АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Настоящий протокол описывает улучшенную методологию изоляции ADSC, приводящую к огромному клеточному выходу с увеличением времени по сравнению с литературой. Это исследование также предоставляет простой метод получения относительно большого количества жизнеспособных клеток после длительной криоконсервации.

Аннотация

Мезенхимальные стволовые клетки человека, полученные из жировой ткани, становятся все более привлекательными, поскольку они демонстрируют соответствующие особенности и являются доступным источником для регенеративных клинических применений. Различные протоколы были использованы для получения стволовых клеток, полученных из жировой ткани. В этой статье описываются различные этапы улучшенного протокола экономии времени для получения более значительного количества ADSC, показывая, как криоконсервировать и размораживать ADSC для получения жизнеспособных клеток для расширения культуры. Сто миллилитров липоаспирата были собраны с помощью липосакции шприца калибра 26 см и калибра 3 мм из области живота девяти пациентов, которые впоследствии прошли плановую абдоминопластику. Выделение стволовых клеток проводилось серией промывок раствором фосфатного буферного физиологического раствора (DPBS) Dulbecco, дополненным кальцием, и использованием коллагеназы. Клетки стромальной сосудистой фракции (SVF) были криоконсервированы, и их жизнеспособность была проверена иммунофенотипированием. Клеточный выход SVF составлял 15,7 x 105 клеток/мл, в диапазоне от 6,1 до 26,2 клеток/мл. Адгезивные клетки SVF достигали слияния в среднем через 7,5 (±4,5) дней, со средним клеточным выходом 12,3 (± 5,7) х 105 клеток / мл. Жизнеспособность размороженного SVF через 8 месяцев, 1 год и 2 года колебалась между 23,06%-72,34% в среднем 47,7% (±24,64) с самой низкой жизнеспособностью, коррелирующей со случаями двухлетней заморозки. Использование раствора DPBS, дополненного кальцием и временем отдыха мешков для осаждения жира с более коротким временем переваривания коллагеназы, привело к увеличению конечного клеточного выхода стволовых клеток. Детальная процедура получения высоких урожаев жизнеспособных стволовых клеток была более эффективной с точки зрения времени и клеточного выхода, чем методы из предыдущих исследований. Даже после длительного периода криоконсервации в SVF были обнаружены жизнеспособные клетки ADSC.

Введение

Мезенхимальные стволовые клетки человека выгодны как в фундаментальных, так и в прикладных исследованиях. Использование этого типа взрослых клеток преодолевает этические вопросы по сравнению с использованием эмбриональных или других клеток, являясь одним из наиболее перспективных направлений исследований в области инженерии регенерации аутологичных тканей и клеточной терапии1, таких как опухолевая область, лечение дегенеративных заболеваний и терапевтические применения в области реконструктивной хирургии 2,3,4, 5. Ранее сообщалось, что существует обильный источник мезенхимальных мультипотентных и плюрипотентных стволовых клеток в стромальной сосудистой клеточной фракции жировой ткани 6,7. Эти ADSC считаются отличными кандидатами для использования в клеточной терапии и трансплантации / инфузии, поскольку значительное количество клеток с сильной способностью к расширению ex vivo может быть легко получено с высоким выходом из минимально инвазивной процедуры 5,8.

Было также продемонстрировано, что жировая ткань обладает большей способностью обеспечивать мезенхимальные стволовые клетки, чем два других источника (ткань костного мозга и пуповины)9. Помимо того, что ADSC плохо иммуногенен и обладает высокой способностью интегрироваться в ткань хозяина и взаимодействовать с окружающими тканями 4,10, ОН обладает мультипотентной способностью дифференцировки в клеточные линии, с сообщениями о хондрогенной, остеогенной и миогенной дифференцировке в соответствующих условиях культивирования 11,12,13, и в клетки, такие как поджелудочная железа, гепатоциты, и нейрогенные клетки 14,15,16.

Научное сообщество сходится во мнении, что иммуномодулирующее действие мезенхимальных стволовых клеток является более актуальным механизмом действия клеточной терапии 17,18,19, чем их свойство дифференцировки. Одним из наиболее значимых достоинств применения ADSC является возможность аутологичной инфузии или пересадки, становящейся альтернативным лечением нескольких заболеваний. Для регенеративной медицины ADSC уже применялись в случаях повреждения печени, реконструкции сердечной мышцы, регенерации нервной ткани, улучшения функции скелетных мышц, регенерации костей, терапии рака и лечения диабета20,21.

На сегодняшний день зарегистрировано 263 клинических испытания для оценки потенциала ADSC, перечисленных на веб-сайте Национальных институтов здоровья22 США. Были установлены различные протоколы сбора жировой ткани, но в литературе нет единого мнения о стандартизированном методе выделения ADSC для клинического использования23,24. Методы обработки липоаспирата во время и после операции могут непосредственно влиять на жизнеспособность клеток, конечный клеточный выход25 и качество популяции ADSC20. Что касается хирургического предварительного лечения, то не установлено, какой хирургический метод предварительного лечения дает более значительное количество жизнеспособных клеток после выделения или влияет ли раствор анестетика, введенный в жировую ткань, на выход клеток и их функции26. Аналогичным образом, разница между методами получения жировых клеток может привести к 70% уменьшению количества жизнеспособных ADSC20. Согласно литературе, следует избегать механических методов лечения для получения клеточных популяций с высокой жизнеспособностью, включая ультразвук, поскольку они могут разрушить жировуюткань 20. Тем не менее, ручной метод аспирации жира со шприцами менее вреден, вызывая меньшее разрушение клеток, при этом тумесцентная липосакция дает значительное количество клеток с лучшим качеством26.

В этой методике используется солевой раствор с лидокаином и адреналином, который вводится в область липосакции. На каждые 3 мл объема вводимого раствора аспирируется 1 мл. В этом исследовании была выполнена методика влажной липосакции, при которой на каждый 1 мл введенного адреналина и физиологического раствора аспирируется 0,2 мл жировой ткани. Использование пищеварительных ферментов, особенно коллагеназы, является общим для процесса выделения ADSC.

После первого этапа выделения в лаборатории конечная гранула называется стромальной сосудистой фракцией (SVF). Он содержит различные типы клеток27, включая эндотелиальные клетки-предшественники, эндотелиальные клетки, макрофаги, гладкомышечные клетки, лимфоциты, перициты, преадипоциты и ADSC, которые способны к адгезии. Как только окончательное выделение заключено из культур in vitro , клетки, которые не прилипли к пластику, удаляются в средах обмена. После восьми недель расширения, средних изменений и проходов, ADSC представляют большую часть клеточной популяции в колбах20. Одним из наиболее значительных преимуществ использования изолированных стволовых клеток, полученных из жировой ткани, для возможной будущей терапии является возможность криоконсервации. Было продемонстрировано, что криоконсервированный липоаспират является потенциальным источником SVF-клеток даже после 6 недель замораживания28, с биологической активностью даже после 2 лет криоконсервации29 и полной способностью расти и дифференцироваться в культуре30. Однако в процессе оттаивания значительного процента клеток обычно теряется31. Поэтому процесс удаления липоаспирата и следующие методы изоляции клеток должны обеспечивать самый высокий выход клеток.

Это исследование описывает более быструю методологию сбора и изоляции ADSC, демонстрирующую высокий клеточный выход и жизнеспособность для повышения эффективности клеточной терапии. Кроме того, был оценен эффект этого улучшенного метода после длительной криоконсервации SVF.

протокол

Настоящее исследование одобрено Комитетом по этике UNIFESP (протокольный номер: 0029/2015 CAAE: 40846215.0.0000.5505), выполнено после получения письменного информированного согласия от пациентов в соответствии с Хельсинкской декларацией (2004). Выборка настоящего исследования состоит из девяти пациенток в возрасте 33-50 лет (средний возраст 41,5) и среднего начального индекса массы тела (ИМТ) 24,54 (в диапазоне от 22,32 до 26,77) (таблица 1), которые прошли эстетическую абдоминопластику из-за избытка кожи после беременности, в отделении пластической хирургии Федерального университета Сан-Паулу (UNIFESP), Бразилия. Чтобы уменьшить предвзятость, пациенты были выбраны как однородная группа с учетом пола, возраста и ИМТ. Наборы данных, использованные и/или проанализированные в ходе данного исследования, доступны у соответствующего автора по обоснованному запросу.

1. Сбор липоаспирата

ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг должен быть выполнен в хирургическом центре.

  1. Используйте 4% хлоргексидина глюконат (см. Таблицу материалов) для подготовки кожи и асептики.
    1. Выполняют подкожный разрез 2 мм (между поддермой и апоневрозом). Вставьте канюлю Klein калибра 26 мм 3 G и калибра 3 мм и шприц для введения общего объема 500 мл адреналинового раствора (1 мг/мл) (см. Таблицу материалов), разбавленного в физиологическом растворе (1:1 000 000) в подрамниковой области.
  2. Подключите шприц объемом 60 мл к канюле для липосакции калибра 26 мм 3 G и калибра 3 мм и вставьте ее через разрез кожи, зафиксировав поршень для создания вакуума.
    1. Делайте толкающие и тянущие движения так, чтобы при создании вакуума липоаспират оставался в шприце объемом 60 мл.
  3. Используя стерильный соединитель с клапаном, переведите 100 мл собранного липоаспирата в мешок для переноса поливинилхлорида объемом 150 мл (см. Таблицу материалов).
    1. Упакуйте мешок для переноски в полистирольную коробку при комнатной температуре (~25 °C) и немедленно отнесите его в лабораторию. Не потратьте больше 30 минут, чтобы начать обработку тканей.

2. Переработка липоаспирата

ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг должен быть выполнен в лаборатории.

  1. Сначала взвесьте мешок, измерьте температуру с помощью цифрового бесконтактного инфракрасного клинического термометра и оставьте мешок лежать в течение 5 минут внутри ламинарной проточной камеры для осаждения более жирных слоев (пузырьков) и разделения тканей, содержащих интересующие клетки.
    1. Выполните серию промывок тканей. Первая стирка: введите 100 мл DPBS с кальцием (1x) в переносной мешок и перемешайте его руками.
    2. Дайте ему постоять 5 минут и удалите большую часть базальной жидкости, которая выпадает в осадок.
    3. Выбросьте базальную жидкость с помощью шприца объемом 60 мл, прикрепленного к адаптеру для мешка. Этот процесс необходимо повторить дважды.
  2. Добавить в пакет 100 мл раствора для пищеварения (93 мл безкальциевого DPBS + 60 мкл хлористого кальция (1 г/л) + 7 мл 0,075% стерильной коллагеназы, см. Таблицу материалов) и оставить при 37 °C в течение 30 мин при медленном перемешивании.
  3. Переложите все содержимое мешка в четыре конические трубки по 50 мл и центрифугируйте их при 400 х г при 22 °C в течение 10 мин.
    1. Удалите и выбросьте супернатант и добавьте 5 мл модифицированной среды Dulbecco Eagle's medium (DMEM) с низким содержанием глюкозы, дополненной 20% FBS (фетальной бычьей сывороткой) в клеточную гранулу (рисунок 1).

3. Подсчет SVF ячеек

  1. Смешайте свежий раствор 10 мкл трипан-синего под 0,05% в дистиллированной воде с 10 мкл клеточной суспензии в течение 5 мин.
  2. Подсчитайте жизнеспособные клетки в камере32 подсчета клеток Нойбауэра с помощью инвертированного светового микроскопа (см. Таблицу материалов) при 20-кратном увеличении.
  3. Повторно суспендируют клеточную гранулу в криопротекторной среде (5 мл FBS + 10% диметилсульфоксида - DMSO) в концентрации 1 х 106 клеток/мл.
  4. Поместите 1 мл этой смеси в криовиалы. Используйте морозильный контейнер (см. Таблицу материалов) со скоростью охлаждения (от 1 °C/мин до -80 °C).
    1. Хранить при -80 °C в течение 1 года.
    2. По истечении этого времени хранить в стандартных кассетных коробках, погруженных в фазу паров жидкого азота (-165 °C).

4. Процесс оттаивания клеток

  1. Извлеките флаконы из жидкого азота и поместите их сразу на водяную баню при температуре 37 °C на 1 мин.
  2. Поместите клетки SVF в коническую трубку с 4 мл DMEM (низкий уровень глюкозы, дополненный 20% FBS), предварительно нагретый при 37 °C.
  3. Центрифуга при 400 х г при 22 °C в течение 5 мин.
  4. Удалите супернатант и добавьте 1 мл DMEM (низкий уровень глюкозы) + 10% FBS. Выполните иммунофенотипирование, выполнив следующие действия.

