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  • Références
  • Réimpressions et Autorisations

Résumé

Le présent protocole décrit une méthodologie améliorée pour l’isolement ADSC résultant en un rendement cellulaire énorme avec gain de temps par rapport à la littérature. Cette étude fournit également une méthode simple pour obtenir un nombre relativement important de cellules viables après cryoconservation à long terme.

Résumé

Les cellules souches mésenchymateuses humaines dérivées du tissu adipeux sont devenues de plus en plus attrayantes car elles présentent des caractéristiques appropriées et constituent une source accessible pour des applications cliniques régénératives. Différents protocoles ont été utilisés pour obtenir des cellules souches dérivées du tissu adipeux. Cet article décrit les différentes étapes d’un protocole amélioré permettant de gagner du temps pour obtenir une quantité plus importante d’ADSC, en montrant comment cryopréserver et décongeler l’ADSC pour obtenir des cellules viables pour l’expansion de la culture. Cent millilitres de lipoaspiration ont été prélevés, à l’aide d’une liposuccion à seringue de calibre trois trous de 26 cm et de calibre 3 mm, dans la région abdominale de neuf patients qui ont ensuite subi une abdominoplastie élective. L’isolement des cellules souches a été réalisé avec une série de lavages avec la solution de solution de solution saline tamponnée au phosphate (DPBS) de Dulbecco supplémentée en calcium et en utilisant de la collagénase. Les cellules de la fraction vasculaire stromale (SVF) ont été cryopréservées et leur viabilité a été vérifiée par immunophénotypage. Le rendement cellulaire SVF était de 15,7 x 105 cellules/mL, variant entre 6,1 et 26,2 cellules/mL. Les cellules SVF adhérentes ont atteint la confluence après une moyenne de 7,5 (±4,5) jours, avec un rendement cellulaire moyen de 12,3 (± 5,7) x 105 cellules / mL. La viabilité de la SVF décongelée après 8 mois, 1 an et 2 ans variait entre 23,06 % et 72,34 %, avec une moyenne de 47,7 % (±24,64), la viabilité la plus faible étant corrélée aux cas de gel de deux ans. L’utilisation de la solution DPBS complétée par du calcium et des temps de repos en sac pour la précipitation des graisses avec un temps de digestion de collagénase plus court a entraîné une augmentation du rendement cellulaire final des cellules souches. La procédure détaillée pour obtenir des rendements élevés de cellules souches viables était plus efficace en termes de temps et de rendement cellulaire que les techniques des études précédentes. Même après une longue période de cryoconservation, des cellules ADSC viables ont été trouvées dans le SVF.

Introduction

Les cellules souches mésenchymateuses humaines sont avantageuses en recherche fondamentale et appliquée. L’utilisation de ce type de cellules adultes dépasse les questions éthiques - par rapport à l’utilisation de cellules embryonnaires ou autres - étant l’un des domaines d’étude les plus prometteurs en ingénierie de la régénération tissulaire autologue et en thérapie cellulaire1, tels que le domaine néoplasique, le traitement des maladies dégénératives et les applications thérapeutiques dans le domaine de la chirurgie reconstructive 2,3,4, 5. Il a été précédemment rapporté qu’il existe une source abondante de cellules souches mésenchymateuses multipotentes et pluripotentes dans la fraction cellulaire vasculaire stromale du tissu adipeux 6,7. Ces ADSC sont considérés comme d’excellents candidats pour une utilisation en thérapie cellulaire et en transplantation/perfusion car un nombre considérable de cellules ayant une forte capacité d’expansion ex vivo peuvent être facilement obtenues avec un rendement élevé à partir d’une procédure invasive minimale 5,8.

Il a également été démontré que le tissu adipeux présente une plus grande capacité à fournir des cellules souches mésenchymateuses que deux autres sources (moelle osseuse et tissu du cordon ombilical)9. En plus d’être peu immunogène et d’avoir une grande capacité à s’intégrer dans le tissu hôte et à interagir avec les tissus environnants4,10, l’ADSC a une capacité multipotente de différenciation en lignées cellulaires, avec des rapports de différenciation chondromogène, ostéogénique et myogénique dans des conditions de culture appropriées11,12,13, et dans les cellules, telles que le pancréas, les hépatocytes, et cellules neurogènes14,15,16.

