Técnica para obtenção de células-tronco mesenquimais a partir da caracterização do tecido adiposo e da fração vascular estromal em criopreservação a longo prazo

Resumo

O presente protocolo descreve uma metodologia aprimorada para o isolamento de ADSC, resultando em um tremendo rendimento celular com ganho de tempo em comparação com a literatura. Este estudo também fornece um método simples para a obtenção de um número relativamente grande de células viáveis após a crioppreservação a longo prazo.

Resumo

As células-tronco mesenquimais humanas derivadas do tecido adiposo tornaram-se cada vez mais atraentes, pois apresentam características apropriadas e são uma fonte acessível para aplicações clínicas regenerativas. Diferentes protocolos têm sido utilizados para a obtenção de células-tronco derivadas de tecido adiposo. Este artigo descreve diferentes etapas de um protocolo de economia de tempo aprimorado para obter uma quantidade mais significativa de ADSC, mostrando como criopreservar e descongelar o ADSC para obter células viáveis para expansão da cultura. Cem mililitros de lipoaspirado foram coletados, utilizando-se lipoaspiração de seringa de 26 cm de três orifícios e calibre de 3 mm, da região abdominal de nove pacientes que posteriormente foram submetidos à abdominoplastia eletiva. O isolamento das células-tronco foi realizado com uma série de lavagens com solução de solução salina tamponada com fosfato (DPBS) da Dulbecco suplementada com cálcio e o uso de colagenase. As células da Fração Vascular Estromal (SVF) foram criopreservadas, e sua viabilidade foi verificada por imunofenotipagem. O rendimento celular de SVF foi de 15,7 x 10⁵ células/mL, variando entre 6,1-26,2 células/mL. As células SVF aderentes atingiram confluência após uma média de 7,5 (±4,5) dias, com um rendimento celular médio de 12,3 (± 5,7) x 10⁵ células/mL. A viabilidade da FSV descongelada após 8 meses, 1 ano e 2 anos variou entre 23,06%-72,34%, com média de 47,7% (±24,64) com a menor viabilidade correlacionando-se com os casos de congelamento em dois anos. O uso de solução de DPBS suplementada com cálcio e tempos de repouso da bolsa para precipitação de gordura com menor tempo de digestão da colagenase resultou em um aumento do rendimento celular final de células-tronco. O procedimento detalhado para obtenção de altas produtividades de células-tronco viáveis foi mais eficiente em relação ao tempo e rendimento celular do que as técnicas de estudos anteriores. Mesmo após um longo período de criopreservação, células ADSC viáveis foram encontradas na SVF.

Introdução

As células-tronco mesenquimais humanas são vantajosas tanto na pesquisa básica quanto na aplicada. O uso desse tipo de célula adulta supera questões éticas - em comparação com o uso de células embrionárias ou outras - sendo uma das áreas de estudo mais promissoras em engenharia de regeneração de tecidos autólogos e terapia celular¹, como a área neoplásica, o tratamento de doenças degenerativas e aplicações terapêuticas na área de cirurgia reconstrutiva ^{2,3,4, 5}. Já foi relatado anteriormente que existe uma fonte abundante de células-tronco mesenquimais multipotentes e pluripotentes na fração celular vascular estromal do tecido adiposo ^6,7. Esses ADSC são considerados grandes candidatos para uso em terapia celular e transplante/infusão, uma vez que um número considerável de células com forte capacidade de expansão ex vivo pode ser facilmente obtido com alto rendimento a partir de um procedimento minimamente invasivo ^5,8.

Também foi demonstrado que o tecido adiposo apresenta maior capacidade de fornecer células-tronco mesenquimais do que duas outras fontes (medula óssea e tecido do cordão umbilical)⁹. Além de ser pouco imunogênica e de ter alta capacidade de integração no tecido hospedeiro e de interação com os tecidos circundantes^4,10, a ADSC possui uma capacidade multipotente de diferenciação em linhagens celulares, com relatos de diferenciação condrogênica, osteogênica e miogênica em condições de cultura adequadas ^11,12,13, e em células, como pancreáticas, hepatócitos^, e células neurogênicas^14,15,16.

