Técnica para la obtención de células madre mesenquimales a partir de tejido adiposo y caracterización de fracciones vasculares estromales en criopreservación a largo plazo

Resumen

El presente protocolo describe una metodología mejorada para el aislamiento de ADSC que resulta en un tremendo rendimiento celular con ganancia de tiempo en comparación con la literatura. Este estudio también proporciona un método sencillo para obtener un número relativamente grande de células viables después de la criopreservación a largo plazo.

Resumen

Las células madre mesenquimales humanas derivadas del tejido adiposo se han vuelto cada vez más atractivas, ya que muestran características apropiadas y son una fuente accesible para aplicaciones clínicas regenerativas. Se han utilizado diferentes protocolos para obtener células madre derivadas de tejido adiposo. Este artículo describe diferentes pasos de un protocolo mejorado de ahorro de tiempo para obtener una cantidad más significativa de ADSC, mostrando cómo criopreservar y descongelar ADSC para obtener células viables para la expansión del cultivo. Se recolectaron cien mililitros de lipoaspirado, utilizando una liposucción de jeringa de 26 cm de tres orificios y calibre 3 mm, del área abdominal de nueve pacientes que posteriormente se sometieron a una abdominoplastia electiva. El aislamiento de células madre se llevó a cabo con una serie de lavados con solución salina tamponada con fosfato (DPBS) de Dulbecco suplementada con calcio y el uso de colagenasa. Las células de la fracción vascular estromal (SVF) fueron criopreservadas, y su viabilidad fue comprobada por inmunofenotipado. El rendimiento celular SVF fue de 15,7 x 10⁵ células/ml, variando entre 6,1-26,2 células/ml. Las células SVF adherentes alcanzaron la confluencia después de un promedio de 7,5 (±4,5) días, con un rendimiento celular promedio de 12,3 (± 5,7) x 10⁵ células/ml. La viabilidad de la FV descongelada después de 8 meses, 1 año y 2 años varió entre 23,06% -72,34% con un promedio de 47,7% (±24,64) con la viabilidad más baja correlacionada con casos de congelación a dos años. El uso de la solución de DPBS suplementada con calcio y tiempos de reposo de bolsas para la precipitación de grasas con un tiempo más corto de digestión de la colagenasa dio como resultado un aumento del rendimiento celular final de las células madre. El procedimiento detallado para obtener altos rendimientos de células madre viables fue más eficiente en cuanto a tiempo y rendimiento celular que las técnicas de estudios anteriores. Incluso después de un largo período de criopreservación, se encontraron células ADSC viables en el SVF.

Introducción

Las células madre mesenquimales humanas son ventajosas tanto en la investigación básica como en la aplicada. El uso de este tipo de células adultas supera las cuestiones éticas, en comparación con el uso de células embrionarias u otras, siendo una de las áreas de estudio más prometedoras en ingeniería de regeneración tisular autóloga y terapia celular¹, como el área neoplásica, el tratamiento de enfermedades degenerativas y aplicaciones terapéuticas en el área de cirugía reconstructiva 2,3,4^{, 5}. Se ha relatado previamente que existe una fuente abundante de células madre mesenquimales multipotentes y pluripotentes en la fracción de células vasculares estromales del tejido adiposo ^6,7. Estos ADSC se consideran excelentes candidatos para su uso en terapia celular y trasplante/infusión, ya que un número considerable de células con una fuerte capacidad de expansión ex vivo se pueden obtener fácilmente con un alto rendimiento de un procedimiento mínimamente invasivo ^5,8.

También se demostró que el tejido adiposo presenta una mayor capacidad para proporcionar células madre mesenquimales que otras dos fuentes (médula ósea y tejido del cordón umbilical)⁹. Además de ser poco inmunogénico y tener una alta capacidad para integrarse en el tejido huésped e interactuar con los tejidos circundantes^4,10, el ADSC tiene una capacidad multipotente de diferenciación en líneas celulares, con informes de diferenciación condrogénica, osteogénica y miogénica en condiciones de cultivo apropiadas^11,12,13, y en células, como pancreáticas, hepatocitos^, y células neurogénicas^14,15,16.