La communauté scientifique s’accorde à dire que l’effet immunomodulateur des cellules souches mésenchymateuses est un mécanisme d’action plus pertinent pour la thérapie cellulaire17,18,19 que leur propriété de différenciation. L’un des avantages les plus importants de l’utilisation de l’ADSC est la possibilité de perfusion ou de greffe autologue, devenant un traitement alternatif pour plusieurs maladies. Pour la médecine régénérative, les ADSC ont déjà été utilisés dans les cas de lésions hépatiques, de reconstruction du muscle cardiaque, de régénération du tissu nerveux, d’amélioration de la fonction musculaire squelettique, de régénération osseuse, de traitement du cancer et de traitement du diabète20,21.

À ce jour, il existe 263 essais cliniques enregistrés pour l’évaluation du potentiel de l’ADSC, répertoriés sur le site Web des National Institutes of Health des États-Unis22. Différents protocoles de prélèvement de tissu adipeux ont été établis, mais il n’y a pas de consensus dans la littérature sur une méthode normalisée pour isoler l’ADSC à des fins cliniques23,24. Les méthodes de traitement des lipoaspires pendant et après la chirurgie peuvent affecter directement la viabilité cellulaire, le rendement cellulaire final25 et la qualité de la population ADSC20. En ce qui concerne le prétraitement chirurgical, il n’est pas bien établi quelle technique chirurgicale de prétraitement produit un nombre plus significatif de cellules viables après isolement ou si la solution anesthésique injectée dans le tissu adipeux affecte le rendement cellulaire et ses fonctions26. De même, la différence entre les techniques d’obtention de cellules adipeuses peut entraîner une diminution allant jusqu’à 70% du nombre d’ADSC20 viables. Selon la littérature, les traitements mécaniques visant à obtenir des populations cellulaires à haute viabilité - y compris les ultrasons - doivent être évités, car ils peuvent décomposer le tissu adipeux20. Cependant, la méthode d’aspiration manuelle des graisses avec des seringues est moins nocive, causant moins de destruction cellulaire, la liposuccion tumescente produisant un nombre important de cellules de la meilleure qualité26.

Cette technique utilise une solution saline avec de la lidocaïne et de l’épinéphrine qui est injectée dans la zone de liposuccion. Pour chaque volume de 3 mL de solution injecté, 1 mL est aspiré. Dans cette étude, la technique de liposuccion humide a été réalisée, dans laquelle pour chaque 1 mL d’adrénaline et de solution saline injectée, 0,2 mL de tissu adipeux est aspiré. L’utilisation d’enzymes digestives, en particulier de collagénase, est courante pour le processus d’isolement de l’ADSC.

Après la première étape d’isolement en laboratoire, la pastille finale est appelée fraction vasculaire stromale (SVF). Il contient différents types de cellules27, y compris les cellules précurseurs endothéliales, les cellules endothéliales, les macrophages, les cellules musculaires lisses, les lymphocytes, les péricytes, les pré-adipocytes et les ADSC, qui sont capables d’adhérence. Une fois l’isolement final conclu à partir de cultures in vitro , les cellules qui n’adhéraient pas au plastique sont éliminées dans des échanges de milieu. Après huit semaines d’expansion, de changements moyens et de passages, les ADSC représentent la majeure partie de la population cellulaire dans les flacons20. L’un des avantages les plus importants de l’utilisation de cellules souches isolées dérivées du tissu adipeux pour une éventuelle thérapie future est la possibilité de cryoconservation. Il a été démontré que la lipoaspiration cryoconservée est une source potentielle de cellules SVF même après 6 semaines de congélation28, avec une activité biologique même après 2 ans de cryoconservation29, et une capacité totale de croissance et de différenciation en culture30. Cependant, au cours du processus de décongélation, un pourcentage considérable de cellules est généralement perdu31. Par conséquent, le processus d’élimination des lipoaspires et les méthodes suivantes d’isolement cellulaire doivent assurer le rendement cellulaire le plus élevé.

Cette étude décrit une méthodologie plus rapide pour collecter et isoler l’ADSC, démontrant un rendement cellulaire élevé et une viabilité pour une meilleure efficacité des thérapies cellulaires. De plus, l’effet de cette technique améliorée après cryoconservation à long terme de la SVF a été évalué.