A comunidade científica concorda que o efeito imunomodulador das células-tronco mesenquimais é um mecanismo de ação mais relevante para a terapia celular^17,18,19 do que sua propriedade de diferenciação. Um dos méritos mais significativos do uso do ADSC é a possibilidade de infusão ou enxerto autólogo, tornando-se uma alternativa de tratamento para diversas doenças. Para a medicina regenerativa, o ADSC já tem sido utilizado em casos de lesão hepática, reconstrução do músculo cardíaco, regeneração do tecido nervoso, melhora da função muscular esquelética, regeneração óssea, terapia do câncer e tratamento do diabetes^20,21.

Até o momento, existem 263 ensaios clínicos registrados para a avaliação do potencial do ADSC, listados no site dos Institutos Nacionais de Saúde dos Estados Unidos²². Diferentes protocolos para a colheita de tecido adiposo têm sido estabelecidos, mas não há consenso na literatura sobre um método padronizado para isolar a ADSC para uso clínico^23,24. Os métodos de processamento de lipoaspirados durante e após a cirurgia podem afetar diretamente a viabilidade celular, o rendimento celular final²⁵ e a qualidade da população de ADSC²⁰. Em relação ao pré-tratamento cirúrgico, não está bem estabelecido qual técnica cirúrgica de pré-tratamento produz um número mais significativo de células viáveis após o isolamento ou se a solução anestésica injetada no tecido adiposo afeta o rendimento celular e suas funções²⁶. Da mesma forma, a diferença entre as técnicas de obtenção de células adiposas pode levar a uma diminuição de até 70% no número de ADSC viáveis²⁰. De acordo com a literatura, tratamentos mecânicos para obtenção de populações celulares com alta viabilidade - incluindo ultrassonografia - devem ser evitados, pois podem decompor o tecido adiposo²⁰. No entanto, o método de aspiração manual de gordura com seringas é menos prejudicial, causando menor destruição celular, com a lipoaspiração tumescente produzindo um número significativo de células com a melhor qualidade²⁶.

Esta técnica utiliza uma solução salina com lidocaína e epinefrina que é injetada na área de lipoaspiração. Para cada volume de 3 ml de solução injetada, 1 ml é aspirado. Neste estudo, foi realizada a técnica de lipoaspiração úmida, na qual para cada 1 mL de adrenalina e solução salina injetados, 0,2 mL de tecido adiposo é aspirado. O uso de enzimas digestivas, especialmente a colagenase, é comum para o processo de isolamento do ADSC.

Após a primeira etapa de isolamento em laboratório, o pellet final é chamado de fração vascular estromal (SVF). Contém diferentes tipos de células²⁷, incluindo células precursoras endoteliais, células endoteliais, macrófagos, células musculares lisas, linfócitos, pericitos, pré-adipócitos e ADSCs, que são capazes de aderência. Uma vez concluído o isolamento final a partir de culturas in vitro , as células que não aderiram ao plástico são eliminadas em trocas médias. Após oito semanas de expansão, mudanças de meio e passagens, os ADSCs representam a maior parte da população celular nos frascos²⁰. Uma das vantagens mais significativas do uso de células-tronco isoladas derivadas de tecido adiposo para uma possível terapia futura é a possibilidade de criopreservação. Demonstrou-se que o lipoaspirado criopreservado é uma fonte potencial de células SVF mesmo após 6 semanas de congelamento²⁸, com atividade biológica mesmo após 2 anos de criopreservação²⁹, e plena capacidade de crescimento e diferenciação em cultura³⁰. No entanto, durante o processo de descongelamento, uma porcentagem considerável de células geralmente é perdida³¹. Portanto, o processo de remoção de lipoaspirados e os seguintes métodos de isolamento celular devem garantir o maior rendimento celular.

Este estudo descreve uma metodologia mais rápida para coleta e isolamento de ADSC, demonstrando alto rendimento celular e viabilidade para melhor eficiência da terapêutica celular. Além disso, avaliou-se o efeito dessa técnica aprimorada após a criopreservação da SVF em longo prazo.

Protocolo

O presente estudo é aprovado pelo Comitê de Ética da UNIFESP (número de protocolo: 0029/2015 CAAE: 40846215.0.0000.5505), realizado após a obtenção do termo de consentimento livre e esclarecido dos pacientes de acordo com a Declaração de Helsinque (2004). A amostra do presente estudo é composta por nove pacientes do sexo feminino, com idades entre 33 e 50 anos (média de idade de 41,5) e índice de massa corporal (IMC) inicial médio de 24,54 (variando entre 22,32-26,77) (Tabela 1) que foram submetidas à abdominoplastia estética por excesso de pele após a gestação, na Divisão de Cirurgia Plástica da Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP), Brasil. Para reduzir o viés, os pacientes foram selecionados como um grupo homogêneo considerando sexo, idade e IMC. Os conjuntos de dados utilizados e/ou analisados durante este estudo estão disponíveis no autor correspondente mediante solicitação razoável.

1. Coleta de lipoaspirado

NOTA: Esta etapa precisa ser realizada no centro cirúrgico.

1. Use gluconato de clorexidina a 4% (ver Tabela de Materiais) para preparação da pele e assepsia.
   1. Realizar uma incisão cutânea subcutânea de 2 mm (entre a subderme e a aponeurose). Inserir uma cânula de Klein de 26 mm 3 G de três orifícios e 3 mm de calibre e uma seringa para injetar um volume total de 500 ml de uma solução de adrenalina (1 mg/ml) (ver Tabela de Materiais) diluída em solução salina (1:1.000.000) na área infraumbilical.
2. Ligue uma seringa de 60 ml a uma cânula de lipoaspiração de três orifícios e 3 mm de calibre 3 mm de 26 mm e insira-a através da incisão cutânea, bloqueando o êmbolo para criar um vácuo.
   1. Faça movimentos de empurrar e puxar para que, com o vácuo criado, o lipoaspirado permaneça na seringa de 60 mL.
3. Usando um conector estéril com uma válvula, transfira os 100 mL do lipoaspirado coletado para um saco de transferência de cloreto de polivinila de 150 mL (consulte a Tabela de Materiais).
   1. Embale o saco de transferência numa caixa de poliestireno à temperatura ambiente (~25 °C) e leve-o imediatamente ao laboratório. Não demore mais de 30 minutos para iniciar o processamento tecidual.

2. Processamento de lipoaspirado

NOTA: Esta etapa deve ser executada no laboratório.

1. Primeiro, pese a bolsa, medir a temperatura com um termômetro clínico infravermelho digital sem contato e deixe a bolsa em repouso por 5 minutos dentro da câmara de fluxo laminar para precipitação das camadas mais gordurosas (bolhas) e separação de tecidos contendo as células de interesse.
   1. Realize uma série de lavagens de tecidos. Primeira lavagem: injete 100 mL de DPBS com cálcio (1x) no saco de transferência e misture com as mãos.
   2. Deixe repousar por 5 min e remova a maior parte do líquido basal que precipita.
   3. Descarte o líquido basal com uma seringa de 60 mL presa ao adaptador do saco. Este processo deve ser repetido duas vezes.
2. Adicionar 100 ml de solução de digestão ao saco (93 ml de DPBS sem cálcio + 60 μL de cloreto de cálcio (1 g/L) + 7 ml de colagenase estéril a 0,075%, ver Tabela de Materiais) e deixar a 37 °C durante 30 minutos sob agitação lenta.
3. Transfira todo o conteúdo do saco para quatro tubos cônicos de 50 mL e centrifuga-os a 400 x g a 22 °C por 10 min.
   1. Retirar e descartar o sobrenadante e adicionar 5 mL de baixo teor de glicose do meio Eagle modificado (DMEM) da Dulbecco suplementado com FBS a 20% (soro fetal bovino) ao pellet celular (Figura 1).

3. Contagem das células SVF

1. Misturar uma solução fresca de 10 μL de azul de tripano a 0,05% em água destilada com 10 μL de suspensão celular durante 5 min.
2. Conte células viáveis em uma câmara de contagem de células^{Neubauer 32} usando um microscópio de luz invertida (ver Tabela de Materiais) com ampliação de 20x.
3. Ressuspender o pellet celular em meio crioprotetor (5 mL de FBS + 10% de Dimetil Sulsulfóxido - DMSO) na concentração de 1 x 10⁶ células/mL.
4. Coloque 1 mL desta mistura em crioviais. Utilizar um recipiente de congelação (ver Tabela de Materiais) com uma taxa de arrefecimento de (1 °C/min a -80 °C).
   1. Conservar a -80 °C durante 1 ano.
   2. Após este tempo, conservar em caixas de padrão imersas na fase de vapor de azoto líquido (-165 °C).

4. Processo de descongelamento das células

1. Retire os frascos para injetáveis do azoto líquido e coloque-os imediatamente em banho-maria a 37 °C durante 1 min.
2. Coloque as células SVF em um tubo cônico com 4 mL de DMEM (baixa glicose suplementada com FBS a 20%) pré-aquecido a 37 °C.
3. Centrífuga a 400 x g a 22 °C durante 5 min.
4. Retire o sobrenadante e adicione 1 mL de DMEM (baixa glicose) + 10% FBS. Realizar imunofenotipagem seguindo os passos abaixo.

5. Técnica de citometria de fluxo (marcação múltipla do imunofenótipo)

1. Coloque 1 mL de pellet celular (concentração de 1.000 células/μL) em cinco tubos de citometria (200 μL cada).
2. Centrifugar a 400 x g a 22 °C durante 5 min e eliminar o sobrenadante com uma pipeta.
3. Adicionar 300 μL de solução salina tamponada com fosfato (PBS) (10x), centrifugar a 400 x g a 22 °C e eliminar o sobrenadante com uma pipeta.
4. Preparar cinco tubos para diferentes combinações de marcadores da seguinte forma: 5 μL de CD11B/5 μL de CD19/20 μL de CD45; 5 μL de CD73/20 μL de CD90/5 μL de CD105/20 μL de CD45; 20 μL de CD34/5 μL de HLA-DR/20 μL de CD45; Ensaio de viabilidade celular-5 μL de corante reativo fluorescente. (ver Tabela de Materiais) e um tubo com células não coradas e PBS como controlo negativo. Homogeneizar num vórtice e incubar a 4 °C durante 30 min.
   1. Centrifugar a 400 x g a 22 °C durante 5 min, eliminar o sobrenadante com uma pipeta, adicionar 500 μL de PBS (10x) e proceder à triagem das células.
      NOTA: Cinco mil eventos são adquiridos por conjunto de anticorpos no Citômetro de Fluxo de quatro cores e cinco parâmetros e analisados com o software CellQuest.

6. Semeadura da passagem 1 (P1)

1. Sementes 2 x 10⁵ células num balão de cultura de 75 cm² .
2. Adicione 12 mL de DMEM de glicose baixa + 20% de FBS + 10% de antibiótico/antimicótico (com 10.000 unidades de penicilina, 10 mg de estreptomicina e 25 μg de anfotericina B por mL, 0,1 μm).
3. Quando as células atingirem entre 80% e 90% de confluência, realizar tripsinização de células aderentes com 2 mL de EDTA-tripsina a 0,25% por 3 min.
4. Conte as células novamente (conforme mencionado na etapa 3).
5. Realize a imunofenotipagem novamente (conforme mencionado na etapa 5).

7. Análise estatística

1. Use a Calculadora Rho³³ de Spearman para medir a força de associação entre as seguintes variáveis com P < 0,05, conforme mencionado abaixo.
   1. Selecione o rendimento celular de SVF e o número de dias de permanência do SVF em cultura na primeira passagem (P1) até a confluência de 80%-90% (dias a P1).
   2. Selecione o rendimento celular SVF antes e depois de ir para P1.
   3. Considere os dias para P1 e o rendimento celular antes de ir para P1.
   4. Selecione o rendimento celular SVF com a porcentagem média de ADSC confirmado.
   5. Calcule a porcentagem de ADSC confirmado e o rendimento celular antes de ir para P1.
   6. Determine o rendimento celular do IMC e do SVF.

8. Ensaio de diferenciação

1. Realizar o ensaio de diferenciação seguindo um protocolo de kit de diferenciação (ver Tabela de materiais). A Figura 4 demonstra os resultados do Caso 1.

Resultados

A caracterização dos nove indivíduos estudados, incluindo idade, peso, altura e IMC, está apresentada na Tabela 1.

De acordo com o rendimento celular inicialmente apresentado, o volume celular inoculado em cultura foi calculado para ser o mais próximo possível da capacidade do frasco de cultura de 75 cm². O volume amostral semeado em cada caso está descrito na Tabela 2. Em seguida, de acordo com o rendimento celular inicial, foi determinado u...

Discussão

Rendimento de isolamento
Está bem estabelecido que o processo de criopreservação, frequentemente necessário na terapia celular, resulta em perda celular significativa, às vezes superior a 50%29,30,35. Assim, um aprimoramento técnico para a obtenção de alto rendimento celular inicial isoladamente é fundamental. O método de coleta de lipoaspirado e o método de isolamento das células devem se concent...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.8 mL cryovials	Nunc Thermo Fisher Scientific	340711
150 mL polyvinyl chloride transfer bag	JP FARMA	80146150059
2% Alizarin Red S Solution, pH 4.2	Sigma Aldrich	A5533
Adrenaline (1 mg/mL)	Hipolabor	NA
Alcian Blue solution	Sigma Aldrich	1,01,647
Antibiotic-Antimycotic 100x	Gibco	15240062
BD FACSCalibur Flow Cytometer using BD CellQues Pro Analysis	BD BioSciences	NA
Calcium chloride 10%	Merck	102379
Chlorhexidine gluconate 4%	VIC PHARMA	NA
Collagenase, Type I, powder	Gibco	17018029
DMEM (Dulbecco's modified Eagle's medium)	Gibco	11966025
DPBS no calcium, no magnesium (Dulbecco's Phosphate Buffered Saline Gibco Cell Therapy Systems)	Gibco	A1285801
DPBS with calcium (Dulbecco's Phosphate Buffered Saline Gibco Cell Therapy Systems)	Gibco	A1285601
Fetal bovine serum	Gibco	10500056
Formaldehyde 4%	Sigma Aldrich	1,00,496
Inverted light microscope	Nikon Eclipse TS100	NA
Live and Dead Cell Assay	Thermofisher	01-3333-41 | 01-3333-42
Monoclonal antibody: CD105	BD BioSciences	745927
Monoclonal antibody: CD11B	BD BioSciences	746004
Monoclonal antibody: CD19	BD BioSciences	745907
Monoclonal antibody: CD34	BD BioSciences	747822
Monoclonal antibody: CD45	DAKO	M0701
Monoclonal antibody: CD73	BD BioSciences	746000
Monoclonal antibody: CD90	BD BioSciences	553011
Monoclonal antibody: HLA-DR	BD BioSciences	340827
Mr. Frosty Freezing Container	Thermo Fisher Scientific	5100-0001
PBS (phosphate buffered saline) 1x pH 7.4	Gibco	10010023
StemPro Adipogenesis Differentiation Kit	Gibco	A1007001
StemPro Chondrogenesis Differentiation Kit	Gibco	A1007101
StemPro Osteogenesis Differentiation Kit	Gibco	A1007201
Sterile connector with one spike with needle injection site	Origen Biomedical Connector, USA	NA	Code mark: IBS
Trypan blue solution 0.4%	Sigma Aldrich	93595
Trypsin-EDTA 0.25% 1x, phenol red	Gibco	25200056