Tecnica per ottenere cellule staminali mesenchimali dal tessuto adiposo e dalla caratterizzazione della frazione vascolare stromale nella crioconservazione a lungo termine

Riepilogo

Il presente protocollo descrive una metodologia migliorata per l'isolamento ADSC con conseguente enorme resa cellulare con guadagno di tempo rispetto alla letteratura. Questo studio fornisce anche un metodo semplice per ottenere un numero relativamente elevato di cellule vitali dopo la crioconservazione a lungo termine.

Abstract

Le cellule staminali mesenchimali umane derivate dal tessuto adiposo sono diventate sempre più attraenti in quanto mostrano caratteristiche appropriate e sono una fonte accessibile per applicazioni cliniche rigenerative. Diversi protocolli sono stati utilizzati per ottenere cellule staminali derivate dal tessuto adiposo. Questo articolo descrive diversi passaggi di un protocollo migliorato che consente di risparmiare tempo per ottenere una quantità più significativa di ADSC, mostrando come crioconservare e scongelare ADSC per ottenere cellule vitali per l'espansione della coltura. Sono stati raccolti cento millilitri di lipoaspirato, utilizzando una liposuzione a siringa a tre fori e calibro 3 mm da 26 cm, dalla zona addominale di nove pazienti successivamente sottoposti a addominoplastica elettiva. L'isolamento delle cellule staminali è stato effettuato con una serie di lavaggi con soluzione salina tamponata fosfato (DPBS) di Dulbecco integrata con calcio e l'uso di collagenasi. Le cellule della frazione vascolare stromale (SVF) sono state crioconservate e la loro vitalità è stata controllata mediante immunofenotipizzazione. La resa cellulare SVF era 15,7 x 10⁵ cellule/ml, compresa tra 6,1-26,2 cellule/ml. Le cellule SVF aderenti hanno raggiunto la confluenza dopo una media di 7,5 (±4,5) giorni, con una resa cellulare media di 12,3 (± 5,7) x 10⁵ cellule/ml. La vitalità della SVF scongelata dopo 8 mesi, 1 anno e 2 anni variava tra il 23,06% e il 72,34% con una media del 47,7% (±24,64) con la vitalità più bassa correlata ai casi di congelamento a due anni. L'uso della soluzione DPBS integrata con calcio e tempi di riposo del sacchetto per la precipitazione dei grassi con un tempo più breve di digestione della collagenasi ha comportato un aumento della resa cellulare finale delle cellule staminali. La procedura dettagliata per ottenere alte rese di cellule staminali vitali era più efficiente per quanto riguarda il tempo e la resa cellulare rispetto alle tecniche degli studi precedenti. Anche dopo un lungo periodo di crioconservazione, cellule ADSC vitali sono state trovate nella SVF.

Introduzione

Le cellule staminali mesenchimali umane sono vantaggiose sia nella ricerca di base che in quella applicata. L'uso di questo tipo di cellula adulta supera le questioni etiche - rispetto all'uso di cellule embrionali o di altro tipo - essendo una delle aree di studio più promettenti nell'ingegneria della rigenerazione dei tessuti autologhi e nella terapia cellulare¹, come l'area neoplastica, il trattamento delle malattie degenerative e le applicazioni terapeutiche nell'area della chirurgia ricostruttiva ^{2,3,4, 5}. È stato precedentemente riportato che esiste un'abbondante fonte di cellule staminali mesenchimali multipotenti e pluripotenti nella frazione vascolare stromale del tessuto adiposo ^6,7. Questi ADSC sono considerati ottimi candidati per l'uso nella terapia cellulare e nel trapianto/infusione poiché un numero considerevole di cellule con una forte capacità di espansione ex vivo può essere facilmente ottenuto con un alto rendimento da una procedura minimamente invasiva ^5,8.

È stato inoltre dimostrato che il tessuto adiposo presenta una maggiore capacità di fornire cellule staminali mesenchimali rispetto ad altre due fonti (midollo osseo e tessuto del cordone ombelicale)⁹. Oltre ad essere scarsamente immunogenico e ad avere un'elevata capacità di integrarsi nel tessuto ospite e di interagire con i tessuti circostanti^4,10, l'ADSC ha una capacità multipotente di differenziazione in linee cellulari, con segnalazioni di differenziazione condrogena, osteogenica e miogenica in appropriate condizioni di coltura^11,12,13, e in cellule, come pancreatiche, epatociti^, e cellule neurogeniche^14,15,16.