Protocole

La présente étude est approuvée par le Comité d’éthique de l’UNIFESP (numéro de protocole : 0029/2015 CAAE : 40846215.0.0000.5505), réalisée après avoir obtenu le consentement éclairé écrit des patients conformément à la Déclaration d’Helsinki (2004). L’échantillon de la présente étude est composé de neuf patientes, âgées de 33 à 50 ans (âge moyen de 41,5 ans) et d’un indice de masse corporelle initial (IMC) moyen de 24,54 (allant de 22,32 à 26,77) (tableau 1) qui ont subi une abdominoplastie esthétique due à un excès de peau après la grossesse, à la Division de chirurgie plastique de l’Université fédérale de São Paulo (UNIFESP), Brésil. Pour réduire les biais, les patients ont été sélectionnés comme un groupe homogène en tenant compte du sexe, de l’âge et de l’IMC. Les ensembles de données utilisés et/ou analysés au cours de cette étude sont disponibles auprès de l’auteur correspondant sur demande raisonnable.

1. Collecte de lipoaspiration

REMARQUE: Cette étape doit être effectuée dans le centre de chirurgie.

  1. Utilisez du gluconate de chlorhexidine à 4 % (voir le tableau des matières) pour la préparation de la peau et l’asepsie.
    1. Effectuer une incision cutanée sous-cutanée de 2 mm (entre le sous-derme et l’aponévrose). Insérer une canule Klein de calibre 3 trous et 3 mm de 26 mm et une seringue pour injecter un volume total de 500 mL d’une solution d’adrénaline (1 mg/mL) (voir le tableau des matières) diluée dans une solution saline (1:1 000 000) dans la zone infra-ombilicale.
  2. Connectez une seringue de 60 ml à une canule de liposuccion de calibre 3 G à trois trous et 3 mm de 26 mm et insérez-la à travers l’incision cutanée, en verrouillant le piston pour créer un vide.
    1. Faites des mouvements de poussée et de traction de sorte que, avec le vide créé, le lipoaspirateur reste dans la seringue de 60 mL.
  3. À l’aide d’un connecteur stérile muni d’une valve, transférer les 100 mL de lipoaspiration recueillie dans un sac de transfert de polychlorure de vinyle de 150 mL (voir le tableau des matières).
    1. Emballez le sac de transfert dans une boîte en polystyrène à température ambiante (~25 °C) et apportez-le immédiatement au laboratoire. Ne prenez pas plus de 30 minutes pour commencer le traitement des tissus.

2. Traitement de la lipoaspiration

NOTE: Cette étape doit être effectuée en laboratoire.

  1. Tout d’abord, pesez le sac, mesurez la température avec un thermomètre clinique infrarouge numérique sans contact et laissez le sac reposer pendant 5 minutes à l’intérieur de la chambre d’écoulement laminaire pour la précipitation des couches graisseuses (bulles) et la séparation tissulaire contenant les cellules d’intérêt.
    1. Effectuez une série de lavages de tissus. Premier lavage : injecter 100 mL de DPBS avec du calcium (1x) dans le sac de transfert et mélanger avec les mains.
    2. Laisser reposer pendant 5 minutes et enlever la majeure partie du liquide basal qui précipite.
    3. Jetez le liquide basal à l’aide d’une seringue de 60 ml fixée à l’adaptateur de sac. Ce processus doit être répété deux fois.
  2. Ajouter 100 mL de solution de digestion dans le sac (93 mL de DPBS sans calcium + 60 μL de chlorure de calcium (1 g/L) + 7 mL de collagénase stérile à 0,075 %, voir le tableau des matières) et laisser à 37 °C pendant 30 min sous agitation lente.
  3. Transvaser tout le contenu du sac dans quatre tubes coniques de 50 ml et les centrifuger à 400 x g à 22 °C pendant 10 min.
    1. Retirer et jeter le surnageant et ajouter 5 mL de faible teneur en glucose du milieu d’Eagle modifié (DMEM) de Dulbecco complété par 20 % de FBS (sérum fœtal bovin) à la pastille cellulaire (Figure 1).

3. Comptage des cellules SVF

  1. Mélanger une solution fraîche de 10 μL de bleu de trypan à 0,05% dans de l’eau distillée avec 10 μL de suspension cellulaire pendant 5 min.
  2. Compter les cellules viables dans une chambre de comptage des cellules de Neubauer32 à l’aide d’un microscope à lumière inversée (voir le tableau des matériaux) à un grossissement de 20x.
  3. Resuspendre la pastille cellulaire dans un milieu cryoprotecteur (5 mL de FBS + 10% de Dimethyl Sulfoxide - DMSO) à une concentration de 1 x 106 cellules/mL.
  4. Placez 1 mL de ce mélange dans des cryovials. Utiliser un contenant congélateur (voir le tableau des matières) avec une vitesse de refroidissement de (1 °C/min à -80 °C).
    1. Conserver à -80 °C pendant 1 an.
    2. Passé ce délai, conserver dans des boîtes de cassettes standard immergées dans la phase vapeur d’azote liquide (-165 °C).

4. Processus de décongélation des cellules

  1. Retirez les flacons de l’azote liquide et placez-les immédiatement dans le bain-marie à 37 °C pendant 1 min.
  2. Placer les cellules SVF dans un tube conique contenant 4 mL de DMEM (faible teneur en glucose supplémentée en FBS à 20 %) préchauffée à 37 °C.
  3. Centrifuger à 400 x g à 22 °C pendant 5 min.
  4. Retirer le surnageant et ajouter 1 mL de DMEM (faible teneur en glucose) + 10% FBS. Effectuez l’immunophénotypage en suivant les étapes ci-dessous.

5. Technique de cytométrie en flux (marquage multiple de l’immunophénotype)

  1. Placer 1 mL de pastille cellulaire (concentration de 1 000 cellules/μL) dans cinq tubes de cytométrie (200 μL chacun).
  2. Centrifuger à 400 x g à 22 °C pendant 5 min et jeter le surnageant à l’aide d’une pipette.
  3. Ajouter 300 μL de solution saline tamponnée au phosphate (PBS) (10x), centrifuger à 400 x g à 22 °C et jeter le surnageant à l’aide d’une pipette.
  4. Préparer cinq tubes pour différentes combinaisons de marqueurs comme suit : 5 μL de CD11B/5 μL de CD19/20 μL de CD45; 5 μL de CD73/20 μL de CD90/5 μL de CD105/20 μL de CD45; 20 μL de CD34/5 μL de HLA-DR/20 μL de CD45; Essai de viabilité cellulaire - 5 μL de colorant réactif fluorescent. (voir le tableau des matériaux) et un tube avec des cellules non colorées et du PBS comme témoin négatif. Homogénéiser dans un vortex et incuber à 4 °C pendant 30 min.
    1. Centrifuger à 400 x g à 22 °C pendant 5 min, jeter le surnageant à l’aide d’une pipette, ajouter 500 μL de PBS (10x) et procéder au tri des cellules.
      REMARQUE: Cinq mille événements sont acquis par anticorps défini dans le cytomètre en flux de quatre couleurs et cinq paramètres et analysés avec le logiciel CellQuest.

6. Ensemencement du passage 1 (P1)

  1. Semer 2 x 105 cellules dans une fiole de culture de 75 cm2 .
  2. Ajouter 12 mL de DMEM à faible taux de glucose + 20 % de FBS + 10 % d’antibiotiques/antimycotiques (avec 10 000 unités de pénicilline, 10 mg de streptomycine et 25 μg d’amphotéricine B par mL, 0,1 μm).
  3. Lorsque les cellules atteignent entre 80% et 90% de confluence, effectuer la trypsinisation des cellules adhérentes avec 2 mL d’EDTA-trypsine à 0,25% pendant 3 min.
  4. Comptez à nouveau les cellules (comme mentionné à l’étape 3).
  5. Effectuez à nouveau l’immunophénotypage (comme mentionné à l’étape 5).

7. Analyse statistique

  1. Utilisez le calculateur Rho33 de Spearman pour mesurer la force d’association entre les variables suivantes avec P < 0,05, comme mentionné ci-dessous.
    1. Sélectionnez le rendement cellulaire SVF et le nombre de jours SVF reste en culture dans le premier passage (P1) jusqu’à 80%-90% de confluence (jours à P1).
    2. Sélectionnez le rendement cellulaire SVF avant et après le passage à P1.
    3. Considérez les jours à P1 et le rendement cellulaire avant de passer à P1.
    4. Sélectionnez le rendement cellulaire SVF avec le pourcentage moyen d’ADSC confirmé.
    5. Calculez le pourcentage d’ADSC confirmé et le rendement cellulaire avant de passer à P1.
    6. Déterminez le rendement cellulaire de l’IMC et du SVF.

8. Essai de différenciation

  1. Effectuer le test de différenciation en suivant un protocole de kit de différenciation (voir Tableau des matériaux). La figure 4 illustre les résultats pour le cas 1.

Résultats

La caractérisation des neuf personnes étudiées, y compris leur âge, leur poids, leur taille et leur IMC, est présentée au tableau 1.

Selon le rendement cellulaire initialement présenté, le volume cellulaire inoculé en culture a été calculé pour être le plus proche possible de la capacité du ballon de culture de 75cm2. Le volume d’échantillon ensemencé dans chaque cas est décrit au tableau 2. Ensuite, selon le rendement cellulaire ...

Discussion

Rendement d’isolement
Il est bien établi que le procédé de cryoconservation, fréquemment requis en thérapie cellulaire, entraîne une perte cellulaire importante, parfois supérieure à 50%29,30,35. Ainsi, une amélioration technique pour obtenir un rendement cellulaire initial élevé isolément est fondamentale. La méthode de collecte des lipoaspirations et la méthode d’isolement des cellules doi...

Déclarations de divulgation

Les auteurs ne déclarent aucun intérêt financier concurrent.

Remerciements

Nous remercions les patients qui se sont portés volontaires pour participer et le personnel médical et infirmier de l’hôpital de São Paulo. Cette étude a été soutenue par la Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) et le Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq), Brésil.

matériels

NameCompanyCatalog NumberComments
1.8 mL cryovialsNunc Thermo Fisher Scientific340711
150 mL polyvinyl chloride transfer bagJP FARMA80146150059
2% Alizarin Red S Solution, pH 4.2Sigma AldrichA5533
Adrenaline (1 mg/mL)HipolaborNA
Alcian Blue solutionSigma Aldrich1,01,647
Antibiotic-Antimycotic 100xGibco15240062
BD FACSCalibur Flow Cytometer using BD CellQues Pro AnalysisBD BioSciencesNA
Calcium chloride 10%Merck102379
Chlorhexidine gluconate 4%VIC PHARMANA
Collagenase, Type I, powderGibco17018029
DMEM (Dulbecco's modified Eagle's medium)Gibco11966025
DPBS no calcium, no magnesium (Dulbecco's Phosphate Buffered Saline Gibco Cell Therapy Systems)GibcoA1285801
DPBS with calcium (Dulbecco's Phosphate Buffered Saline Gibco Cell Therapy Systems)GibcoA1285601
Fetal bovine serumGibco10500056
Formaldehyde 4%Sigma Aldrich1,00,496
Inverted light microscopeNikon Eclipse TS100NA
Live and Dead Cell AssayThermofisher01-3333-41 | 01-3333-42
Monoclonal antibody: CD105BD BioSciences745927
Monoclonal antibody: CD11BBD BioSciences746004
Monoclonal antibody: CD19BD BioSciences745907
Monoclonal antibody: CD34BD BioSciences747822
Monoclonal antibody: CD45DAKOM0701
Monoclonal antibody: CD73BD BioSciences746000
Monoclonal antibody: CD90BD BioSciences553011
Monoclonal antibody: HLA-DRBD BioSciences340827
Mr. Frosty Freezing ContainerThermo Fisher Scientific5100-0001
PBS (phosphate buffered saline) 1x pH 7.4Gibco 10010023
StemPro Adipogenesis Differentiation KitGibcoA1007001
StemPro Chondrogenesis Differentiation KitGibcoA1007101
StemPro Osteogenesis Differentiation KitGibcoA1007201
Sterile connector with one spike with needle injection siteOrigen Biomedical Connector, USANACode mark: IBS
Trypan blue solution 0.4%Sigma Aldrich93595
Trypsin-EDTA 0.25% 1x, phenol redGibco25200056

Références

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