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要約

本プロトコルは、文献と比較して時間的増加を伴う途方もない細胞収量をもたらすADSC単離のための改良された方法論を記載する。この研究はまた、長期凍結保存後に比較的多数の生細胞を得るための簡単な方法を提供します。

要約

脂肪組織由来のヒト間葉系幹細胞は、適切な特徴を示し、再生臨床応用のためのアクセス可能な供給源であるため、ますます魅力的になっています。脂肪由来幹細胞を得るために、異なるプロトコルが使用されている。この記事では、より大量のADSCを得るために改良された時間節約プロトコルのさまざまなステップについて説明し、ADSCを凍結保存および解凍して培養増殖用の生細胞を取得する方法を示します。その後待機的腹部形成術を受けた9人の患者の腹部から、26cmの3穴および3mm口径のシリンジ脂肪吸引を使用して、100ミリリットルの脂肪吸引液を採取した。幹細胞の単離は、カルシウムを添加したダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水(DPBS)溶液およびコラゲナーゼの使用による一連の洗浄で行った。間質血管画分(SVF)細胞を凍結保存し、その生存率をイムノフェノタイピングによって確認しました。SVF細胞収量は15.7 x 105 細胞/ mLであり、6.1〜26.2細胞/ mLの範囲でした。接着性SVF細胞は平均7.5(±4.5)日後にコンフルエントに達し、平均細胞収量は12.3(± 5.7)x 105 細胞/mLでした。8ヶ月、1年、2年後の解凍SVFの生存率は23.06%〜72.34%の範囲で、平均47.7%(±24.64)であり、2年間の凍結の場合と相関する生存率は最も低かった。カルシウムとバッグの休止時間を補ったDPBS溶液を使用して脂肪を沈殿させ、コラゲナーゼ消化時間を短縮すると、幹細胞の最終細胞収量が増加しました。生幹細胞を高収率で得るための詳細な手順は、以前の研究の技術よりも時間と細胞収率に関してより効率的でした。長期間の凍結保存後でも、SVFに生菌ADSC細胞が見出された。

概要

ヒト間葉系幹細胞は、基礎研究と応用研究の両方で有利です。この成体細胞型の使用は、胚や他の細胞の使用と比較して倫理的問題を克服し、腫瘍領域、変性疾患の治療、再建手術領域2,3,4の治療など、自家組織再生工学および細胞治療における最も有望な研究分野の1つです。5.脂肪組織の間質血管細胞画分には間葉系多能性および多能性幹細胞の豊富な供給源があることが以前に報告されている6,7。これらのADSCは、最小限の侵襲的手順から、ex vivoでの強力な増殖能力を有するかなりの数の細胞を高収率で容易に得ることができるため、細胞療法および移植/注入に使用するための優れた候補と考えられている5,8。

また、脂肪組織は、他の2つの供給源(骨髄および臍帯組織)よりも間葉系幹細胞を提供する能力が高いことも実証されました9。ADSCは、免疫原性が低く、宿主組織に統合し、周囲の組織と相互作用する能力が高いことに加えて4,10、細胞株への分化の多能性能力を有し、適切な培養条件下での軟骨形成、骨形成、および筋原性分化の報告があります11,12,13、および膵臓、肝細胞などの細胞への分化、 神経原性細胞14,15,16。

科学界は、間葉系幹細胞の免疫調節効果が、その分化特性よりも細胞療法にとってより関連性のある作用機序であることに同意しています17,18,19。ADSC使用の最も重要なメリットの1つは、自家注入または移植の可能性であり、いくつかの疾患の代替治療になります。再生医療では、肝障害、心筋の再建、神経組織の再生、骨格筋機能の改善、骨の再生、がん治療、糖尿病治療などにADSCがすでに使用されています20,21。

現在までに、ADSCの可能性を評価するための263の登録臨床試験があり、米国国立衛生研究所のウェブサイトに記載されています22。脂肪組織を採取するためのさまざまなプロトコルが確立されていますが、臨床使用のためにADSCを分離するための標準化された方法についての文献にはコンセンサスがありません23,24。手術中および手術後の脂肪吸引処理方法は、細胞生存率、最終的な細胞収量25、およびADSC集団の質20に直接影響する可能性があります。外科的前処理に関しては、どの外科的前処理技術が単離後により多くの有意な数の生細胞を生成するか、または脂肪組織に注入された麻酔薬溶液が細胞収量およびその機能に影響を与えるかどうかは十分に確立されていない26。同様に、脂肪細胞を得るための技術間の違いは、生存可能なADSC20の数の70%もの減少をもたらし得る。文献によれば、超音波を含む高い生存率を有する細胞集団を得るための機械的処置は、脂肪組織を分解する可能性があるため、避けるべきである20。ただし、注射器を使用した手動脂肪吸引法は害が少なく、細胞破壊が少なく、腫脹性脂肪吸引により、最高品質のかなりの数の細胞が得られます26。