La comunità scientifica concorda sul fatto che l'effetto immunomodulatore delle cellule staminali mesenchimali è un meccanismo d'azione più rilevante per la terapia cellulare^17,18,19 rispetto alla loro proprietà di differenziazione. Uno dei meriti più significativi dell'uso dell'ADSC è la possibilità di infusione autologa o innesto, diventando un trattamento alternativo per diverse malattie. Per la medicina rigenerativa, gli ADSC sono già stati utilizzati in caso di danno epatico, ricostruzione del muscolo cardiaco, rigenerazione del tessuto nervoso, miglioramento della funzione del muscolo scheletrico, rigenerazione ossea, terapia del cancro e trattamento del diabete^20,21.

Ad oggi, ci sono 263 studi clinici registrati per la valutazione del potenziale di ADSC, elencati sul sito web del National Institutes of Health degli Stati Uniti²². Sono stati stabiliti diversi protocolli per la raccolta del tessuto adiposo, ma non c'è consenso in letteratura su un metodo standardizzato per isolare l'ADSC per uso clinico^23,24. I metodi di lavorazione del lipoaspirato durante e dopo l'intervento chirurgico possono influenzare direttamente la vitalità cellulare, la resa cellulare finale²⁵ e la qualità della popolazione ADSC²⁰. Per quanto riguarda il pretrattamento chirurgico, non è ben stabilito quale tecnica di pretrattamento chirurgico produca un numero più significativo di cellule vitali dopo l'isolamento o se la soluzione anestetica iniettata nel tessuto adiposo influenzi la resa cellulare e le sue funzioni²⁶. Allo stesso modo, la differenza tra le tecniche per ottenere cellule adipose può portare a una diminuzione fino al 70% del numero di ADSC²⁰ vitali. Secondo la letteratura, i trattamenti meccanici per ottenere popolazioni cellulari con elevata vitalità, compresi gli ultrasuoni, dovrebbero essere evitati, poiché possono abbattere il tessuto adiposo²⁰. Tuttavia, il metodo manuale di aspirazione del grasso con siringhe è meno dannoso, causando meno distruzione cellulare, con la liposuzione tumescente che produce un numero significativo di cellule con la migliore qualità²⁶.

Questa tecnica utilizza una soluzione salina con lidocaina ed epinefrina che viene iniettata nell'area di liposuzione. Per ogni volume di 3 mL di soluzione iniettata, viene aspirato 1 mL. In questo studio è stata eseguita la tecnica di liposuzione umida, in cui per ogni 1 ml di soluzione adrenalinica e salina iniettata, vengono aspirati 0,2 ml di tessuto adiposo. L'uso di enzimi digestivi, in particolare la collagenasi, è comune per il processo di isolamento dell'ADSC.

Dopo la prima fase di isolamento in laboratorio, il pellet finale viene chiamato frazione vascolare stromale (SVF). Contiene diversi tipi di cellule²⁷, tra cui cellule precursori endoteliali, cellule endoteliali, macrofagi, cellule muscolari lisce, linfociti, periciti, pre-adipociti e ADSC, che sono in grado di aderire. Una volta concluso l'isolamento finale da colture in vitro , le cellule che non hanno aderito alla plastica vengono eliminate in scambi medi. Dopo otto settimane di espansione, cambiamenti di mezzo e passaggi, gli ADSC rappresentano la maggior parte della popolazione cellulare nei palloni²⁰. Uno dei vantaggi più significativi dell'utilizzo di cellule staminali derivate dal tessuto adiposo isolato per una possibile terapia futura è la possibilità di crioconservazione. È stato dimostrato che il lipoaspirato crioconservato è una potenziale fonte di cellule SVF anche dopo 6 settimane di congelamento²⁸, con attività biologica anche dopo 2 anni di crioconservazione²⁹, e piena capacità di crescere e differenziarsi in coltura³⁰. Tuttavia, durante il processo di scongelamento, una percentuale considerevole di cellule viene solitamente persa³¹. Pertanto, il processo di rimozione del lipoaspirato e i seguenti metodi di isolamento cellulare devono garantire la massima resa cellulare.

