023
StemPro Adipogenesis Differentiation Kit	Gibco	A1007001
StemPro Chondrogenesis Differentiation Kit	Gibco	A1007101
StemPro Osteogenesis Differentiation Kit	Gibco	A1007201
Sterile connector with one spike with needle injection site	Origen Biomedical Connector, USA	NA	Code mark: IBS
Trypan blue solution 0.4%	Sigma Aldrich	93595
Trypsin-EDTA 0.25% 1x, phenol red	Gibco	25200056