この技術は、脂肪吸引領域に注入されるリドカインとエピネフリンを含む生理食塩水を使用します。注入された溶液の容量3 mLごとに、1 mLが吸引されます。この研究では、1 mLのアドレナリンと生理食塩水を注入するごとに、0.2 mLの脂肪組織を吸引する湿式脂肪吸引技術を実施しました。消化酵素、特にコラゲナーゼの使用は、ADSCを単離するプロセスに一般的です。

実験室での最初の単離ステップの後、最終的なペレットは間質血管画分(SVF)と呼ばれます。これには、内皮前駆細胞、内皮細胞、マクロファージ、平滑筋細胞、リンパ球、周皮細胞、前脂肪細胞、および接着が可能なADSCを含む、さまざまな細胞タイプ27が含まれています。 in vitro 培養からの最終的な単離が完了すると、プラスチックに接着しなかった細胞は培地交換で排除されます。8週間の増殖、培地交換、および継代の後、ADSCはフラスコ20内の細胞集団の大部分を表す。将来の治療の可能性のために単離された脂肪由来幹細胞を使用することの最も重要な利点の1つは、凍結保存の可能性です。凍結保存された脂肪吸引液は、6週間の凍結後でもSVF細胞の潜在的な供給源であり28、2年間の凍結保存後でも生物学的活性があり29、培養で増殖および分化する完全な能力があることが実証されました30。しかしながら、融解プロセス中に、かなりの割合の細胞が通常失われる31。したがって、脂肪吸引除去プロセスおよび以下の細胞単離方法は、最高の細胞収率を確保しなければならない。

この研究では、ADSCを収集して分離するためのより迅速な方法論について説明し、細胞治療の効率を向上させるための高い細胞収量と生存率を実証します。さらに、SVF凍結保存後のこの改良技術の効果を評価した。

プロトコル

本研究は、UNIFESPの倫理委員会(プロトコル番号:0029/2015 CAAE:40846215.0.0000.5505)によって承認され、 ヘルシンキ宣言(2004)に従って患者から書面によるインフォームドコンセントを取得した後に実施されます。本研究のサンプルは、33〜50歳(平均年齢41.5歳)および平均初期ボディマス指数(BMI)24.54(22.32〜26.77の範囲)(表1)の9人の女性患者で構成されています 妊娠後の皮膚の過剰のために審美的腹部形成術を受けた人、 サンパウロ連邦大学(UNIFESP)の形成外科部門で、 ブラジル。バイアスを減らすために、患者は性別、年齢、およびBMIを考慮して同種グループとして選択されました。この研究中に使用および/または分析されたデータセットは、合理的な要求に応じて対応する著者から入手できます。

1.脂肪吸引液の採取

注:この手順は手術センターで実行する必要があります。

  1. 皮膚の準備と無菌のために4%グルコン酸クロルヘキシジン( 材料の表を参照)を使用してください。
    1. 2 mmの皮下皮膚切開(真皮下と腱膜の間)を行います。口径26 mm 3 Gの3穴と3 mm口径のクラインカニューレとシリンジを挿入して、生理食塩水(1:1,000,000)で希釈したアドレナリン溶液(1 mg / mL)( 材料の表を参照)の総量500 mLを臍帯下に注入します。
  2. 60 mLシリンジを26 mm 3 Gの3穴および3 mm口径の脂肪吸引カニューレに接続し、皮膚切開部から挿入し、プランジャーをロックして真空を作ります。
    1. 真空が作られた状態で脂肪吸引液が60 mLシリンジに残るように、押したり引いたりする動きをします。
  3. バルブ付きの滅菌コネクタを使用して、採取した脂肪吸引液100 mLを150 mLポリ塩化ビニル移送バッグに移します( 材料表を参照)。
    1. トランスファーバッグをポリスチレンボックスに室温(~25°C)で詰め、すぐに実験室に持ち込んでください。組織処理を開始するのに30分以上かからないでください。