La comunidad científica está de acuerdo en que el efecto inmunomodulador de las células madre mesenquimales es un mecanismo de acción más relevante para la terapia celular^17,18,19 que su propiedad de diferenciación. Uno de los méritos más significativos del uso de ADSC es la posibilidad de infusión autóloga o injerto, convirtiéndose en un tratamiento alternativo para varias enfermedades. Para la medicina regenerativa, ADSC ya han sido utilizados en casos de daño hepático, reconstrucción del músculo cardíaco, regeneración del tejido nervioso, mejora de la función del músculo esquelético, regeneración ósea, terapia del cáncer y tratamiento de la diabetes^20,21.

Hasta la fecha, hay 263 ensayos clínicos registrados para la evaluación del potencial de ADSC, enumerados en el sitio web de los Institutos Nacionales de Salud de los Estados Unidos²². Se han establecido diferentes protocolos para la recolección de tejido adiposo, pero no hay consenso en la literatura sobre un método estandarizado para aislar ADSC para uso clínico^23,24. Los métodos de procesamiento de lipoaspirados durante y después de la cirugía pueden afectar directamente la viabilidad celular, el rendimiento celular final²⁵ y la calidad de la población ADSC²⁰. En cuanto al pretratamiento quirúrgico, no está bien establecido qué técnica quirúrgica de pretratamiento produce un número más significativo de células viables después del aislamiento o si la solución anestésica inyectada en el tejido adiposo afecta el rendimiento celular y sus funciones²⁶. Del mismo modo, la diferencia entre las técnicas para obtener células adiposas puede conducir a una disminución de hasta el 70% en el número de ADSC²⁰ viables. De acuerdo con la literatura, los tratamientos mecánicos para obtener poblaciones celulares con alta viabilidad, incluyendo ultrasonidos, deben ser evitados, ya que pueden descomponer el tejido adiposo²⁰. Sin embargo, el método manual de aspiración de grasa con jeringas es menos dañino, causando menos destrucción celular, con liposucción tumescente produciendo un número significativo de células con la mejor calidad²⁶.

Esta técnica utiliza una solución salina con lidocaína y epinefrina que se inyecta en el área de liposucción. Por cada volumen de 3 ml de solución inyectada, se aspira 1 ml. En este estudio, se realizó la técnica de liposucción húmeda, en la que por cada 1 mL de adrenalina y solución salina inyectada, se aspiran 0,2 mL de tejido adiposo. El uso de enzimas digestivas, especialmente colagenasa, es común para el proceso de aislamiento de ADSC.

Después del primer paso de aislamiento en el laboratorio, el pellet final se llama fracción vascular estromal (SVF). Contiene diferentes tipos de células²⁷, incluyendo células precursoras endoteliales, células endoteliales, macrófagos, células musculares lisas, linfocitos, pericitos, preadipocitos y ADSC, que son capaces de adhesión. Una vez concluido el aislamiento final a partir de cultivos in vitro , las células que no se adhirieron al plástico se eliminan en intercambios de medios. Después de ocho semanas de expansión, cambios de medio y pasajes, las ADSC representan la mayor parte de la población celular en los frascos²⁰. Una de las ventajas más significativas del uso de células madre aisladas derivadas de tejido adiposo para una posible terapia futura es la posibilidad de criopreservación. Se demostró que el lipoaspirado criopreservado es una fuente potencial de células SVF incluso después de 6 semanas de congelación²⁸, con actividad biológica incluso después de 2 años de criopreservación²⁹, y plena capacidad para crecer y diferenciarse en cultivo³⁰. Sin embargo, durante el proceso de descongelación, un porcentaje considerable de células generalmente se pierde³¹. Por lo tanto, el proceso de eliminación de lipoaspirado y los siguientes métodos de aislamiento celular deben garantizar el mayor rendimiento celular.

Este estudio describe una metodología más rápida para recolectar y aislar ADSC, demostrando un alto rendimiento celular y viabilidad para una mejor eficiencia de la terapéutica celular. Además, se evaluó el efecto de esta técnica mejorada después de la criopreservación de SVF a largo plazo.

Protocolo

El presente estudio es aprobado por el Comité de Ética de la UNIFESP (número de protocolo: 0029/2015 CAAE: 40846215.0.0000.5505), realizado después de obtener el consentimiento informado por escrito de los pacientes de acuerdo con la Declaración de Helsinki (2004). La muestra del presente estudio está compuesta por nueve pacientes del sexo femenino, con edades de 33-50 años (edad promedio 41,5) y promedio de índice de masa corporal inicial (IMC) de 24,54 (variando entre 22,32-26,77) (Tabla 1) que fueron sometidas a abdominoplastia estética por exceso de piel después del embarazo, en la División de Cirugía Plástica de la Universidad Federal de São Paulo (Unifesp), Brasil. Para reducir el sesgo, los pacientes fueron seleccionados como un grupo homogéneo considerando el sexo, la edad y el IMC. Los conjuntos de datos utilizados y/o analizados durante este estudio están disponibles del autor correspondiente previa solicitud razonable.

1. Recolección de lipoaspirado

NOTA: Este paso debe realizarse en el centro de cirugía.

1. Use gluconato de clorhexidina al 4% (consulte la Tabla de materiales) para la preparación de la piel y la asepsia.
   1. Realizar una incisión cutánea subcutánea de 2 mm (entre la subdermis y la aponeurosis). Inserte una cánula Klein de 26 mm 3 G calibre tres orificios y 3 mm y una jeringa para inyectar un volumen total de 500 ml de una solución de adrenalina (1 mg/ml) (ver Tabla de materiales) diluida en solución salina (1:1.000.000) en el área infraumbilical.
2. Conecte una jeringa de 60 ml a una cánula de liposucción de 26 mm 3 G de tres orificios y calibre 3 mm e insértela a través de la incisión de la piel, bloqueando el émbolo para crear un vacío.
   1. Realice movimientos de empuje y tracción para que, con el vacío creado, el lipoaspirado permanezca en la jeringa de 60 ml.
3. Usando un conector estéril con una válvula, transfiera los 100 ml del lipoaspirado recolectado a una bolsa de transferencia de cloruro de polivinilo de 150 ml (consulte la Tabla de materiales).
   1. Empaque la bolsa de transferencia en una caja de poliestireno a temperatura ambiente (~ 25 ° C) y llévela inmediatamente al laboratorio. No tome más de 30 minutos para iniciar el procesamiento del tejido.

2. Procesamiento de lipoaspirado

NOTA: Este paso debe realizarse en el laboratorio.

1. Primero, pese la bolsa, mida la temperatura con un termómetro clínico infrarrojo digital sin contacto y deje la bolsa reposando durante 5 minutos dentro de la cámara de flujo laminar para la precipitación de las capas más grasas (burbujas) y la separación de tejidos que contienen las células de interés.
   1. Realizar una serie de lavados de tejidos. Primer lavado: inyecte 100 mL de DPBS con calcio (1x) en la bolsa de transferencia y mézclelo con las manos.
   2. Deje reposar durante 5 minutos y retire la mayor parte del líquido basal que precipita.
   3. Deseche el líquido basal con una jeringa de 60 ml conectada al adaptador de bolsa. Este proceso debe repetirse dos veces.
2. Añadir 100 ml de solución digestiva a la bolsa (93 ml de DPBS sin calcio + 60 μL de cloruro de calcio (1 g/L) + 7 ml de colagenasa estéril al 0,075%, ver Tabla de materiales) y dejar a 37 °C durante 30 min de agitación lenta.
3. Transfiera todo el contenido de la bolsa a cuatro tubos cónicos de 50 ml y centrifugarlos a 400 x g a 22 °C durante 10 min.
   1. Retire y deseche el sobrenadante y agregue 5 ml de glucosa baja en el medio de Eagle modificado (DMEM) de Dulbecco suplementado con FBS al 20% (suero fetal bovino) al pellet celular (Figura 1).

3. Recuento de las células SVF

1. Mezclar una solución fresca de 10 μL de azul de tripano al 0,05% en agua destilada con 10 μL de suspensión celular durante 5 min.
2. Cuente células viables en una cámara de recuento de células^{Neubauer 32} utilizando un microscopio de luz invertida (consulte la Tabla de materiales) con un aumento de 20x.
3. Resuspender el pellet celular en un medio crioprotector (5 mL de FBS + 10% de Dimetilsulfóxido - DMSO) a una concentración de 1 x 10⁶ células/mL.
4. Coloque 1 ml de esta mezcla en crioviales. Utilice un recipiente de congelación (consulte la Tabla de materiales) con una velocidad de enfriamiento de (1 °C/min a -80 °C).
   1. Conservar a -80 °C durante 1 año.
   2. Después de este tiempo, conservar en cajas de casetes estándar sumergidas en la fase de vapor de nitrógeno líquido (-165 °C).

4. Proceso de descongelación de las células

1. Retirar los viales del nitrógeno líquido y colocarlos inmediatamente en el baño maría a 37 °C durante 1 min.
2. Coloque las células SVF en un tubo cónico con 4 ml de DMEM (bajo nivel de glucosa suplementado con 20% de FBS) precalentado a 37 °C.
3. Centrifugar a 400 x g a 22 °C durante 5 min.
4. Retire el sobrenadante y agregue 1 ml de DMEM (glucosa baja) + 10% FBS. Realice el inmunofenotipado siguiendo los pasos a continuación.

5. Técnica de citometría de flujo (marcaje múltiple de inmunofenotipo)

1. Colocar 1 ml de pellet celular (concentración de 1.000 células/μL) en cinco tubos de citometría (200 μL cada uno).
2. Centrifugar a 400 x g a 22 °C durante 5 min y desechar el sobrenadante con una pipeta.
3. Añadir 300 μL de solución salina tamponada con fosfato (PBS) (10x), centrifugar a 400 x g a 22 °C y desechar el sobrenadante con una pipeta.
4. Preparar cinco tubos para diferentes combinaciones de marcadores de la siguiente manera: 5 μL de CD11B/5 μL de CD19/20 μL de CD45; 5 μL de CD73/20 μL de CD90/5 μL de CD105/20 μL de CD45; 20 μL de CD34/5 μL de HLA-DR/20 μL de CD45; Ensayo de viabilidad celular-5 μL de colorante reactivo fluorescente. (ver Tabla de Materiales) y un tubo con células no teñidas y PBS como control negativo. Homogeneizar en un vórtice e incubar a 4 °C durante 30 min.
   1. Centrifugar a 400 x g a 22 °C durante 5 min, desechar el sobrenadante con una pipeta, añadir 500 μL de PBS (10x) y proceder a la clasificación celular.
      NOTA: Se adquieren cinco mil eventos por anticuerpo establecido en el citómetro de flujo de cuatro colores y cinco parámetros y se analizan con el software CellQuest.

6. Siembra del pasaje 1 (P1)

1. Semilla 2 x 10⁵ células en un matraz de cultivo de 75^cm2 .
2. Agregue 12 ml de DMEM bajo en glucosa + 20% de FBS + 10% antibiótico / antimicótico (con 10,000 unidades de penicilina, 10 mg de estreptomicina y 25 μg de anfotericina B por ml, 0.1 μm).
3. Cuando las células alcancen entre 80%-90% de confluencia, realizar tripsinización de células adherentes con 2 mL de 0,25% EDTA-tripsina durante 3 min.
4. Vuelva a contar las celdas (como se mencionó en el paso 3).
5. Realice nuevamente el inmunofenotipado (como se mencionó en el paso 5).

