지방 조직에서 중간엽 줄기세포를 얻는 기술 및 장기 냉동 보존에서 기질 혈관 분획 특성 분석

요약

본 프로토콜은 ADSC 단리를 위한 개선된 방법론을 기술하여 문헌에 비해 시간 이득과 함께 엄청난 세포 수율을 초래한다. 이 연구는 또한 장기 동결보존 후 비교적 많은 수의 생존 가능한 세포를 얻기 위한 간단한 방법을 제공합니다.

초록

지방 조직에서 유래한 인간 중간엽 줄기세포는 적절한 특징을 보여주고 재생 임상 적용을 위한 접근 가능한 공급원이 됨에 따라 점점 더 매력적이 되고 있습니다. 지방 유래 줄기 세포를 얻기 위해 다른 프로토콜이 사용되었습니다. 이 기사에서는 더 많은 양의 ADSC를 얻기 위해 개선된 시간 절약 프로토콜의 여러 단계를 설명하고 배양 확장을 위한 생존 가능한 세포를 얻기 위해 ADSC를 냉동 보존 및 해동하는 방법을 보여줍니다. 26cm 3 구멍 및 3mm 구경 주사기 지방 흡입술을 사용하여 선택적 복부 성형술을받은 9 명의 환자의 복부에서 100 밀리리터의 지방 흡인물을 수집했습니다. 줄기 세포 분리는 칼슘이 보충 된 Dulbecco의 인산염 완충 식염수 (DPBS) 용액과 콜라게나 제를 사용하여 일련의 세척으로 수행되었습니다. 기질 혈관 분획 (SVF) 세포를 냉동 보존하고 면역 표현형으로 생존력을 확인했습니다. SVF 세포 수율은 15.7 x 10⁵ 세포 / mL, 6.1-26.2 세포 / mL 범위였습니다. 부착 SVF 세포는 평균 7.5 (±4.5) 일 후에 합류에 도달했으며 평균 세포 수율은 12.3 (± 5.7) x 10⁵ 세포 / mL입니다. 8 개월, 1 년 및 2 년 후 해동 된 SVF의 생존력은 23.06 % -72.34 % 사이였으며 평균 47.7 % (±24.64)로 2 년 동결 사례와 관련하여 가장 낮은 생존력을 보였다. 칼슘이 보충 된 DPBS 용액과 콜라게나제 소화 시간이 짧은 지방 침전을위한 가방 휴식 시간을 사용하면 줄기 세포의 최종 세포 수율이 증가했습니다. 생존 가능한 줄기 세포의 높은 수율을 얻기위한 상세한 절차는 이전 연구의 기술보다 시간과 세포 수율과 관련하여 더 효율적이었습니다. 장기간의 동결 보존 후에도 SVF에서 생존 가능한 ADSC 세포가 발견되었습니다.

서문

인간 중간엽 줄기세포는 기초 및 응용 연구 모두에서 유리합니다. 이 성체 세포 유형의 사용은 배아 또는 다른 세포의 사용과 비교하여 윤리적 문제를 능가하며, 신생물 영역, 퇴행성 질환 치료 및 재건 수술 영역의 치료 응용 분야와 같은자가 조직 재생 공학 및 세포 치료¹에서 가장 유망한 연구 분야^{중 하나입니다} 2,3,4^{, 5}. 지방 조직의 기질 혈관 세포 분획에 중간엽 다능성 및 만능 줄기 세포의 풍부한 공급원이 있다고 이전에 보고되었습니다 ^6,7. 이러한 ADSC는 최소 침습^{적 절차5,8}에서 높은 수율로 생체 외 확장 능력을 가진 상당한 수의 세포를 쉽게 얻을 수 있기 때문에 세포 치료 및 이식/주입에 사용하기에 훌륭한 후보로 간주됩니다.

또한 지방 조직은 다른 두 가지 공급원(골수 및 탯줄 ^{조직)보다} 중간엽 줄기 세포를 제공할 수 있는 더 큰 능력을 제공한다는 것이 입증되었습니다9. ADSC는 면역원성이 낮고 숙주 조직에 통합되고 주변 조직과 상호 작용하는 능력이 높을 뿐만 아니라4,10, 적절한 배양 조건^11,12,13 및 췌장, 간세포와 같은 세포로의 연골성^, 골인성 및 근원성 분화에 대한 보고와 함께 세포주로의 분화 다분화능을 가지고 있습니다. 및 신경성 세포^14,15,16.

과학계는 중간엽 줄기세포의 면역 조절 효과가 분화 특성보다 세포 치료^17,18,19에 더 관련성이 높은 작용 메커니즘이라는 데 동의합니다. ADSC 사용의 가장 중요한 장점 중 하나는이 자가 주입 또는 이식의 가능성으로 여러 질병에 대한 대체 치료법이됩니다. 재생 의학의 경우 ADSC는 이미 간 손상, 심장 근육 재건, 신경 조직 재생, 골격근 기능 개선, 뼈 재생, 암 치료 및 당뇨병 치료^20,21의 경우에 사용되었습니다.

현재까지 ADSC의 잠재력 평가를 위해 등록 된 임상 시험은 263 건이며 미국 국립 보건원²² 웹 사이트에 나와 있습니다. 지방 조직을 수확하기위한 다른 프로토콜이 확립되었지만, 임상 사용을 위해 ADSC를 분리하는 표준화 된 방법에 대한 문헌에는 합의가 없다^23,24. 수술 중 및 수술 후의 지방 흡인 처리 방법은 세포 생존율, 최종 세포 수율²⁵ 및 ADSC 집단²⁰의 품질에 직접적인 영향을 미칠 수 있습니다. 외과적 전처리와 관련하여, 어떤 외과적 전처리 기술이 분리 후 더 많은 수의 생존 세포를 생성하는지 또는 지방 조직에 주입된 마취액이 세포 수율 및 그 기능에 영향을 미치는지 여부는 잘 확립되어 있지 않다²⁶. 유사하게, 지방 세포를 얻기 위한 기술 사이의 차이는 생존 가능한 ADSC(20)의 수의⁷⁰%만큼 감소를 초래할 수 있다. 문헌에 따르면, 초음파를 포함하여 높은 생존력을 갖는 세포 집단을 얻기위한 기계적 처리는 지방 조직⁽²⁰)을 분해 할 수 있기 때문에 피해야한다. 그러나 주사기를 사용한 수동 지방 흡인 방법은 덜 해롭기 때문에 세포 파괴가 적으며 격렬한 지방 흡입술은 최고의 품질을 가진 상당한 수의 세포를 생성합니다²⁶.

이 기술은 지방 흡입 부위에 주입되는 리도카인과 에피네프린이 함유 된 식염수를 사용합니다. 주입 된 용액 3mL 부피마다 1mL가 흡인됩니다. 이 연구에서는 아드레날린과 식염수 1mL를 주입 할 때마다 0.2mL의 지방 조직을 흡인하는 습식 지방 흡입 기술을 수행했습니다. 소화 효소, 특히 콜라게나 제의 사용은 ADSC를 분리하는 과정에서 일반적입니다.

실험실에서 첫 번째 분리 단계 후 최종 펠릿을 기질 혈관 분획(SVF)이라고 합니다. 그것은 내피 전구체 세포, 내피 세포, 대식세포, 평활근 세포, 림프구, 혈관주위세포, 예비지방세포 및 ADSC를 포함하는, 부착이 가능한 상이한 세포 유형(²⁷)을 함유한다. 시험관 내 배양에서 최종 분리가 완료되면 플라스틱에 부착되지 않은 세포는 배지 교환에서 제거됩니다. 8주간의 팽창, 배지 변화, 및 계대 배양 후, ADSC는 플라스크(²⁰) 내의 대부분의 세포 집단을 나타낸다. 가능한 미래 치료를 위해 분리 된 지방 유래 줄기 세포를 사용하는 가장 중요한 이점 중 하나는 동결 보존의 가능성입니다. 냉동 보존 된 지방 흡인물은 6 주간의 냉동²⁸ 후에도 SVF 세포의 잠재적 공급원이며, 2 년의 냉동 보존²⁹ 후에도 생물학적 활성이 있으며, 배양³⁰에서 성장하고 분화 할 수있는 완전한 능력을 가지고 있음이 입증되었습니다. 그러나, 해동 과정 동안, 상당한 비율의 세포가 보통 손실된다⁽³¹). 따라서 지방 흡인 제거 과정과 다음과 같은 세포 분리 방법은 최고의 세포 수율을 보장해야합니다.

이 연구는 ADSC를 수집하고 분리하는 더 빠른 방법론을 설명하여 세포 치료제의 효율성을 높이기 위해 높은 세포 수율과 생존력을 보여줍니다. 또한, 장기 SVF 동결 보존 후이 개선 된 기술의 효과가 평가되었습니다.

프로토콜

본 연구는 UNIFESP 윤리위원회 (프로토콜 번호 : 0029/2015 CAAE : 40846215.0.0000.5505)의 승인을 받았으며, 헬싱키 선언 (2004)에 따라 환자로부터 서면 동의를받은 후 수행되었습니다. 본 연구의 샘플은 33-50 세 (평균 연령 41.5)이고 평균 초기 체질량 지수 (BMI)가 24.54 (22.32-26.77 사이) (표 1)의 9 명의 여성 환자로 구성되어 있으며, 상파울루 연방 대학교 (UNIFESP)의 성형 외과 부서에서 임신 후 피부 과잉으로 미적 복부 성형술을받은 사람, 브라질. 비뚤림을 줄이기 위해 환자는 성별, 연령 및 BMI를 고려한 동종 그룹으로 선택되었습니다. 이 연구 중에 사용 및/또는 분석된 데이터 세트는 합리적인 요청에 따라 교신 저자로부터 구할 수 있습니다.

1. 지방 흡인물 수집

참고: 이 단계는 수술 센터에서 수행해야 합니다.

1. 피부 준비 및 무균을 위해 4 % 클로르헥시딘 글루코 네이트 ( 재료 표 참조)를 사용하십시오.
   1. 2mm 피하 피부 절개 (진피하와 동맥 경화증 사이)를 수행하십시오. 26mm 3G 3구멍 및 3mm 구경의 Klein 캐뉼러와 주사기를 삽입하여 하부 영역의 식염수(1:1,000,000)에 희석한 총 부피의 아드레날린 용액(1mg/mL)( 재료 표 참조) 500mL를 주입합니다.
2. 60mL 주사기를 26mm 3G 3구멍 및 3mm 구경 지방 흡입 캐뉼러에 연결하고 피부 절개 부위를 통해 삽입하고 플런저를 잠가 진공을 만듭니다.
   1. 진공이 생성되면 지방 흡인물이 60mL 주사기에 남아 있도록 밀고 당기는 움직임을 만듭니다.
3. 밸브가 있는 멸균 커넥터를 사용하여 수집된 100mL의 리포아피네이트를 150mL 폴리염화비닐 전사 백으로 옮깁니다( 재료 표 참조).
   1. 이송 백을 실온(~25°C)의 폴리스티렌 상자에 포장하고 즉시 실험실로 가져갑니다. 조직 처리를 시작하는 데 30 분 이상 걸리지 마십시오.

2. 지방 흡인물의 가공

알림: 이 단계는 실험실에서 수행해야 합니다.

1. 먼저, 가방의 무게를 측정하고, 디지털 비접촉 적외선 임상 온도계로 온도를 측정하고, 기름기 층(기포)의 침전 및 관심 세포를 포함하는 조직 분리를 위해 백을 층류 챔버 내부에 5분 동안 그대로 두십시오.
   1. 일련의 조직 세척을 수행하십시오. 첫 번째 세척: DPBS 100mL에 칼슘(1x)을 트랜스퍼 백에 주입하고 손으로 섞습니다.
   2. 5 분 동안 그대로 두어 침전되는 대부분의 기본 액체를 제거하십시오.
   3. 백 어댑터에 부착된 60mL 주사기로 기본 액체를 폐기합니다. 이 과정은 두 번 반복해야합니다.
2. 백에 분해액 100mL(무칼슘 DPBS 93mL + 염화칼슘 60μL(1g/L) + 0.075% 멸균 콜라게나제 7mL, 재료 표 참조)를 넣고 37°C에서 30분 동안 천천히 교반합니다.
3. 백의 모든 내용물을 50mL의 원뿔형 튜브 4개로 옮기고 22°C에서 400 x g 에서 10분 동안 원심분리합니다.
   1. 상청액을 제거하고 버리고 20% FBS(소 태아 혈청)가 보충된 Dulbecco의 변형된 Eagle's 배지(DMEM) 저혈당 5mL를 세포 펠릿에 추가합니다(그림 1).

3. SVF 세포의 계수

1. 증류수에 0.05%의 트리판 블루 10μL의 신선한 용액을 10μL의 세포 현탁액과 5분 동안 혼합합니다.
2. 20x 배율로 도립 광학 현미경 (재료 표 참조)을 사용하여 Neubauer 세포 계수 챔버⁽³²)에서 생존 가능한 세포를 계수합니다.
3. 세포 펠릿을 냉동 보호 배지(FBS 5mL + 디메틸설폭사이드 10% - DMSO)에 1 x 10^{6 cells} /mL의 농도로 재현탁합니다.
4. 이 혼합물 1mL를 냉동 바이알에 넣습니다. 냉각 속도가 (1 °C/min에서 -80 °C)인 냉동 용기( 재료 표 참조)를 사용하십시오.
   1. -80 °C에서 1 년 동안 보관하십시오.
   2. 이 시간 후에, 액체 질소 증기상 (-165 °C)에 침지 된 표준 카세트 박스에 저장한다.

4. 세포의 해동 과정

1. 액체 질소에서 바이알을 제거하고 즉시 37°C 수조에 1분 동안 두십시오.
2. SVF 세포를 4°C에서 예열된 DMEM(20% FBS가 보충된 저혈당)이 있는 원뿔형 튜브에 37°C로 놓습니다.
3. 22°C에서 400 x g 로 5분간 원심분리합니다.
4. 상청액을 제거하고 DMEM(저혈당) + 10% FBS 1mL를 추가합니다. 아래 단계에 따라 면역 표현형을 수행하십시오.

5. 유세포 분석 기술 (면역 표현형 다중 표지)

1. 1mL의 세포 펠릿(1,000 cells/μL 농도)을 5개의 세포분석 튜브(각각 200μL)에 넣습니다.
2. 22°C에서 400 x g 에서 5분 동안 원심분리하고, 피펫으로 상청액을 버린다.
3. 300μL의 인산염 완충 식염수(PBS)(10x)를 추가하고 22°C에서 400x g 로 원심분리한 후 피펫으로 상청액을 버립니다.
4. 다음과 같이 상이한 마커 조합을위한 5 개의 튜브를 준비하십시오 : 5 μL의 CD11B / 5 μL의 CD19 / 20 μL의 CD45; 5 μL의 CD73/20 μL의 CD90/5 μL의 CD105/20 μL의 CD45; 20 μL의 CD34 / 5 μL의 HLA-DR / 20 μL의 CD45; 세포 생존율 분석-5 μL의 형광 반응성 염료. ( 재료 표 참조) 및 염색되지 않은 세포 및 음성 대조군으로서 PBS를 갖는 튜브를 포함한다. 와류에서 균질화하고 4 ° C에서 30 분 동안 배양합니다.
   1. 22°C에서 400 x g 에서 5분 동안 원심분리하고, 피펫으로 상층액을 버리고, 500μL의 PBS(10x)를 첨가하고, 세포 분류를 진행한다.
      참고: 유세포분석기에서 4가지 색상과 5가지 파라미터의 항체 세트당 5,000개의 이벤트를 획득하고 CellQuest 소프트웨어로 분석합니다.

6. 통로 1 (P1)의 파종

1. 75 cm 2 배양 플라스크에² x 10⁵ 세포를 시드합니다.
2. DMEM 저혈당 12mL + FBS 20% + 항생제/항진균제 10%(mL당 페니실린 10,000단위, 스트렙토마이신 10mg 및 암포테리신 B 25μg, 0.1μm)를 추가합니다.
3. 세포가 80%-90% 합류 사이에 도달하면 2mL의 0.25% EDTA-트립신으로 부착 세포의 트립신화를 3분 동안 수행합니다.
4. 셀을 다시 계산합니다(3단계에서 언급한 대로).
5. 면역 표현형을 다시 수행하십시오 (5 단계에서 언급 한 바와 같이).

7. 통계 분석

1. Spearman의 Rho 계산기³³ 을 사용하여 아래에 언급된 대로 P < 0.05를 갖는 다음 변수 간의 연관성 강도를 측정합니다.
   1. SVF 세포 수율과 SVF가 첫 번째 계대 (P1)에서 80 % -90 % 합류 (P1까지의 일수)까지 배양에 머무르는 일수를 선택하십시오.
   2. P1로 이동하기 전과 후의 SVF 셀룰러 수율을 선택합니다.
   3. P1로 가기 전에 P1까지의 일과 세포 수율을 고려하십시오.
   4. 확인 된 ADSC의 평균 백분율로 SVF 세포 수율을 선택하십시오.
   5. P1로 이동하기 전에 확인 된 ADSC의 백분율과 세포 수율을 계산하십시오.
   6. BMI 및 SVF 세포 수율을 결정합니다.

8. 분화 분석

1. 분화 키트 프로토콜에 따라 분화 분석을 수행합니다( 재료 표 참조). 그림 4 는 사례 1의 결과를 보여 줍니다.

결과

나이, 체중, 키 및 BMI를 포함하여 연구 된 9 명의 개인의 특성은 표 1에 나와 있습니다.

초기에 제시된 세포 수율에 따라, 배양물에 접종된 세포 부피는 75^cm2 배양 플라스크의 용량에 가능한 한 근접한 것으로 계산되었다. 각 경우에 시딩된 샘플 부피는 표 2에 설명되어 있습니다. 그런 다음 초기 세포 수율에 따라 각 샘플에 대한 다양한 세포 부?...

토론

절연 수율
세포 치료에 자주 요구되는 동결 보존 과정은 때로는 50 % 이상의 상당한 세포 손실을 초래한다는 것이 잘 알려져 있습니다.29,30,35. 따라서, 고립 된 상태에서 높은 초기 세포 수율을 얻기위한 기술적 개선이 기본이다. 지방 흡인물의 수집 방법과 세포의 분리 방법은 세포의 장기 배양 및 조작을 고려하?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.8 mL cryovials	Nunc Thermo Fisher Scientific	340711
150 mL polyvinyl chloride transfer bag	JP FARMA	80146150059
2% Alizarin Red S Solution, pH 4.2	Sigma Aldrich	A5533
Adrenaline (1 mg/mL)	Hipolabor	NA
Alcian Blue solution	Sigma Aldrich	1,01,647
Antibiotic-Antimycotic 100x	Gibco	15240062
BD FACSCalibur Flow Cytometer using BD CellQues Pro Analysis	BD BioSciences	NA
Calcium chloride 10%	Merck	102379
Chlorhexidine gluconate 4%	VIC PHARMA	NA
Collagenase, Type I, powder	Gibco	17018029
DMEM (Dulbecco's modified Eagle's medium)	Gibco	11966025
DPBS no calcium, no magnesium (Dulbecco's Phosphate Buffered Saline Gibco Cell Therapy Systems)	Gibco	A1285801
DPBS with calcium (Dulbecco's Phosphate Buffered Saline Gibco Cell Therapy Systems)	Gibco	A1285601
Fetal bovine serum	Gibco	10500056
Formaldehyde 4%	Sigma Aldrich	1,00,496
Inverted light microscope	Nikon Eclipse TS100	NA
Live and Dead Cell Assay	Thermofisher	01-3333-41 | 01-3333-42
Monoclonal antibody: CD105	BD BioSciences	745927
Monoclonal antibody: CD11B	BD BioSciences	746004
Monoclonal antibody: CD19	BD BioSciences	745907
Monoclonal antibody: CD34	BD BioSciences	747822
Monoclonal antibody: CD45	DAKO	M0701
Monoclonal antibody: CD73	BD BioSciences	746000
Monoclonal antibody: CD90	BD BioSciences	553011
Monoclonal antibody: HLA-DR	BD BioSciences	340827
Mr. Frosty Freezing Container	Thermo Fisher Scientific	5100-0001
PBS (phosphate buffered saline) 1x pH 7.4	Gibco	10010023
StemPro Adipogenesis Differentiation Kit	Gibco	A1007001
StemPro Chondrogenesis Differentiation Kit	Gibco	A1007101
StemPro Osteogenesis Differentiation Kit	Gibco	A1007201
Sterile connector with one spike with needle injection site	Origen Biomedical Connector, USA	NA	Code mark: IBS
Trypan blue solution 0.4%	Sigma Aldrich	93595
Trypsin-EDTA 0.25% 1x, phenol red	Gibco	25200056