Questo studio descrive una metodologia più rapida per la raccolta e l'isolamento dell'ADSC, dimostrando un'elevata resa cellulare e vitalità per una migliore efficienza delle terapie cellulari. Inoltre, è stato valutato l'effetto di questa tecnica migliorata dopo la crioconservazione SVF a lungo termine.

Protocollo

Il presente studio è approvato dal Comitato Etico dell'UNIFESP (numero di protocollo: 0029/2015 CAAE: 40846215.0.0000.5505), eseguito dopo aver ottenuto il consenso informato scritto dei pazienti secondo la Dichiarazione di Helsinki (2004). Il campione del presente studio è composto da nove pazienti di sesso femminile, di età compresa tra 33 e 50 anni (età media 41,5) e indice di massa corporea iniziale medio (BMI) di 24,54 (compreso tra 22,32-26,77) (Tabella 1) che sono state sottoposte a addominoplastica estetica a causa dell'eccesso di pelle dopo gravidanze, presso la Divisione di Chirurgia Plastica dell'Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP), Brasile. Per ridurre i pregiudizi, i pazienti sono stati selezionati come un gruppo omogeneo considerando sesso, età e BMI. I set di dati utilizzati e / o analizzati durante questo studio sono disponibili presso l'autore corrispondente su ragionevole richiesta.

1. Raccolta di lipoaspirato

NOTA: questo passaggio deve essere eseguito nel centro chirurgico.

1. Utilizzare clorexidina gluconato al 4% (vedere la tabella dei materiali) per la preparazione della pelle e l'asepsi.
   1. Eseguire un'incisione cutanea sottocutanea di 2 mm (tra il sottoderma e l'aponeurosi). Inserire una cannula Klein di 26 mm 3 G a tre fori e calibro 3 mm e una siringa per iniettare un volume totale di 500 mL di una soluzione di adrenalina (1 mg/ml) (vedi Tabella dei materiali) diluita in soluzione salina (1:1.000.000) nell'area infraombelicale.
2. Collegare una siringa da 60 ml a una cannula per liposuzione a tre fori da 26 mm 3 G e calibro 3 mm e inserirla attraverso l'incisione cutanea, bloccando lo stantuffo per creare un vuoto.
   1. Effettuare movimenti di spinta e trazione in modo che, con il vuoto creato, il lipoaspirato rimanga nella siringa da 60 ml.
3. Utilizzando un connettore sterile con una valvola, trasferire i 100 ml del lipoaspirato raccolto in una sacca di trasferimento di cloruro di polivinile da 150 ml (vedere Tabella dei materiali).
   1. Imballare il sacchetto di trasferimento in una scatola di polistirolo a temperatura ambiente (~25 °C) e portarlo immediatamente in laboratorio. Non impiegare più di 30 minuti per iniziare la lavorazione del tessuto.

2. Lavorazione del lipoaspirato

NOTA: questo passaggio deve essere eseguito in laboratorio.

1. In primo luogo, pesare il sacchetto, misurare la temperatura con un termometro clinico digitale a infrarossi senza contatto e lasciare riposare il sacchetto per 5 minuti all'interno della camera a flusso laminare per la precipitazione degli strati più grassi (bolle) e la separazione dei tessuti contenenti le cellule di interesse.
   1. Eseguire una serie di lavaggi di tessuti. Primo lavaggio: iniettare 100 ml di DPBS con calcio (1x) nella sacca di trasferimento e mescolare con le mani.
   2. Lasciare riposare per 5 minuti e rimuovere la maggior parte del liquido basale che precipita.
   3. Gettare il liquido basale con una siringa da 60 mL collegata all'adattatore per la borsa. Questo processo deve essere ripetuto due volte.
2. Aggiungere 100 mL di soluzione digestiva nella sacca (93 mL di DPBS privo di calcio + 60 μL di cloruro di calcio (1 g/L) + 7 mL di collagenasi sterile allo 0,075%, vedere Tabella dei materiali) e lasciare a 37 °C per 30 minuti agitando lentamente.
3. Trasferire tutto il contenuto del sacchetto in quattro tubi conici da 50 ml e centrifugarli a 400 x g a 22 °C per 10 minuti.
   1. Rimuovere e scartare il surnatante e aggiungere 5 ml di glucosio basso contenuto di glucosio modificato di Eagle (DMEM) di Dulbecco integrato con il 20% di FBS (siero bovino fetale) al pellet cellulare (Figura 1).