2.脂肪吸引液の処理

注意: このステップは実験室で実行されます。

  1. まず、バッグの重量を量り、デジタル非接触赤外線体温計で温度を測定し、バッグを層流チャンバー内で5分間休ませて、脂っこい層(気泡)の沈殿と目的の細胞を含む組織分離を行います。
    1. 一連の組織洗浄を行います。最初の洗浄:カルシウム(1x)を含む100 mLのDPBSをトランスファーバッグに注入し、手で混ぜます。
    2. 5分間放置し、沈殿する基礎液の大部分を取り除きます。
    3. バッグアダプターに取り付けられた60 mLシリンジで基礎液を廃棄します。このプロセスは2回繰り返す必要があります。
  2. 100 mLの消化溶液をバッグに加え(93 mLのカルシウムフリーDPBS + 60 μLの塩化カルシウム(1 g / L)+ 7 mLの0.075%滅菌コラゲナーゼ、 材料の表を参照)、ゆっくりと攪拌しながら37°Cで30分間放置します。
  3. バッグの内容物をすべて50 mLの4本の円錐形チューブに移し、400 x g で22°Cで10分間遠心分離します。
    1. 上清を除去して廃棄し、20%FBS(ウシ胎児血清)を添加したダルベッコ改変イーグル培地(DMEM)低グルコース5 mLを細胞ペレットに加えます(図1)。

3. SVF細胞のカウント

  1. 10 μLのトリパンブルーの新鮮な溶液を蒸留水中の0.05%で10 μLの細胞懸濁液と5分間混合します。
  2. ノイバウアー細胞計数チャンバー32 内の生細胞を倒立光学顕微鏡( 材料の表を参照)を用いて20倍の倍率で計数する。
  3. 細胞ペレットを凍結保護培地(5 mLのFBS + 10%ジメチルスルホキシド-DMSO)に1 x 106 細胞/ mLの濃度で再懸濁します。
  4. このミックス1 mLをクライオバイアルに入れます。冷却速度(1°C / minから-80°C)の冷凍容器( 材料表を参照)を使用してください。
    1. -80°Cで1年間保管してください。
    2. この後、液体窒素気相(-165°C)に浸した標準カセットボックスに保管してください。

4.細胞の解凍プロセス

  1. バイアルを液体窒素から取り出し、直ちに37°Cの水浴に1分間入れます。
  2. SVF細胞を、37°Cに予熱した4 mLのDMEM(低グルコースに20%FBSを添加した)を入れた円錐管に入れます。
  3. 400 x g 、22°Cで5分間遠心分離します。
  4. 上清を取り除き、1 mLのDMEM(低グルコース)+ 10%FBSを追加します。以下の手順に従ってイムノフェノタイピングを実行します。

5. フローサイトメトリー技術(免疫表現型多重標識)

  1. 1 mLの細胞ペレット(濃度1,000細胞/μL)を5本のサイトメトリーチューブ(各200 μL)に入れます。
  2. 400 x g 、22°Cで5分間遠心分離し、上清をピペットで廃棄します。
  3. 300 μLのリン酸緩衝生理食塩水(PBS)(10x)を加え、22°Cで400 x g で遠心分離し、上清をピペットで廃棄します。
  4. 次のように、異なるマーカーの組み合わせ用に5本のチューブを準備します:5 μLのCD11B/5 μLのCD19/20 μLのCD45;CD73/20 μL5 μLのCD90/5 μLのCD105/20 μLのCD45;20 μL の CD34/5 μL の HLA-DR/20 μL の CD45;細胞生存率アッセイ-5 μLの蛍光反応性色素。( 材料の表を参照)および陰性対照として染色されていない細胞およびPBSを有するチューブ。ボルテックスでホモジナイズし、4°Cで30分間インキュベートします。
    1. 400 x g 、22°Cで5分間遠心分離し、上清をピペットで廃棄し、500 μLのPBS(10x)を加えて、細胞ソーティングを進めます。
      注:フローサイトメーターの抗体セットごとに4色と5つのパラメータの5000イベントを取得し、CellQuestソフトウェアで分析します。

6. 継代1(P1)の播種

  1. 2 x 105細胞を75cm2の培養フラスコに播種する。
  2. 12 mLのDMEM低グルコース+ 20%のFBS + 10%抗生物質/抗真菌薬を追加します(10,000単位のペニシリン、10 mgのストレプトマイシン、および25 μgのアムホテリシンB/mL、0.1 μm)を追加します。.
  3. 細胞が80%〜90%のコンフルエントに達したら、接着細胞のトリプシン処理を2 mLの0.25%EDTA-トリプシンで3分間行います。
  4. セルをもう一度カウントします(手順3で説明したように)。
  5. イムノフェノタイピングを再度実行します(ステップ5で述べたように)。

7.統計分析

  1. スピアマンのRho計算機33 を使用して、以下に示すように、 P <0.05で次の変数間の関連性の強さを測定します。
    1. SVF細胞収量を選択し、SVFが最初の継代(P1)で80%〜90%コンフルエントになるまで培養にとどまる日数(P1までの日数)を選択します。
    2. P1に行く前後のSVF細胞収量を選択します。
    3. P1に行く前に、P1までの日数と細胞収量を考慮してください。
    4. 確認されたADSCの平均パーセンテージでSVF細胞収量を選択します。
    5. P1に行く前に、確認されたADSCの割合と細胞収量を計算します。
    6. BMIおよびSVF細胞収量を決定します。

8. 分化アッセイ

  1. 鑑別キットプロトコルに従って鑑別アッセイを実行します( 材料の表を参照)。 図 4 に、ケース 1 の結果を示します。

結果

年齢、体重、身長、BMIなど、調査した9人の個人の特徴を 表1に示します。

最初に提示した細胞収量に従って、培養液に接種される細胞量は、75cm2 培養フラスコの容量にできるだけ近いと計算した。それぞれの場合において播種したサンプル量を 表2に記載する。次に、初期細胞収量に従って、各サンプルの可変容量の細胞を決定しました...

ディスカッション

単離収率
細胞療法で頻繁に必要とされる凍結保存プロセスは、時には50%を超える重大な細胞損失をもたらすことは十分に確立されています29,30,35。したがって、単離して高い初期細胞収量を得るための技術的改善が基本である。脂肪吸引液の採取方法と細胞の単離方法は、細胞の長期培養と操作を考慮しな?...

開示事項

著者は、競合する金銭的利益を宣言していません。

謝辞

ボランティアで参加してくださった患者さん、サンパウロ病院の医療・看護スタッフに感謝します。この研究は、サンパウロ州アンパロ・ペスキサ・ド・エスタード・デ・サンパウロ財団(FAPESP)およびブラジルのコンセリョ・ナシオナル・デ・デセンボルビメント・シエンティフィコ・エ・テクノロヒコ(CNPq)の支援を受けた。

資料

NameCompanyCatalog NumberComments
1.8 mL cryovialsNunc Thermo Fisher Scientific340711
150 mL polyvinyl chloride transfer bagJP FARMA80146150059
2% Alizarin Red S Solution, pH 4.2Sigma AldrichA5533
Adrenaline (1 mg/mL)HipolaborNA
Alcian Blue solutionSigma Aldrich1,01,647
Antibiotic-Antimycotic 100xGibco15240062
BD FACSCalibur Flow Cytometer using BD CellQues Pro AnalysisBD BioSciencesNA
Calcium chloride 10%Merck102379
Chlorhexidine gluconate 4%VIC PHARMANA
Collagenase, Type I, powderGibco17018029
DMEM (Dulbecco's modified Eagle's medium)Gibco11966025
DPBS no calcium, no magnesium (Dulbecco's Phosphate Buffered Saline Gibco Cell Therapy Systems)GibcoA1285801
DPBS with calcium (Dulbecco's Phosphate Buffered Saline Gibco Cell Therapy Systems)GibcoA1285601
Fetal bovine serumGibco10500056
Formaldehyde 4%Sigma Aldrich1,00,496
Inverted light microscopeNikon Eclipse TS100NA
Live and Dead Cell AssayThermofisher01-3333-41 | 01-3333-42
Monoclonal antibody: CD105BD BioSciences745927
Monoclonal antibody: CD11BBD BioSciences746004
Monoclonal antibody: CD19BD BioSciences745907
Monoclonal antibody: CD34BD BioSciences747822
Monoclonal antibody: CD45DAKOM0701
Monoclonal antibody: CD73BD BioSciences746000
Monoclonal antibody: CD90BD BioSciences553011
Monoclonal antibody: HLA-DRBD BioSciences340827
Mr. Frosty Freezing ContainerThermo Fisher Scientific5100-0001
PBS (phosphate buffered saline) 1x pH 7.4Gibco 10010023
StemPro Adipogenesis Differentiation KitGibcoA1007001
StemPro Chondrogenesis Differentiation KitGibcoA1007101
StemPro Osteogenesis Differentiation KitGibcoA1007201
Sterile connector with one spike with needle injection siteOrigen Biomedical Connector, USANACode mark: IBS
Trypan blue solution 0.4%Sigma Aldrich93595
Trypsin-EDTA 0.25% 1x, phenol redGibco25200056

参考文献

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