7. Análisis estadístico

1. Utilice la calculadora Rho³³ de Spearman para medir la fuerza de asociación entre las siguientes variables con P < 0.05, como se menciona a continuación.
   1. Seleccione el rendimiento celular SVF y el número de días que SVF permanece en cultivo en el primer paso (P1) hasta 80%-90% de confluencia (días hasta P1).
   2. Seleccione el rendimiento celular SVF antes y después de pasar a P1.
   3. Considere los días para P1 y el rendimiento celular antes de ir a P1.
   4. Seleccione el rendimiento celular SVF con el porcentaje promedio de ADSC confirmado.
   5. Calcule el porcentaje de ADSC confirmado y el rendimiento celular antes de pasar a P1.
   6. Determinar el IMC y el rendimiento celular SVF.

8. Ensayo de diferenciación

1. Realice el ensayo de diferenciación siguiendo un protocolo de kit de diferenciación (ver Tabla de materiales). La Figura 4 muestra los resultados para el Caso 1.

Resultados

La caracterización de los nueve individuos estudiados, incluyendo su edad, peso, talla e IMC, se muestra en la Tabla 1.

De acuerdo con el rendimiento celular presentado inicialmente, se calculó que el volumen celular inoculado en cultivo era lo más cercano posible a la capacidad del matraz de cultivo de 75 cm². El volumen muestral sembrado en cada caso se describe en la Tabla 2. Luego, de acuerdo con el rendimiento celular inicial, se determinó ...

Discusión

Rendimiento de aislamiento
Está bien establecido que el proceso de criopreservación, frecuentemente requerido en la terapia celular, resulta en una pérdida celular significativa, a veces superior al 50%29,30,35. Por lo tanto, una mejora técnica para obtener un alto rendimiento celular inicial en aislamiento es fundamental. El método de recolección de lipoaspirado y el método de aislamiento de las célu...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.8 mL cryovials	Nunc Thermo Fisher Scientific	340711
150 mL polyvinyl chloride transfer bag	JP FARMA	80146150059
2% Alizarin Red S Solution, pH 4.2	Sigma Aldrich	A5533
Adrenaline (1 mg/mL)	Hipolabor	NA
Alcian Blue solution	Sigma Aldrich	1,01,647
Antibiotic-Antimycotic 100x	Gibco	15240062
BD FACSCalibur Flow Cytometer using BD CellQues Pro Analysis	BD BioSciences	NA
Calcium chloride 10%	Merck	102379
Chlorhexidine gluconate 4%	VIC PHARMA	NA
Collagenase, Type I, powder	Gibco	17018029
DMEM (Dulbecco's modified Eagle's medium)	Gibco	11966025
DPBS no calcium, no magnesium (Dulbecco's Phosphate Buffered Saline Gibco Cell Therapy Systems)	Gibco	A1285801
DPBS with calcium (Dulbecco's Phosphate Buffered Saline Gibco Cell Therapy Systems)	Gibco	A1285601
Fetal bovine serum	Gibco	10500056
Formaldehyde 4%	Sigma Aldrich	1,00,496
Inverted light microscope	Nikon Eclipse TS100	NA
Live and Dead Cell Assay	Thermofisher	01-3333-41 | 01-3333-42
Monoclonal antibody: CD105	BD BioSciences	745927
Monoclonal antibody: CD11B	BD BioSciences	746004
Monoclonal antibody: CD19	BD BioSciences	745907
Monoclonal antibody: CD34	BD BioSciences	747822
Monoclonal antibody: CD45	DAKO	M0701
Monoclonal antibody: CD73	BD BioSciences	746000
Monoclonal antibody: CD90	BD BioSciences	553011
Monoclonal antibody: HLA-DR	BD BioSciences	340827
Mr. Frosty Freezing Container	Thermo Fisher Scientific	5100-0001
PBS (phosphate buffered saline) 1x pH 7.4	Gibco	10010023
StemPro Adipogenesis Differentiation Kit	Gibco	A1007001
StemPro Chondrogenesis Differentiation Kit	Gibco	A1007101
StemPro Osteogenesis Differentiation Kit	Gibco	A1007201
Sterile connector with one spike with needle injection site	Origen Biomedical Connector, USA	NA	Code mark: IBS
Trypan blue solution 0.4%	Sigma Aldrich	93595
Trypsin-EDTA 0.25% 1x, phenol red	Gibco	25200056