Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.
Method Article
Mevcut protokol, literatüre kıyasla zaman kazanımı ile muazzam bir hücresel verim ile sonuçlanan ADSC izolasyonu için geliştirilmiş bir metodolojiyi açıklamaktadır. Bu çalışma aynı zamanda uzun süreli kriyoprezervasyondan sonra nispeten çok sayıda canlı hücre elde etmek için basit bir yöntem sunmaktadır.
Yağ dokusundan elde edilen insan mezenkimal kök hücreleri, uygun özellikler gösterdikleri ve rejeneratif klinik uygulamalar için erişilebilir bir kaynak oldukları için giderek daha çekici hale gelmiştir. Adipoz türevi kök hücreleri elde etmek için farklı protokoller kullanılmıştır. Bu makalede, daha önemli miktarda ADSC elde etmek için geliştirilmiş bir zaman kazandıran protokolün farklı adımları anlatılmakta ve kültür genişlemesi için canlı hücreler elde etmek üzere ADSC'nin nasıl kriyoproteksiyon ve çözüleceği gösterilmektedir. Daha sonra elektif abdominoplasti uygulanan dokuz hastanın karın bölgesinden 26 cm üç delikli ve 3 mm kalibreli şırınga liposuction kullanılarak yüz mililitre lipoaspirat toplandı. Kök hücre izolasyonu, Dulbecco'nun kalsiyum ve kollajenaz kullanımı ile desteklenen Fosfat Tamponlu Salin (DPBS) çözeltisi ile bir dizi yıkama ile gerçekleştirildi. Stromal Vasküler Fraksiyon (SVF) hücreleri kriyoprezerve edildi ve canlılıkları immünofenotipleme ile kontrol edildi. SVF hücresel verimi 15.7 x 105 hücre/mL idi ve 6.1-26.2 hücre/mL arasında değişiyordu. Yapışkan SVF hücreleri, ortalama 7.5 (±4.5) gün sonra birleşime ulaştı ve ortalama hücresel verim 12.3 (± 5.7) x 105 hücre / mL'dir. Çözülmüş SVF'nin 8 ay, 1 yıl ve 2 yıl sonra yaşayabilirliği %23,06-%72,34 arasında değişmekte olup, ortalama %47,7 (±24,64) arasında değişmekte olup, en düşük canlılık iki yıllık donma vakaları ile ilişkilidir. Daha kısa bir kollajenaz sindirimi süresi ile yağ çökeltmesi için kalsiyum ve torba dinlenme süreleri ile desteklenen DPBS çözeltisinin kullanılması, kök hücre nihai hücresel veriminin artmasına neden olmuştur. Yüksek canlı kök hücre verimi elde etmek için ayrıntılı prosedür, zaman ve hücresel verim açısından önceki çalışmalardan elde edilen tekniklerden daha etkiliydi. Uzun bir kriyoprezervasyon döneminden sonra bile, SVF'de canlı ADSC hücreleri bulundu.
İnsan mezenkimal kök hücreleri hem temel hem de uygulamalı araştırmalarda avantajlıdır. Bu yetişkin hücre tipinin kullanımı, embriyonik veya diğer hücrelerin kullanımına kıyasla etik sorunları aşmaktadır - otolog doku rejenerasyon mühendisliği vehücre terapisinde en umut verici çalışma alanlarından biri olan 1, neoplastik alan, dejeneratif hastalıkların tedavisi ve rekonstrüktif cerrahi alanındaki terapötik uygulamalar 2,3,4, 5. Daha önce yağ dokusunun stromal vasküler hücre fraksiyonunda mezenkimal multipotent ve pluripotent kök hücrelerin bol miktarda bulunduğu bildirilmiştir 6,7. Bu ADSC, hücre tedavisi ve transplantasyon / infüzyonda kullanım için mükemmel adaylar olarak kabul edilir, çünkü ex vivo genişleme için güçlü bir kapasiteye sahip önemli sayıda hücre, minimal invaziv bir prosedürden yüksek verimle kolayca elde edilebilir 5,8.
Ayrıca, yağ dokusunun mezenkimal kök hücre sağlama kapasitesinin diğer iki kaynaktan (kemik iliği ve göbek kordonu dokusu) daha fazla olduğu gösterilmiştir9. Kötü immünojenik olmasının yanı sıra, konakçı dokuya entegre olma ve çevre dokularla etkileşime girme yeteneğinin yüksek olmasının yanı sıra 4,10, ADSC, uygunkültür koşulları altında kondrojenik, osteojenik ve miyojenik farklılaşma raporları ile hücre hatlarına ve pankreas, hepatositler gibi hücrelere çok güçlü bir farklılaşma kapasitesine sahiptir. ve nörojenik hücreler14,15,16.
Bilimsel topluluk, mezenkimal kök hücrelerin immünomodülatör etkisinin, hücre tedavisi içinfarklılaşma özelliklerinden 17,18,19 daha uygun bir etki mekanizması olduğu konusunda hemfikirdir. ADSC kullanımının en önemli yararlarından biri, çeşitli hastalıklar için alternatif bir tedavi haline gelen otolog infüzyon veya aşılama olasılığıdır. Rejeneratif tıp için, ADSC karaciğer hasarı, kalp kasının rekonstrüksiyonu, sinir dokusunun yenilenmesi, iskelet kası fonksiyonunun iyileştirilmesi, kemik rejenerasyonu, kanser tedavisi ve diyabet tedavisi20,21 vakalarında zaten kullanılmıştır.
Bu tarihe kadar, Amerika Birleşik Devletleri Ulusal Sağlık Enstitüleri 22'nin web sitesinde listelenen ADSC'nin potansiyelinin değerlendirilmesi için263 kayıtlı klinik çalışma bulunmaktadır. Yağ dokusunun toplanması için farklı protokoller oluşturulmuştur, ancak literatürde ADSK'yi klinik kullanım için izole etmek için standartlaştırılmış bir yöntem hakkında fikir birliği yoktur23,24. Ameliyat sırasında ve sonrasında lipoaspirat işleme yöntemleri, hücre canlılığını, nihai hücresel verimi25 ve ADSC popülasyonunun kalitesini20'yi doğrudan etkileyebilir. Cerrahi ön tedavi ile ilgili olarak, hangi cerrahi ön tedavi tekniğinin izolasyondan sonra daha anlamlı sayıda canlı hücre verdiği veya yağ dokusuna enjekte edilen anestezik solüsyonun hücre verimini ve fonksiyonlarını etkileyip etkilemediği iyi belirlenmemiştir26. Benzer şekilde, yağ hücreleri elde etme teknikleri arasındaki fark, canlı ADSC 20 sayısında%70'lik bir azalmaya neden olabilir. Literatüre göre, ultrason da dahil olmak üzere yüksek canlılığa sahip hücre popülasyonlarını elde etmek için mekanik tedavilerden kaçınılmalıdır, çünkü bunlar yağ dokusunu parçalayabilir20. Bununla birlikte, şırıngalarla manuel yağ aspirasyon yöntemi daha az zararlıdır, daha az hücre yıkımına neden olur, tümesan liposuction en iyi kalitede26 ile önemli sayıda hücre verir.
Bu teknik, liposuction bölgesine enjekte edilen lidokain ve epinefrin içeren bir salin çözeltisi kullanır. Enjekte edilen her 3 mL çözelti hacmi için 1 mL aspire edilir. Bu çalışmada, enjekte edilen her 1 mL adrenalin ve salin çözeltisi için 0.2 mL yağ dokusunun aspire edildiği ıslak liposuction tekniği uygulanmıştır. Sindirim enzimlerinin, özellikle kollajenazın kullanımı, ADSC'yi izole etme işlemi için yaygındır.
Laboratuvardaki ilk izolasyon adımından sonra, son pelet stromal vasküler fraksiyon (SVF) olarak adlandırılır. Endotel öncü hücreleri, endotel hücreleri, makrofajlar, düz kas hücreleri, lenfositler, perisitler, pre-adipositler ve adezyon yeteneğine sahip ADSC'ler dahil olmak üzere farklı hücre tipleri27 içerir. Son izolasyon in vitro kültürlerden tamamlandıktan sonra, plastiğe yapışmayan hücreler orta değişimlerde elimine edilir. Sekiz haftalık genişleme, orta değişiklikler ve pasajlardan sonra, ADSC'ler şişe20'deki hücre popülasyonunun çoğunu temsil eder. Gelecekteki olası bir tedavi için izole adipoz türevi kök hücrelerin kullanılmasının en önemli avantajlarından biri kriyoprezervasyon olasılığıdır. Kriyokorunmuş lipoaspiratın, 6 haftalık donma28'den sonra bile SVF hücrelerinin potansiyel bir kaynağı olduğu, 2 yıllık kriyoprezervasyon29'dan sonra bile biyolojik aktiviteye sahip olduğu ve kültür30'da büyüme ve farklılaşma kabiliyetinin tam olduğu gösterilmiştir. Bununla birlikte, çözülme işlemi sırasında, hücrelerin önemli bir yüzdesi genellikle31 oranında kaybolur. Bu nedenle, lipoaspirat çıkarma işlemi ve aşağıdaki hücre izolasyon yöntemleri en yüksek hücre verimini sağlamalıdır.
Bu çalışma, ADSC'yi toplamak ve izole etmek için daha hızlı bir metodolojiyi açıklamakta, hücresel terapötiklerin daha iyi verimliliği için yüksek hücresel verim ve canlılık göstermektedir. Ayrıca, bu gelişmiş tekniğin uzun süreli SVF kriyoprezervasyonundan sonraki etkisi değerlendirildi.
Bu çalışma, Helsinki Deklarasyonu'na (2004) göre hastalardan yazılı bilgilendirilmiş onam alındıktan sonra gerçekleştirilen UNIFESP Etik Kurulu (protokol numarası: 0029/2015 CAAE: 40846215.0.0000.5505) tarafından onaylanmıştır. Bu çalışmanın örneklemi, Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP) Plastik Cerrahi Bölümü'nde, gebelik sonrası deri fazlalığı nedeniyle estetik abdominoplasti uygulanan 33-50 yaş (ortalama yaş 41.5) ve ortalama başlangıç vücut kitle indeksi (VKİ) 24.54 (22.32-26.77 arasında değişen) dokuz kadın hastadan oluşmaktadır. Brezilya. Önyargıyı azaltmak için, hastalar cinsiyet, yaş ve VKİ dikkate alınarak homojen bir grup olarak seçildi. Bu çalışma sırasında kullanılan ve/veya analiz edilen veri kümeleri, makul talep üzerine sorumlu yazardan temin edilebilir.
1. Lipoaspirat toplanması
NOT: Bu adımın ameliyat merkezinde yapılması gerekmektedir.
2. Lipoaspiratın işlenmesi
NOT: Bu adım laboratuvarda gerçekleştirilmelidir.
3. SVF hücrelerinin sayımı
4. Hücrelerin çözülme süreci
5. Akım sitometri tekniği (immünofenotipli çoklu etiketleme)
6. Pasajın tohumlanması 1 (P1)
7. İstatistiksel analiz
8. Farklılaşma testi
İncelenen dokuz bireyin yaşları, kiloları, boyları ve VKİ'leri dahil olmak üzere karakterizasyonu Tablo 1'de gösterilmiştir.
Başlangıçta sunulan hücresel verime göre, kültürde aşılanan hücre hacminin 75cm2 kültür şişesinin kapasitesine mümkün olduğunca yakın olduğu hesaplanmıştır. Her durumda tohumlanan numune hacmi Tablo 2'de açıklanmıştır. Daha sonra, ilk hücresel verime göre, her numune için değişken bir h...