3. Conteggio delle cellule SVF

1. Mescolare una soluzione fresca di 10 μL di blu di tripano allo 0,05% in acqua distillata con 10 μL di sospensione cellulare per 5 minuti.
2. Contare le cellule vitali in una camera di conteggio delle cellule Neubauer³² usando un microscopio a luce invertita (vedi Tabella dei materiali) con un ingrandimento di 20x.
3. Risospendere il pellet cellulare in un mezzo crioprotettivo (5 mL di FBS + 10% di Dimetil Solfossido - DMSO) ad una concentrazione di 1 x 10⁶ cellule/ml.
4. Introdurre 1 mL di questa miscela in crioviali. Utilizzare un contenitore di congelamento (vedere la tabella dei materiali) con una velocità di raffreddamento compresa tra (1 °C/min e -80 °C).
   1. Conservare a -80 °C per 1 anno.
   2. Trascorso questo tempo, conservare in scatole standard immerse nella fase vapore di azoto liquido (-165 °C).

4. Processo di scongelamento delle cellule

1. Rimuovere i flaconcini dall'azoto liquido e metterli immediatamente nel bagnomaria a 37 °C per 1 minuto.
2. Porre le cellule SVF in un tubo conico con 4 mL di DMEM (basso glucosio integrato con 20% FBS) preriscaldato a 37 °C.
3. Centrifugare a 400 x g a 22 °C per 5 min.
4. Rimuovere il surnatante e aggiungere 1 mL di DMEM (basso contenuto di glucosio) + 10% FBS. Eseguire l'immunofenotipizzazione seguendo i passaggi seguenti.

5. Tecnica di citometria a flusso (marcatura multipla di immunofenotipi)

1. Introdurre 1 mL di pellet cellulare (concentrazione di 1.000 cellule/μL) in cinque provette citometriche (200 μL ciascuna).
2. Centrifugare a 400 x g a 22 °C per 5 minuti ed eliminare il surnatante con una pipetta.
3. Aggiungere 300 μL di soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) (10x), centrifugare a 400 x g a 22 °C ed eliminare il surnatante con una pipetta.
4. Preparare cinque provette per diverse combinazioni di marcatori come segue: 5 μL di CD11B/5 μL di CD19/20 μL di CD45; 5 μL di CD73/20 μL di CD90/5 μL di CD105/20 μL di CD45; 20 μL di CD34/5 μL di HLA-DR/20 μL di CD45; Saggio di vitalità cellulare-5 μL di colorante reattivo fluorescente. (vedi Tabella dei materiali) e un tubo con celle non colorate e PBS come controllo negativo. Omogeneizzare in un vortice e incubare a 4 °C per 30 min.
   1. Centrifugare a 400 x g a 22 °C per 5 minuti, scartare il surnatante con una pipetta, aggiungere 500 μL di PBS (10x) e procedere con la selezione cellulare.
      NOTA: Cinquemila eventi vengono acquisiti per ogni set di anticorpi nel citometro a flusso di quattro colori e cinque parametri e analizzati con il software CellQuest.

6. Semina del passaggio 1 (P1)

1. Seme 2 x 10⁵ cellule in un matraccio di coltura di 75 cm² .
2. Aggiungere 12 ml di DMEM a basso contenuto di glucosio + 20% di FBS + 10% di antibiotico / antimicotico (con 10.000 unità di penicillina, 10 mg di streptomicina e 25 μg di amfotericina B per ml, 0,1 μm).
3. Quando le cellule raggiungono tra l'80% e il 90% di confluenza, eseguire la tripsinizzazione delle cellule aderenti con 2 ml di EDTA-tripsina allo 0,25% per 3 minuti.
4. Contare nuovamente le celle (come indicato nel passaggio 3).
5. Eseguire nuovamente l'immunofenotipizzazione (come menzionato nella fase 5).

7. Analisi statistica

1. Utilizzare la calcolatrice Rho³³ di Spearman per misurare la forza di associazione tra le seguenti variabili con P < 0,05, come indicato di seguito.
   1. Selezionare la resa cellulare SVF e il numero di giorni in cui SVF rimane in coltura nel primo passaggio (P1) fino alla confluenza dell'80%-90% (giorni a P1).
   2. Selezionare la resa cellulare SVF prima e dopo essere passati a P1.
   3. Considera i giorni a P1 e la resa cellulare prima di andare a P1.
   4. Selezionare la resa cellulare SVF con la percentuale media di ADSC confermata.
   5. Calcola la percentuale di ADSC confermata e la resa cellulare prima di passare a P1.
   6. Determinare la resa cellulare BMI e SVF.

8. Saggio di differenziazione

1. Eseguire il test di differenziazione seguendo un protocollo del kit di differenziazione (vedere Tabella dei materiali). Nella Figura 4 vengono illustrati i risultati del Caso 1.

Risultati

La caratterizzazione dei nove individui studiati, compresa la loro età, peso, altezza e BMI, sono mostrati nella Tabella 1.

In base alla resa cellulare inizialmente presentata, il volume cellulare inoculato in coltura è stato calcolato per essere il più vicino possibile alla capacità del matraccio di coltura da 75 cm². Il volume campione seminato in ciascun caso è descritto nella tabella 2. Quindi, in base alla resa cellulare iniziale, è stato...

Discussione

Resa di isolamento
E' assodato che il processo di crioconservazione, frequentemente richiesto nella terapia cellulare, comporta una significativa perdita cellulare, talvolta superiore al 50%29,30,35. Pertanto, un miglioramento tecnico per ottenere un'elevata resa cellulare iniziale in isolamento è fondamentale. Il metodo di raccolta del lipoaspirato e il metodo di isolamento delle cellule devono concentrarsi...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.8 mL cryovials	Nunc Thermo Fisher Scientific	340711
150 mL polyvinyl chloride transfer bag	JP FARMA	80146150059
2% Alizarin Red S Solution, pH 4.2	Sigma Aldrich	A5533
Adrenaline (1 mg/mL)	Hipolabor	NA
Alcian Blue solution	Sigma Aldrich	1,01,647
Antibiotic-Antimycotic 100x	Gibco	15240062
BD FACSCalibur Flow Cytometer using BD CellQues Pro Analysis	BD BioSciences	NA
Calcium chloride 10%	Merck	102379
Chlorhexidine gluconate 4%	VIC PHARMA	NA
Collagenase, Type I, powder	Gibco	17018029
DMEM (Dulbecco's modified Eagle's medium)	Gibco	11966025
DPBS no calcium, no magnesium (Dulbecco's Phosphate Buffered Saline Gibco Cell Therapy Systems)	Gibco	A1285801
DPBS with calcium (Dulbecco's Phosphate Buffered Saline Gibco Cell Therapy Systems)	Gibco	A1285601
Fetal bovine serum	Gibco	10500056
Formaldehyde 4%	Sigma Aldrich	1,00,496
Inverted light microscope	Nikon Eclipse TS100	NA
Live and Dead Cell Assay	Thermofisher	01-3333-41 | 01-3333-42
Monoclonal antibody: CD105	BD BioSciences	745927
Monoclonal antibody: CD11B	BD BioSciences	746004
Monoclonal antibody: CD19	BD BioSciences	745907
Monoclonal antibody: CD34	BD BioSciences	747822
Monoclonal antibody: CD45	DAKO	M0701
Monoclonal antibody: CD73	BD BioSciences	746000
Monoclonal antibody: CD90	BD BioSciences	553011
Monoclonal antibody: HLA-DR	BD BioSciences	340827
Mr. Frosty Freezing Container	Thermo Fisher Scientific	5100-0001
PBS (phosphate buffered saline) 1x pH 7.4	Gibco	10010023
StemPro Adipogenesis Differentiation Kit	Gibco	A1007001
StemPro Chondrogenesis Differentiation Kit	Gibco	A1007101
StemPro Osteogenesis Differentiation Kit	Gibco	A1007201
Sterile connector with one spike with needle injection site	Origen Biomedical Connector, USA	NA	Code mark: IBS
Trypan blue solution 0.4%	Sigma Aldrich	93595
Trypsin-EDTA 0.25% 1x, phenol red	Gibco	25200056