5. Метод проточной цитометрии (множественная маркировка иммунофенотипов)

  1. Поместите 1 мл клеточной гранулы (концентрация 1000 клеток/мкл) в пять пробирок для цитометрии (по 200 мкл каждая).
  2. Центрифугу при 400 х г при 22 °С в течение 5 мин и выбросьте супернатант с пипеткой.
  3. Добавьте 300 мкл фосфатно-буферного физиологического раствора (PBS) (10x), центрифугу при 400 x g при 22 °C и выбросьте супернатант с пипеткой.
  4. Подготовьте пять пробирок для различных комбинаций маркеров следующим образом: 5 мкл CD11B/5 мкл CD19/20 мкл CD45; 5 мкл CD73/20 мкл CD90/5 мкл CD105/20 мкл CD45; 20 мкл CD34/5 мкл HLA-DR/20 мкл CD45; Анализ жизнеспособности клеток - 5 мкл флуоресцентного реакционноспособного красителя. (см. Таблицу материалов) и трубку с неиспорченными клетками и PBS в качестве отрицательного контроля. Гомогенизируют в вихре и инкубируют при 4 °C в течение 30 мин.
    1. Центрифугу при 400 х г при 22 °C в течение 5 мин, выбросьте супернатант с пипеткой, добавьте 500 мкл PBS (10x) и приступайте к сортировке ячеек.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Пять тысяч событий приобретаются на каждое антитело, установленное в проточном цитометре четырех цветов и пяти параметров, и анализируются с помощью программного обеспечения CellQuest.

6. Посев прохода 1 (Р1)

  1. Семена 2 х 105 клеток в культуральной колбе 75см2 .
  2. Добавьте 12 мл DMEM с низким содержанием глюкозы + 20% FBS + 10% антибиотика / антимикотика (с 10 000 единиц пенициллина, 10 мг стрептомицина и 25 мкг амфотерицина B на мл, 0,1 мкм).
  3. Когда клетки достигнут 80%-90% слияния, выполняют трипсинизацию адгезивных клеток 2 мл 0,25% ЭДТА-трипсина в течение 3 мин.
  4. Снова подсчитайте ячейки (как упоминалось в шаге 3).
  5. Снова выполните иммунофенотипирование (как упоминалось в шаге 5).

7. Статистический анализ

  1. Используйте Rho Calculator33 Спирмена для измерения силы связи между следующими переменными с P < 0,05, как указано ниже.
    1. Выберите выход клеток SVF и количество дней, в течение которых SVF остается в культуре в первом прохождении (P1) до 80%-90% слияния (дней до P1).
    2. Выберите выход сотовой связи SVF до и после перехода на P1.
    3. Рассмотрите дни до P1 и клеточный выход, прежде чем перейти к P1.
    4. Выберите выход сотовой связи SVF со средним процентом подтвержденного ADSC.
    5. Рассчитайте процент подтвержденного ADSC и клеточный выход перед переходом к P1.
    6. Определите имт и SVF клеточный выход.

8. Дифференциация

  1. Выполните анализ дифференцировки в соответствии с протоколом дифференциационного набора (см. Таблицу материалов). На рисунке 4 показаны результаты для случая 1.

Результаты

Характеристика девяти изученных лиц, включая их возраст, вес, рост и ИМТ, приведена в таблице 1.

В соответствии с первоначально представленным клеточным выходом, объем клеток, привитых в культуре, был рассчитан как максимально приближенный к емкости колбы культу?...

Обсуждение

Выход изоляции
Хорошо известно, что процесс криоконсервации, часто необходимый в клеточной терапии, приводит к значительной потере клеток, иногда превышающей 50%29,30,35. Таким образом, техническое усовершенствование для получе...

Раскрытие информации

Авторы заявляют об отсутствии конкурирующих финансовых интересов.