İzolasyon verimi
Hücresel tedavide sıklıkla gerekli olan kriyoprezervasyon işleminin, bazen %50'den fazla olan önemli hücre kaybına neden olduğu iyi bilinmektedir29,30,35. Bu nedenle, izolasyonda yüksek başlangıç hücresel verimi elde etmek için teknik bir gelişme esastır. Lipoaspiratın toplama yöntemi ve hücrelerin izolasyon yöntemi, hücrelerin uzun vadeli kültürünü ve manipülasyonu...
Yazarlar rakip finansal çıkarlar olmadığını beyan ederler.
Katılmak için gönüllü olan hastalara ve São Paulo Hastanesi'nin tıbbi ve hemşirelik personeline teşekkür ederiz. Bu çalışma Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) ve Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq), Brezilya tarafından desteklenmiştir.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
1.8 mL cryovials | Nunc Thermo Fisher Scientific | 340711 | |
150 mL polyvinyl chloride transfer bag | JP FARMA | 80146150059 | |
2% Alizarin Red S Solution, pH 4.2 | Sigma Aldrich | A5533 | |
Adrenaline (1 mg/mL) | Hipolabor | NA | |
Alcian Blue solution | Sigma Aldrich | 1,01,647 | |
Antibiotic-Antimycotic 100x | Gibco | 15240062 | |
BD FACSCalibur Flow Cytometer using BD CellQues Pro Analysis | BD BioSciences | NA | |
Calcium chloride 10% | Merck | 102379 | |
Chlorhexidine gluconate 4% | VIC PHARMA | NA | |
Collagenase, Type I, powder | Gibco | 17018029 | |
DMEM (Dulbecco's modified Eagle's medium) | Gibco | 11966025 | |
DPBS no calcium, no magnesium (Dulbecco's Phosphate Buffered Saline Gibco Cell Therapy Systems) | Gibco | A1285801 | |
DPBS with calcium (Dulbecco's Phosphate Buffered Saline Gibco Cell Therapy Systems) | Gibco | A1285601 | |
Fetal bovine serum | Gibco | 10500056 | |
Formaldehyde 4% | Sigma Aldrich | 1,00,496 | |
Inverted light microscope | Nikon Eclipse TS100 | NA | |
Live and Dead Cell Assay | Thermofisher | 01-3333-41 | 01-3333-42 | |
Monoclonal antibody: CD105 | BD BioSciences | 745927 | |
Monoclonal antibody: CD11B | BD BioSciences | 746004 | |
Monoclonal antibody: CD19 | BD BioSciences | 745907 | |
Monoclonal antibody: CD34 | BD BioSciences | 747822 | |
Monoclonal antibody: CD45 | DAKO | M0701 | |
Monoclonal antibody: CD73 | BD BioSciences | 746000 | |
Monoclonal antibody: CD90 | BD BioSciences | 553011 | |
Monoclonal antibody: HLA-DR | BD BioSciences | 340827 | |
Mr. Frosty Freezing Container | Thermo Fisher Scientific | 5100-0001 | |
PBS (phosphate buffered saline) 1x pH 7.4 | Gibco | 10010023 | |
StemPro Adipogenesis Differentiation Kit | Gibco | A1007001 | |
StemPro Chondrogenesis Differentiation Kit | Gibco | A1007101 | |
StemPro Osteogenesis Differentiation Kit | Gibco | A1007201 | |
Sterile connector with one spike with needle injection site | Origen Biomedical Connector, USA | NA | Code mark: IBS |
Trypan blue solution 0.4% | Sigma Aldrich | 93595 | |
Trypsin-EDTA 0.25% 1x, phenol red | Gibco | 25200056 |
Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi
Izin talebiThis article has been published
Video Coming Soon
JoVE Hakkında
Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır