从脂肪组织和基质血管分数表征中获取间充质干细胞的技术在长期冷冻保存中的应用

摘要

与文献相比，本协议描述了一种改进的ADSC分离方法，从而在时间增益下产生巨大的细胞产量。本研究还为长期冷冻保存后获得相对大量的活细胞提供了一种直接的方法。

摘要

来源于脂肪组织的人间充质干细胞变得越来越有吸引力，因为它们显示出适当的特征，并且是再生临床应用的可及来源。不同的方案已被用于获得脂肪来源的干细胞。本文介绍了改进的节省时间方案的不同步骤，以获得更大量的ADSC，展示了如何冷冻保存和解冻ADSC以获得用于培养扩增的活细胞。使用26厘米三孔和3毫米口径的注射器吸脂术，从随后接受择期腹部成形术的9名患者的腹部收集100毫升脂吸物。干细胞分离是通过补充钙的Dulbecco磷酸盐缓冲盐水（DPBS）溶液和使用胶原酶进行一系列洗涤进行的。基质血管部分（SVF）细胞被冷冻保存，并通过免疫表型检查其活力。SVF 细胞产量为 15.7 x 10⁵ 个细胞/mL，范围在 6.1-26.2 个细胞/mL 之间。贴壁SVF细胞在平均7.5（±4.5）天后达到汇合，平均细胞产量为12.3（±5.7）x 10⁵ 个细胞/mL。解冻的SVF在8个月、1年和2年后的存活率在23.06%-72.34%之间，平均为47.7%（±24.64），最低的存活率与两年冻结病例相关。使用补充钙和袋休息时间的DPBS溶液进行脂肪沉淀，胶原酶消化时间更短，从而提高干细胞最终细胞产量。获得高产量活干细胞的详细程序在时间和细胞产量方面比以前研究的技术更有效。即使经过长时间的冷冻保存，在SVF中也发现了活的ADSC细胞。

引言

人间充质干细胞在基础和应用研究中都是有利的。与使用胚胎或其他细胞相比，这种成体细胞类型的使用超越了伦理问题，是自体组织再生工程和细胞治疗¹中最有前途的研究领域之一，例如肿瘤区域，退行性疾病的治疗以及重建手术领域的治疗应用²，³，^4，5.先前已有报道，脂肪组织^6，7的基质血管细胞部分中存在丰富的间充质多能和多能干细胞来源。这些ADSC被认为是用于细胞治疗和移植/输注的绝佳候选者，因为可以通过微创手术轻松获得大量具有强大体外扩增能力的细胞^5，8。

还表明，脂肪组织比其他两种来源（骨髓和脐带^{组织）具有}更大的间充质干细胞提供能力9。除了免疫原性差且具有整合到宿主组织中并与周围组织相互作用的高能力4，¹⁰外，ADSC还具有多能分化为细胞系的能力，据报道在适当的^{培养条件下进行}软骨，成骨和成骨分化，并进入细胞，例如胰腺，肝细胞^， 和神经源性细胞¹⁴，^15，16。

科学界一致认为，间充质干细胞的免疫调节作用是细胞治疗¹⁷，^18，19比其分化特性更相关的作用机制。ADSC使用的最显着优点之一是自体输注或移植的可能性，成为几种疾病的替代疗法。对于再生医学，ADSC已被用于肝损伤，心肌重建，神经组织再生，骨骼肌功能改善，骨再生，癌症治疗和糖尿病治疗^20，21。

迄今为止，已有263项注册临床试验用于评估ADSC的潜力，列在美国国立卫生研究院的网站上²²。已经建立了不同的收获脂肪组织的方案，但文献中尚未就分离ADSC用于临床的标准化方法达成共识^23，24。手术期间和手术后的脂抽吸处理方法可直接影响细胞活力、最终细胞产量²⁵和ADSC群体的质量²⁰。关于手术预处理，尚不明确哪种手术预处理技术在分离后产生更显着数量的活细胞，或者注射到脂肪组织中的麻醉液是否影响细胞产量及其功能²⁶。同样，获得脂肪细胞的技术之间的差异可能导致活ADSC 20的数量减少多达⁷⁰%。根据文献，应避免机械处理以获得具有高活力的细胞群 - 包括超声波 - 因为它们可以分解脂肪组织²⁰。然而，使用注射器的手动脂肪抽吸方法危害较小，导致细胞破坏较少，肿胀吸脂产生大量质量最好的细胞²⁶。

该技术使用含有利多卡因和肾上腺素的盐水溶液，将其注射到吸脂区域。每注射 3 mL 体积的溶液，吸入 1 mL。在这项研究中，进行了湿式吸脂技术，其中每注射1mL肾上腺素和盐水溶液，吸入0.2mL脂肪组织。消化酶的使用，特别是胶原酶，在分离ADSC的过程中很常见。

在实验室的第一个分离步骤之后，最终的沉淀称为基质血管部分（SVF）。它包含不同的细胞类型²⁷，包括内皮前体细胞，内皮细胞，巨噬细胞，平滑肌细胞，淋巴细胞，周细胞，前脂肪细胞和ADSC，它们能够粘附。一旦从 体外 培养物中完成最终分离，在培养基交换中消除未粘附在塑料上的细胞。经过八周的扩增、培养基变化和传代，ADSCs代表了烧瓶²⁰中的大部分细胞群。使用分离的脂肪来源的干细胞进行可能的未来治疗的最显着优势之一是冷冻保存的可能性。结果表明，即使在冷冻6周后，冷冻保存的脂质抽吸物也是SVF细胞的潜在来源²⁸，即使在冷冻保存2年后仍具有生物活性²⁹，并且在培养物中完全具有生长和分化的能力³⁰。然而，在解冻过程中，通常损失相当大比例的细胞³¹。因此，脂吸物去除过程和以下细胞分离方法必须确保最高的细胞产量。

这项研究描述了一种收集和分离ADSC的更快方法，证明了高细胞产量和活力，以提高细胞治疗的效率。此外，还评估了这种改进技术在长期SVF冷冻保存后的效果。

研究方案

本研究由UNIFESP伦理委员会批准（协议号:0029/2015 CAAE:40846215.0.0000.5505），根据赫尔辛基宣言（2004）获得患者的书面知情同意后进行。本研究的样本由9名女性患者组成，年龄在33-50岁（平均年龄41.5岁），平均初始体重指数（BMI）为24.54（范围在22.32-26.77之间）（表1），她们在圣保罗联邦大学整形外科部（UNIFESP）因怀孕后皮肤过多而接受了美容腹部整形术， 巴西。为了减少偏倚，考虑性别、年龄和BMI将患者选为同质组。本研究期间使用和/或分析的数据集可根据合理要求从通讯作者处获得。

1.脂抽吸物的收集

注意:此步骤需要在手术中心进行。

1. 使用4%葡萄糖酸氯己定（见 材料表）进行皮肤准备和无菌。
   1. 进行2毫米皮下皮肤切口（真皮下和蚜膜之间）。插入 26 mm 3 G 三孔和 3 mm 口径的 Klein 插管和注射器，以在脐下区域注入总体积为 500 mL 的肾上腺素溶液 （1 mg/mL）（参见 材料表）用盐水 （1:1，000，000） 稀释。
2. 将 60 mL 注射器连接到 26 mm 3 G 三孔和 3 mm 口径吸脂插管，并将其插入皮肤切口，锁定柱塞以产生真空。
   1. 进行推拉运动，以便在产生真空的情况下，脂抽吸物保留在 60 mL 注射器中。
3. 使用带阀门的无菌连接器，将收集的100 mL脂抽吸物转移到150 mL聚氯乙烯转移袋中（参见 材料表）。
   1. 在室温（~25°C）下将转移袋包装在聚苯乙烯盒中，并立即将其带到实验室。开始组织处理的时间不要超过30分钟。

2. 脂抽吸物的加工

注意:此步骤将在实验室中执行。

1. 首先，称量袋子，用数字非接触式红外临床温度计测量温度，然后将袋子在层流室内静置5分钟，以沉淀油腻层（气泡）和组织分离含有感兴趣的细胞。
   1. 进行一系列纸巾清洗。第一次洗涤:将 100 mL 含钙 （1x） 的 DPBS 注入转移袋中，并用手混合。
   2. 静置5分钟，除去沉淀的大部分基础液体。
   3. 用连接到袋适配器的 60 mL 注射器丢弃基础液体。此过程必须重复两次。
2. 向袋中加入100mL消化溶液（93mL无钙DPBS + 60μL氯化钙（1g / L）+ 7mL0.075%无菌胶原酶，参见 材料表），并在37°C下缓慢搅拌30分钟。
3. 将所有袋子的内容物转移到四个50mL的锥形管中，并在22°C下以400× g 离心10分钟。
   1. 取出并弃去上清液，向细胞沉淀中加入 5 mL Dulbecco 改良的 Eagle 培养基 （DMEM） 低血糖，并补充有 20% FBS（胎牛血清）（图 1）。

3. SVF 细胞计数

1. 将 10 μL 台盼蓝的新鲜溶液在蒸馏水中以 0.05% 与 10 μL 细胞悬浮液混合 5 分钟。
2. 使用倒置光学显微镜（参见材料表）在Neubauer细胞计数室³²中以20倍放大倍率计数活细胞。
3. 将细胞沉淀重悬于冷冻保护培养基（5 mL FBS + 10% 二甲基亚砜 - DMSO）中，浓度为 1 x 10⁶ 个细胞/mL。
4. 将 1 mL 的这种混合物放入冷冻管中。使用冷却速率为（1°C / min至-80°C）的冷冻容器（见 材料表）。
   1. 在-80°C下储存1年。
   2. 在此之后，储存在浸入液氮气相（-165°C）中的标准盒中。

4. 细胞的解冻过程

1. 从液氮中取出小瓶，并立即将其置于37°C水浴中1分钟。
2. 将SVF细胞置于锥形管中，其中4mL DMEM（补充有20%FBS的低葡萄糖）在37°C下预热。
3. 在22°C下以400× g 离心5分钟。
4. 取出上清液并加入 1 mL DMEM（低葡萄糖）+ 10% FBS。按照以下步骤进行免疫表型分析。

5. 流式细胞术技术（免疫表型多重标记）

1. 将 1 mL 细胞沉淀（浓度为 1，000 个细胞/μL）放入五个细胞术管（每个 200 μL）中。
2. 在22°C下以400× g 离心5分钟，并用移液管弃去上清液。
3. 加入 300 μL 磷酸盐缓冲盐水 （PBS） （10x），在 22 °C 下以 400 x g 离心，并用移液管弃去上清液。
4. 为不同的标记物组合准备五个试管，如下所示:5 μL CD11B/5 μL CD19/20 μL CD45;5 μL CD73/20 μL CD90/5 μL CD105/20 μL CD45;20 μL CD34/5 μL HLA-DR/20 μL CD45;细胞活力测定-5μL荧光活性染料。（见 材料表）和具有未染色细胞和PBS的管作为阴性对照。在涡旋中匀浆并在4°C下孵育30分钟。
   1. 在22°C下以400× g 离心5分钟，用移液管弃去上清液，加入500μLPBS（10x），然后进行细胞分选。
      注意:流式细胞仪中每个抗体组采集五千个事件，有四种颜色和五个参数，并使用CellQuest软件进行分析。

6. 第1通道的播种（P1）

1. 在75cm 2培养瓶中接种² x 10⁵个细胞。
2. 加入 12 mL DMEM 低葡萄糖 + 20% FBS + 10% 抗生素/抗真菌药（每毫升 0.1 μm 含 10，000 单位青霉素、10 mg 链霉素和 25 μg 两性霉素 B）。
3. 当细胞达到80%-90%汇合时，用2mL的0.25%EDTA-胰蛋白酶对贴壁细胞进行胰蛋白酶消化3分钟。
4. 再次计数单元格（如步骤 3 中所述）。
5. 再次进行免疫分型分析（如步骤5中所述）。

7. 统计分析

1. 使用 Spearman 的 Rho 计算器³³ 测量以下变量与 P < 0.05 之间的关联强度，如下所述。
   1. 选择 SVF 细胞产量和 SVF 在第一次传代 （P1） 中保持培养的天数，直到 80%-90% 汇合（至 P1 的天数）。
   2. 在进入P1之前和之后选择SVF细胞产量。
   3. 在进入 P1 之前，请考虑几天到 P1 和细胞产量。
   4. 选择具有已确认ADSC平均百分比的SVF细胞产量。
   5. 在进入P1之前计算已确认的ADSC的百分比和细胞产量。
   6. 确定 BMI 和 SVF 细胞产量。

8. 分化试验

1. 按照分化试剂盒方案进行分化测定（见 材料表）。 图 4 演示了案例 1 的结果。

结果

所研究的九个人的特征，包括他们的年龄、体重、身高和BMI，如 表1所示。

根据最初提出的细胞产量，计算在培养物中接种的细胞体积尽可能接近75cm² 培养瓶的容量。 表2描述了每种情况下接种的样品体积。然后，根据初始细胞产量，确定每个样品的细胞体积可变:细胞产量较高的样品为1 mL，细胞产量中等的样品为1.1 mL，细胞产量较低的样品?...

讨论

分离产量
众所周知，细胞治疗中经常需要的冷冻保存过程会导致显着的细胞损失，有时大于50%^29，30，35。因此，在分离中获得高初始细胞产量的技术改进至关重要。脂抽吸物的收集方法和细胞的分离方法必须侧重于保存更多数量的细胞，保持高活力，并从初始材料中提取最大数量的细胞，同时考虑细胞的长期培...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.8 mL cryovials	Nunc Thermo Fisher Scientific	340711
150 mL polyvinyl chloride transfer bag	JP FARMA	80146150059
2% Alizarin Red S Solution, pH 4.2	Sigma Aldrich	A5533
Adrenaline (1 mg/mL)	Hipolabor	NA
Alcian Blue solution	Sigma Aldrich	1,01,647
Antibiotic-Antimycotic 100x	Gibco	15240062
BD FACSCalibur Flow Cytometer using BD CellQues Pro Analysis	BD BioSciences	NA
Calcium chloride 10%	Merck	102379
Chlorhexidine gluconate 4%	VIC PHARMA	NA
Collagenase, Type I, powder	Gibco	17018029
DMEM (Dulbecco's modified Eagle's medium)	Gibco	11966025
DPBS no calcium, no magnesium (Dulbecco's Phosphate Buffered Saline Gibco Cell Therapy Systems)	Gibco	A1285801
DPBS with calcium (Dulbecco's Phosphate Buffered Saline Gibco Cell Therapy Systems)	Gibco	A1285601
Fetal bovine serum	Gibco	10500056
Formaldehyde 4%	Sigma Aldrich	1,00,496
Inverted light microscope	Nikon Eclipse TS100	NA
Live and Dead Cell Assay	Thermofisher	01-3333-41 | 01-3333-42
Monoclonal antibody: CD105	BD BioSciences	745927
Monoclonal antibody: CD11B	BD BioSciences	746004
Monoclonal antibody: CD19	BD BioSciences	745907
Monoclonal antibody: CD34	BD BioSciences	747822
Monoclonal antibody: CD45	DAKO	M0701
Monoclonal antibody: CD73	BD BioSciences	746000
Monoclonal antibody: CD90	BD BioSciences	553011
Monoclonal antibody: HLA-DR	BD BioSciences	340827
Mr. Frosty Freezing Container	Thermo Fisher Scientific	5100-0001
PBS (phosphate buffered saline) 1x pH 7.4	Gibco	10010023
StemPro Adipogenesis Differentiation Kit	Gibco	A1007001
StemPro Chondrogenesis Differentiation Kit	Gibco	A1007101
StemPro Osteogenesis Differentiation Kit	Gibco	A1007201
Sterile connector with one spike with needle injection site	Origen Biomedical Connector, USA	NA	Code mark: IBS
Trypan blue solution 0.4%	Sigma Aldrich	93595
Trypsin-EDTA 0.25% 1x, phenol red	Gibco	25200056