Благодарности

Мы благодарим пациентов, которые вызвались принять участие, а также медицинский и сестринский персонал больницы Сан-Паулу. Это исследование было поддержано Фондом организации ампаро в Пескизе Сан-Паулу (ФАПЕСП) и Национальным советом по вопросам образования и развития (CNPq), Бразилия.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
1.8 mL cryovialsNunc Thermo Fisher Scientific340711
150 mL polyvinyl chloride transfer bagJP FARMA80146150059
2% Alizarin Red S Solution, pH 4.2Sigma AldrichA5533
Adrenaline (1 mg/mL)HipolaborNA
Alcian Blue solutionSigma Aldrich1,01,647
Antibiotic-Antimycotic 100xGibco15240062
BD FACSCalibur Flow Cytometer using BD CellQues Pro AnalysisBD BioSciencesNA
Calcium chloride 10%Merck102379
Chlorhexidine gluconate 4%VIC PHARMANA
Collagenase, Type I, powderGibco17018029
DMEM (Dulbecco's modified Eagle's medium)Gibco11966025
DPBS no calcium, no magnesium (Dulbecco's Phosphate Buffered Saline Gibco Cell Therapy Systems)GibcoA1285801
DPBS with calcium (Dulbecco's Phosphate Buffered Saline Gibco Cell Therapy Systems)GibcoA1285601
Fetal bovine serumGibco10500056
Formaldehyde 4%Sigma Aldrich1,00,496
Inverted light microscopeNikon Eclipse TS100NA
Live and Dead Cell AssayThermofisher01-3333-41 | 01-3333-42
Monoclonal antibody: CD105BD BioSciences745927
Monoclonal antibody: CD11BBD BioSciences746004
Monoclonal antibody: CD19BD BioSciences745907
Monoclonal antibody: CD34BD BioSciences747822
Monoclonal antibody: CD45DAKOM0701
Monoclonal antibody: CD73BD BioSciences746000
Monoclonal antibody: CD90BD BioSciences553011
Monoclonal antibody: HLA-DRBD BioSciences340827
Mr. Frosty Freezing ContainerThermo Fisher Scientific5100-0001
PBS (phosphate buffered saline) 1x pH 7.4Gibco 10010023
StemPro Adipogenesis Differentiation KitGibcoA1007001
StemPro Chondrogenesis Differentiation KitGibcoA1007101
StemPro Osteogenesis Differentiation KitGibcoA1007201
Sterile connector with one spike with needle injection siteOrigen Biomedical Connector, USANACode mark: IBS
Trypan blue solution 0.4%Sigma Aldrich93595
Trypsin-EDTA 0.25% 1x, phenol redGibco25200056

Ссылки

  1. Frese, L., Dijkman, P. E., Hoerstrup, S. P. Adipose tissue-derived stem cells in regenerative medicine. Transfusion Medicina and Hemotherapy. 43 (4), 268-274 (2016).
  2. Alperovich, M., et al. Adipose stem cell therapy in cancer reconstruction: a critical review. Annals of Plastic Surgery. 73, 104-107 (2014).
  3. Forcales, S. V. Potential of adipose-derived stem cells in muscular regenerative therapies. Frontiers in Aging Neuroscience. 7, 123 (2015).
  4. Bateman, M. E., Strong, A. L., Gimble, J. M., Bunnell, B. A. Concise review: using fat to fight disease: a systematic review of nonhomologous adipose-derived stromal/stem cell therapies. Stem Cells. 36 (9), 1311-1328 (2018).
  5. Gentile, P., Cervelli, V. Adipose-derived stromal vascular fraction cells and platelet- rich plasma: basic and clinical implications for tissue engineering therapies in regenerative surgery. Methods in Molecular Biology. 1773, 107-122 (2018).
  6. Schäffler, A., Büchler, C. Concise review: adipose tissue-derived stromal cells- basic and clinical implications for novel cell-based therapies. Stem Cells. 25 (4), 818-827 (2007).
  7. Witkowska-Zimny, M., Walenko, K. Stem cells from adipose tissue. Cellular & Molecular Biology Letters. 16, 236-257 (2011).
  8. Liew, L. J., Ong, H. T., Dilley, R. J. Isolation and culture of adipose-derived stromal cells from subcutaneous fat. Methods in Molecular Biology. 1627, 193-203 (2017).
  9. Fazzina, R., et al. Potency testing of mesenchymal stromal cell growth expanded in human platelet lysate from different human tissues. Stem Cell Research & Therapy. 7 (1), 122 (2016).
  10. Yarak, S., Okamoto, O. K. Human adipose-derived stem cells: Current challenges and clinical perspectives. Brazilian Annals of Dermatology. 85 (5), 647-656 (2010).
  11. Mizuno, H. Adipose-derived stem cells for tissue repair and regeneration: ten years of research and a literature review. Journal of Nippon Medical School. 76 (2), 56-66 (2009).
  12. Makarov, A. V., Arutyunyan, I. V., Bol'Shakova, G. B., Volkov, A. V., Gol'Dshtein, D. V. Morphological changes in paraurethral area after introduction of tissue engineering constructo on the basis of adipose tissue stromal cells. Bulletin of Experimental Biology and Medicine. 148 (4), 719-724 (2009).
  13. Simonacci, F., Bertozzi, N., Raposio, E. Off-label use of adipose-derived stem cells. Annals of Medicina and Surgery. 24, 44-51 (2017).
  14. Scanarotti, C., et al. Neurogenic-committed human pre-adipocytes express CYP1A isoforms. Chemico-Biological Interactions. 184 (3), 474-483 (2010).
  15. Aluigi, M. G., et al. Pre-adipocytes commitment to neurogenesis 1: Preliminary localisation of cholinergic molecules. Cell Biology International. 33 (5), 594-601 (2009).
  16. Coradeghini, R., et al. A comparative study of proliferation and hepatic differentiation of human adipose-derived stem cells. Cells Tissues Organs. 191 (6), 466-477 (2010).
  17. Xishan, Z., et al. Jagged-2 enhances immunomodulatory activity in adipose derived mesenchymal stem cells. Scientific Reports. 5, 14284 (2015).
  18. Debnath, T., Chelluri, L. K. Standardization and quality assessment for clinical grade mesenchymal stem cells from human adipose tissue. Hematology, Transfusion and Cell Therapy. 41 (1), 7-16 (2019).
  19. El-Sayed, M., et al. Immunomodulatory effect of mesenchymal stem cells: Cell origin and cell quality variations. Molecular Biology Reports. 46 (1), 1157-1165 (2019).
  20. Harasymiak-Krzyzanowska, I., et al. Adipose tissue-derived stem cells show considerable promise for regenerative medicine applications. Cellular & Molecular Biology Letters. 18 (4), 479-493 (2013).
  21. Lindroos, B., Suuronen, R., Miettinen, S. The potential of adipose stem cells in regenerative medicine. Stem Cell Reviews and Reports. 7 (2), 269-291 (2011).
  22. . US National Institutes of Health Website Available from: https://clinicaltrials.gov/ (2019)
  23. Baer, P. C., Geiger, H. Adipose-derived mesenchymal stromal/stem cells: Tissue localization, characterization, and heterogeneity. Stem Cells International. 2012, 812693 (2012).
  24. Raposio, E., Bertozzi, N. Isolation of ready-to-use adipose-derived stem cell (ASC) pellet for clinical applications and a comparative overview of alternate methods for ASC isolation. Current Protocols in Stem Cell Biology. 41, 1-12 (2017).
  25. Cucchiani, R., Corrales, L. The effects of fat harvesting and preparation, air exposure, obesity, and stem cell enrichment on adipocyte viability prior to graft transplantation. Aesthetic Surgery Journal. 36 (10), 1164-1173 (2016).
  26. Muscari, C., et al. Comparison between stem cells harvested from wet and dry lipoaspirates. Connective Tissue Research. 54 (1), 34-40 (2013).
  27. Bora, P., Majumdar, A. S. Adipose tissue-derived stromal vascular fraction in regenerative medicine: a brief review on biology and translation. Stem Cell Research & Therapy. 8 (1), 145 (2017).
  28. Zanata, F., et al. Effect of cryopreservation on human adipose tissue and isolated stromal vascular fraction cells: in vitro and in vivo analyses. Plastic and Reconstructive Surgery. 141 (2), (2018).
  29. Harris, D. Long-term frozen storage of stem cells: challenges and solutions. Journal of Biorepository Science for Applied Medicina. 4, 9-20 (2016).
  30. Minonzio, G., et al. Frozen adipose-derived mesenchymal stem cells maintain high capability to grow and differentiate. Cryobiology. 69 (2), 211-216 (2014).
  31. Devitt, S. M., et al. Successful isolation of viable adipose-derived stem cells from human adipose tissue subject to long-term cryopreservation positive implications for adult stem cell-based therapeutics in patients of advanced age. Stem Cells International. 2015, 146421 (2015).
  32. Freshney, R. I. . Culture of animal cells: a manual of basic technique. 3rd Ed. , (2001).
  33. . Spearman's Rho Calculator Available from: https://www.socscistatistics.com/tests/spearman/ (2020)
  34. Dominici, M., et al. Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. The International Society for Cellular Therapy position statement. Cytotherapy. 8 (4), 315-317 (2006).
  35. Irioda, A. C., et al. Human adipose-derived mesenchymal stem cells cryopreservation and thawing decrease α4-integrin expression. Stem Cells International. 2016, 2562718 (2016).
  36. Aust, L., et al. Yield of human adipose-derived adult stem cells from liposuction aspirates. Cytotherapy. 6 (1), 7-14 (2004).
  37. Pérez, L. M., et al. Altered metabolic and stemness capacity of adipose tissue-derived stem cells from obese mouse and human. PLoS One. 10 (4), 0123397 (2015).
  38. Yoshimura, K., et al. Characterization of freshly isolated and cultured cells derived from the fatty and fluid portions of liposuction aspirates. Journal of Cellular Physiology. 208 (1), 64-76 (2006).
  39. Mojallal, A., et al. Influence of age and body mass index on the yield and proliferation capacity of adipose-derived stem cells. Aesthetic Plastic Surgery. 35 (6), 1097-1105 (2011).
  40. Tevlin, R., et al. A novel method of human adipose-derived stem cell isolation with resultant increased cell yield. Plastic and Reconstructive Surgery. 138 (6), (2016).
  41. Tsekouras, A., et al. Comparison of the viability and yield of adipose-derived stem cells (ASCs) from different donor areas. In Vivo. 31 (6), 1229-1234 (2017).
  42. Varghese, J., Griffin, M., Mosahebi, A., Butler, P. Systematic review of patient factors affecting adipose stem cell viability and function: implications for regenerative therapy. Stem Cell Research & Therapy. 8 (1), 45 (2017).
  43. Mitchell, J. B., et al. Immunophenotype of human adipose-derived cells: temporal changes in stromal-associated and stem cell-associated markers. Stem Cells. 24 (2), 376-385 (2006).
  44. Huss, R. Perspectives on the morphology and biology of CD34-negative stem cells. Journal of Hematotherapy and Stem Cell Research. 9 (6), 783-793 (2000).
  45. Bourin, P., et al. Stromal cells from the adipose tissue-derived stromal vascular fraction and culture expanded adipose tissue-derived stromal/stem cells: a joint statement of the International Federation for Adipose Therapeutics (IFATS) and Science and the International Society for Cellular Therapy (ISCT). Cytotherapy. 15 (6), 641-648 (2013).
  46. Scherberich, A., Di Maggio, N., Mcnagny, K. M. A familiar stranger: CD34 expression and putative functions in SVF cells of adipose tissue. World Journal of Stem Cells. 5 (1), 1-8 (2013).
  47. Yu, G., et al. Yield and characterization of subcutaneous human adipose-derived stem cells by flow cytometric and adipogenic mRNA analyzes. Cytotherapy. 12 (4), 538-546 (2010).
  48. Meyerrose, T. E., et al. In vivo distribution of human adipose-derived mesenchymal stem cells in novel xenotransplantation models. Stem Cells. 25 (1), 220-227 (2007).
  49. Pilgaard, L., Lund, P., Rasmussen, J. G., Fink, T., Zachar, V. Comparative analysis of highly defined proteases for the isolation of adipose tissue-derived stem cells. Regenerative Medicina. 3 (5), 705-715 (2008).
  50. Browne, S. M., Al-Rubeai, M. Defining viability in mammalian cell cultures Defining viability in mammalian cell cultures. Biotechnolology Letters. 33, 1745-1749 (2011).
  51. Pogozhykh, D., et al. Influence of temperature fluctuations during cryopreservation on vital parameters, differentiation potential, and transgene expression of placental multipotent stromal cells. Stem Cell Research & Therapy. 8 (1), 66 (2017).
  52. Shaik, S., Wu, X., Gimble, J., Devireddy, R. Effects of decade long freezing storage on adipose derived stem cells functionality. Scientific Reports. 8 (1), 8162 (2018).
  53. Weissbein, U., Benvenisty, N., Ben-David, U. Genome maintenance in pluripotent stem cells. Journal of Cell Biology. 204 (2), 153-163 (2014).
  54. Francis, M. P., Sachs, P. C., Elmore, L. W., Holt, S. E. Isolating adipose-derived mesenchymal stem cells from lipoaspirate blood and saline fraction. Organogenesis. 6 (1), 11-14 (2010).
  55. Palumbo, P., et al. Methods of isolation, characterization and expansion of human Adipose-Derived Stem Cells (ASCs): An overview. International Journal of Molecular Sciences. 19 (7), 1897 (2018).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

178

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены