Authors
Contact Us

Sign In

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

يتيح الفحص المجهري ثلاثي الفوتونات التصوير الفلوري عالي التباين في عمق الأنسجة البيولوجية الحية، مثل أدمغة الفئران وأسماك الزرد، بدقة مكانية زمانية عالية.

Abstract

تعد تقنيات الفحص المجهري متعدد الفوتونات ، مثل المجهر ثنائي الفوتون (2PM) والمجهر ثلاثي الفوتونات (3PM) ، أدوات قوية للتصوير العميق للأنسجة في الجسم الحي بدقة دون الخلايا. 3PM له ميزتان رئيسيتان لتصوير الأنسجة العميقة على مدار 2 مساء والتي تم استخدامها على نطاق واسع في مختبرات الأحياء: (i) طول التوهين الأطول في الأنسجة المبعثرة عن طريق استخدام ~ 1,300 نانومتر أو ~ 1,700 نانومتر ليزر الإثارة. (ii) توليد تألق أقل في الخلفية بسبب الإثارة غير الخطية ذات الترتيب الأعلى. ونتيجة لذلك ، يسمح 3PM بالتصوير الهيكلي والوظيفي عالي التباين في عمق الأنسجة المتناثرة مثل دماغ الفأر السليم من الطبقات القشرية إلى الحصين والدماغ الأمامي بأكمله لأسماك الزرد البالغة.

اليوم ، تتوفر مصادر الليزر المناسبة ل 3PM تجاريا ، مما يتيح تحويل نظام تصوير حالي ثنائي الفوتون (2P) إلى نظام ثلاثي الفوتون (3P). بالإضافة إلى ذلك ، تتوفر العديد من المجاهر التجارية 3P ، مما يجعل هذه التقنية متاحة بسهولة لمختبرات أبحاث علم الأحياء. تظهر هذه الورقة تحسين إعداد 3PM النموذجي ، خاصة استهداف مجموعات البيولوجيا التي لديها بالفعل إعداد 2P ، وتوضح التصوير ثلاثي الأبعاد داخل الحيوية في أدمغة الفئران وأسماك الزرد البالغة السليمة. يغطي هذا البروتوكول الإجراء التجريبي الكامل للتصوير ثلاثي الأبعاد ، بما في ذلك محاذاة المجهر ، والنقيق المسبق لنبضات الليزر ~ 1,300 و ~ 1,700 نانومتر ، وإعداد الحيوانات ، والتصوير الفلوري 3P داخل الحيوية في عمق أزهار الزرد والفئران البالغة.

Introduction

في علوم الحياة ، كانت تقنيات الفحص المجهري متعدد الفوتونات (MPM) ، مثل 2PM و 3PM ، أدوات قوية للتصوير العميق في الجسم الحي بدقة مكانية زمانية عالية وتباين عال في الأنسجة المبعثرة. بالإضافة إلى ذلك ، تسبب هذه الطرق تبييضا ضوئيا أقل عند مقارنتها بالمجهر البؤري بفوتون واحد1،2،3،4. يعد 3PM مفيدا لتصوير الأنسجة العميقة عند مقارنته ب 2PM بسبب ميزتين رئيسيتين: (i) استخدام إثارة الطول الموجي الأطول (~ 1,300 nm أو ~ 1,700 nm) يقلل من تشتت الأنسجة ، و (ii) عملية الإثارة ذات الترتيب الأعلى (أي أن إشارة التألق تعتمد على مكعب قوة الإثارة في 3PM بدلا من مربع قوة الإثارة في 2PM) التي تمنع التألق الخلفية غير المرغوب فيه3 . وبالتالي ، يتيح 3PM التصوير عالي التباين في المناطق العميقة في الأنسجة الحية مثل الحصين في دماغ فأر بالغ سليم3،5،6،7،8،9،10،11 والدماغ الأمامي بأكمله من الزرد البالغ 12 ، بما في ذلك Ca2 + تسجيل النشاط والملاحظات متعددة الألوان. علاوة على ذلك ، تم الحصول على صور عالية التباين مع 3PM من خلال الجماجم السليمة للفئران وأسماك الزرد البالغة12,13.

اليوم ، تتوفر مصادر ليزر الإثارة المناسبة لإثارة 3P (3PE) عند ~ 1,300 و ~ 1,700 نانومتر تجاريا. نظرا لأن نظام المسح الضوئي بالليزر هو نفسه في الأساس في 2PM و 3PM ، فإن تحويل إعداد 2P الحالي إلى إعداد 3P ممكن في مختبرات البيولوجيا مع تركيب ليزر متاح تجاريا ل 3PE. تعتمد إشارة التألق 3P على طاقة الليزر ومدة النبض ومعدل تكرار الليزر والفتحة العددية (NA) للعدسة الموضوعية. بافتراض التركيز البؤري المحدود بالحيود (أي أن الفتحة الخلفية للعدسة الموضوعية ممتلئة بشعاع الإثارة) ، يصف Eq (1) تدفق فوتون التألق في المتوسط الزمني من الحجم البؤري الناتج عن 3PE.

figure-introduction-2132 (1)

حيث f هو معدل تكرار الليزر ، τ هو مدة نبضة الليزر (العرض الكامل عند نصف الحد الأقصى) ، φ هو كفاءة جمع النظام ، η هو الكفاءة الكمومية الفلورية ، σ3 هو المقطع العرضي لامتصاص 3P ، C هو تركيز الفلوروفور ، n0 هو المؤشر العاكس لوسط العينة (على سبيل المثال ، الماء) ، λ هو الطول الموجي للإثارة في الفراغ ، NA هي الفتحة العددية للعدسة الموضوعية ، و 3 هي ثابت التكامل المكاني للحجم البؤري ، وهي تدفق فوتون الإثارة المتوسط زمنيا (الفوتونات / الفوتونات) تحت العدسة الموضوعية ، z هو العمق المصور ، figure-introduction-2870 و EAL هو طول التوهين الفعال14. هنا افترضنا أن EAL (عادة > 100 ميكرومتر) أكبر بكثير من الدقة المحورية للمجهر (عادة < 10 ميكرومتر). تحت التقريب الباراكسي ، يساوي3 28.114. g p(3) هو التماسك الزمني من الدرجة الثالثة لمصدر الإثارة ، و g p(3) هو 0.41 و 0.51 للنبضات المربعة القاطعة المفرطة والنبضات الغاوسية ، على التوالي. يمكن تقدير كفاءة الجمع φ من خلال النظر في جمع التألق بواسطة العدسة الموضوعية ، ونفاذية العدسة الموضوعية ، وانعكاسية المرآة ثنائية اللون ، ونفاذية المرشحات ، وكفاءة الكشف عن الكاشف (على سبيل المثال ، أنبوب المضاعف الضوئي ، أو PMT). نظرا لأن كثافة التألق 3P تعتمد بشكل كبير على معلمات مختلفة ، فإن تحسين إعداد 3P مطلوب لزيادة إشارات التألق 3P إلى أقصى حد.

يوضح هذا البروتوكول عملية التحسين لإعداد 3P النموذجي ، والذي سيكون مفيدا بشكل خاص لمختبرات البيولوجيا التي لديها إعداد 2P وتخطط لتوسيع قدرتها على التصوير 3P أو للحفاظ على إعداد 3P التجاري الخاص بها في الأداء الأمثل. توضح مقالة الفيديو هذه أيضا تصوير 3P للأنسجة العميقة في أدمغة الحيوانات الحية. يتناول القسم الأول تحسين إعداد 3P النموذجي باستخدام مصدر ليزر متاح تجاريا ومجهر متعدد الفوتونات. يصف القسمان الثاني والثالث إعداد الزرد والفأر ، على التوالي ، ل 3PM من الهياكل والأنشطة العصبية. تم الإبلاغ عن جراحة استئصال القحف بالفئران سابقا في أوراق البروتوكول وكذلك 15،16،17. يوضح القسم الرابع التصوير 3P داخل الحيوية في أدمغة الزرد والفئران.

Protocol

تمت الموافقة على جميع التجارب على الحيوانات وإجراءات الإسكان لأسماك الزرد والفئران وأجريت وفقا لإرشادات اللجنة المؤسسية لرعاية واستخدام الحيوانات بجامعة كورنيل (IACUC). تم قتل الزرد والفئران الرحيمة بواسطة محلول تريكاين عالي التركيز واختناق ثاني أكسيد الكربون ، على التوالي ، بعد التجربة.

1. تحسين إعداد المجهر ثلاثي الفوتونات

ملاحظة: ارتداء نظارات السلامة بالليزر لحماية العين. احجب شعاع الليزر باستخدام مانع الشعاع عند وضع البصريات أو تحريكها. لتصور الليزر، استخدم عارض الأشعة تحت الحمراء أو بطاقة كاشف الأشعة تحت الحمراء.

  1. قم بتشغيل الليزر واضبط الطول الموجي المركزي لخرج الخمول للمضخم البارامتري البصري غير الخطي (NOPA) على ~ 1,300 نانومتر أو ~ 1,700 نانومتر.
  2. ضع زجاجا رقيقا على خط الشعاع من منفذ إشارة NOPA (أي ~ 700-900 نانومتر) لعكس جزء صغير من شعاع الليزر إلى صمام ثنائي ضوئي Si للحصول على إشارات محفزة (الشكل 1). ضع مانع شعاع في مسار انتقال زجاج الغطاء.
  3. ضع ضواغط النبض على مسار الضوء لتحريك ليزر الفيمتو ثانية مسبقا لتحسين مدة النبض لمدة 3 مساء. بالنسبة لشعاع 1,300 نانومتر تقريبا، ضع ضاغط زوج المنشور18,19 (على سبيل المثال، أزواج منشورات N-SF11). بالنسبة لليزر ~ 1,700 نانومتر ، ضع لوحة Si بسماكة ~ 3 مم20. اضبط الزاوية بين لوحة Si ومسار الليزر بزاوية بروستر (~ 73.9 درجة ل 1700 نانومتر) لزيادة نفاذية الليزر. قم بتدوير لوحة Si لتحقيق زاوية بروستر عن طريق تقليل الانعكاس.
  4. ضع مرايا الزعانف لتمكين التبديل المريح بين خطوط شعاع ~ 1,300 نانومتر و ~ 1,700 نانومتر.
  5. ضع صفيحة موجية نصف (على سبيل المثال ، صفيحة موجية نصف لونية مناسبة ل ~ 1,300 و ~ 1,700 نانومتر) مثبتة على مرحلة دوران وفاصل شعاع استقطاب (PBS) للتحكم في شدة الليزر. ضع مانع شعاع في مسار انعكاس PBS.
    ملاحظة: يحتاج الليزر إلى المرور عبر PBS بشكل عمودي لتحقيق نسبة انقراض عالية. يتم التحكم في طاقة الليزر ل 3PM عن طريق تدوير نصف اللوحة الموجة.
  6. ضع زجاج غطاء رقيق في مسار الضوء بعد وحدة التحكم في الطاقة وقبل الغالق البصري لعكس جزء صغير من شعاع الليزر إلى مقياس الطاقة. استخدم عداد الطاقة ك "مقياس طاقة مرجعي" لحساب طاقة الليزر تحت الهدف أثناء التصوير (انظر الخطوة 1.12).
  7. قم بمحاذاة مسار الليزر عن طريق ضبط المرايا لنشر الشعاع في نظام 3PM.
  8. قم بقياس حجم الشعاع في موضع الفتحة الخلفية للهدف باستخدام حافة سكين على مرحلة الترجمة ومقياس الطاقة. تأكد من أن حجم الشعاع ليس صغيرا جدا أو كبيرا جدا.
    ملاحظة: عادة ما يكون الشعاع أقل قليلا من العدسة عالية NA الموضوعية لتحقيق إنتاجية عالية الطاقة لتصوير الأنسجة العميقة. على سبيل المثال ، يساعد حجم الشعاع ~ 10-13 مم (1 / e2) في الفتحة الخلفية لهدف Olympus (قطر الفتحة الخلفية ~ 15 مم) على تحقيق NA فعال يبلغ ~ 0.7-0.9. عندما يكون حجم الشعاع صغيرا جدا ، تصبح إشارة 3P ضعيفة ، وتزداد الدقة المكانية سوءا بسبب انخفاض فعالية NA. عندما يكون حجم الشعاع كبيرا جدا ، يصبح الحد الأقصى لقوة الإثارة المتاحة تحت الهدف ضعيفا بسبب فقدان الطاقة في الفتحة الخلفية للهدف. بالنسبة لتصوير الأنسجة العميقة ، تعاني الأشعة الهامشية أيضا من خسارة أعلى بسبب المسار الأطول في الأنسجة.
  9. إذا كان حجم الشعاع في الفتحة الخلفية للهدف غير مناسب ، فضع العناصر البصرية المناسبة ، مثل العدسات المحدبة ، في مسار شعاع الليزر لضبط حجم الشعاع.
    ملاحظة: تأكد من أن شعاع الليزر ليس أكبر من مرايا galvo لمنع فقدان الطاقة غير الضروري.
  10. ضع العدسة الموضوعية على إعداد 3PM.
  11. قم بقياس مدة النبض بعد الهدف باستخدام جهاز ربط تلقائي. اضبط ضاغط النبض لتحقيق نبضات أقصر إذا كانت مدة النبض طويلة جدا (على سبيل المثال، >70 fs). استخدم نبضات ~ 50-70 fs ل 3PM ومقياس تداخل Michelson الموضوع بين الليزر والهدف لتوفير التأخير لقياسات الارتباط الذاتي.
    ملاحظة: يمكن للصمام الثنائي الضوئي ذو الاستجابة الطيفية المناسبة (على سبيل المثال ، الصمام الثنائي الضوئي السيليكوني للطول الموجي الأكبر من 1200 نانومتر) الموضوعة في بؤرة الهدف أن تكون بمثابة كاشف غير خطي ، ويمكن استخدام التيار الضوئي ثنائي الفوتون من الصمام الثنائي الضوئي للحصول على آثار الارتباط الذاتي20. يمكن ضبط ضاغط زوج المنشور ل ~ 1300 نانومتر بطريقتين: (1) تغيير المسافة بين المنشورين. (2) تغيير أطوال مسارات شعاع الليزر في زجاج المنشور عن طريق تحريك المنشور (المنشورات) عموديا على خط الأساس للمنشور. يمكن ضبط ضاغط لوحة Si لحوالي 1700 نانومتر عن طريق استبدال لوحة Si بلوحة Si أكثر سمكا أو أرق.
  12. ضع عداد طاقة عند إخراج العدسة الموضوعية. قم بقياس طاقة الليزر تحت الهدف واقرأ قيمة مقياس الطاقة المرجعي (من الخطوة 1.6). احسب نسبة الطاقة تحت الهدف وعند مقياس الطاقة المرجعي.
    ملاحظة: أثناء التصوير ، يمكن حساب طاقة الليزر الفعلية تحت الهدف من نسبة الطاقة وقيمة مقياس الطاقة المرجعي.
  13. أخرج عداد الطاقة من تحت الهدف.
  14. [اختياري] التحقق من الأداء المحدود لضوضاء الفوتون لنظام التصوير
    ملاحظة: لتنفيذ هذه المهمة ، هناك حاجة إلى العناصر التالية: 1) واحد فلوريسين أو تجمع صبغة تكساس الحمراء (على سبيل المثال ، ~ 10 ميكرومتر) ، 2) عداد فوتون ، و 3) مذبذب.
    1. ضع عينة بركة الصبغة تحت العدسة الموضوعية 3PM.
    2. اخفض العدسة الموضوعية بعناية على بركة الصبغة حتى تصبح المسافة أقل من مسافة عمل العدسة الموضوعية.
    3. ضع الماء بين العدسة وزجاج الغطاء الخاص ببركة الصبغة.
    4. اضبط طاقة خرج المجهر على كمية صغيرة (على سبيل المثال ، <1 ميجاوات مع معدل تكرار نبضة ~ 1 ميجاهرتز) لتحديد موقع سطح تجمع الصبغة.
    5. ابدأ الجلسة المباشرة للمجهر واضبط موقع z على الصفر.
    6. حرك الهدف ببطء بعيدا عن العينة للوصول إلى الجزء العلوي من تجمع الصبغة (كما هو موضح في الجيل التوافقي الثالث (THG) الذي ينتجه زجاج الغطاء).
    7. اضبط موقع z على الصفر في موضع زجاج الغطاء.
    8. اخفض الهدف قليلا حتى تظهر إشارة تألق واضحة في قناة التألق.
    9. قم بتوصيل إخراج PMT بمقسم BNC. قم بتوصيل مخرجات المقسم بعداد الفوتون ونظام الحصول على الصورة.
    10. اضبط طاقة الليزر على قيمة يكون فيها عدد الفوتونات في الثانية أقل من 5٪ من معدل تكرار الليزر (على سبيل المثال ، figure-protocol-585950000 فوتون / ثانية عند استخدام ليزر 1 ميجاهرتز).
    11. قلل مجال الرؤية إلى أدنى حد ممكن باستخدام البرنامج وتأكد من أن السطوع موحد عبر الصورة.
    12. اضبط معدل الإطارات على 1.0 إطار في الثانية.
    13. اضبط فترة اكتساب عداد الفوتون على t = عدد وحدات البكسل لكل إطار × وقت سكن البكسل ومستوى تمييز مناسب.
    14. اجمع عدد الفوتونات وعدد البكسل في وقت واحد لفترة معادلة. للحصول على عدد البكسل، اجمع متوسط قيم البكسل للصورة بأكملها، بالإضافة إلى قيم المتوسط والانحراف المعياري.
    15. كرر الخطوة 1.14.14 ، مما يمنع ليزر الإثارة للحصول على عدد الفوتونات المظلمة وعدد البكسل.
    16. إيقاف الاستحواذ المباشر على البرنامج.
    17. اطرح الأعداد المظلمة (التي تم الحصول عليها في الخطوة 1.14.15) من عدد الفوتونات (الذي تم الحصول عليه في الخطوة 1.14.14) وإجمالي عدد البكسل (الذي تم الحصول عليه في الخطوة 1.14.14).
    18. اقسم إجمالي عدد البكسل المطروح بالظلام على عدد الفوتونات المطروح بالظلام (تم الحصول عليه في الخطوة 1.14.17). استخدم القيمة التي تم الحصول عليها ك "عامل تحويل" (أي قيم البكسل / الفوتون) من قيمة بكسل إلى عدد الفوتونات.
    19. قم بتحويل المتوسط والانحراف المعياري لعدد البكسل (الذي تم الحصول عليه في الخطوة 1.14.14) إلى عدد الفوتونات، أي قسمتهما على "عامل التحويل" (تم الحصول عليه في الخطوة 1.14.18). قارن بين المتوسط والانحراف المعياري لعدد الفوتونات. تأكد من أن الانحراف المعياري يساوي تقريبا الجذر التربيعي لمتوسط عدد الفوتون إذا كان أداء نظام التصوير قريبا من حد ضوضاء اللقطة.
  15. [اختياري] تحقق من كفاءة الكشف عن إشارة المجهر.
    1. لاختبار أداء المجهر وكفاءة الكشف عن الإشارة، اتبع الخطوات 1.14.1-1.14.17 للحصول على عدد الفوتونات. بالنسبة للخطوة 1.14.15 ، قم بإنشاء عينة فارغة مصنوعة من المذيب للصبغة واحصل على عدد الفوتون للعينة الفارغة باستخدام الليزر وبنفس الطاقة التي تعمل بها مجموعة الصبغة. اطرح الأعداد الفارغة من أعداد الفوتونات من تجمع الصبغات للحصول على عدد الفوتونات الفلورية.
    2. استخدم المقاطع العرضية المعروفة 3P للفلوريسين أو تكساس الأحمر10,22 و Eq. (1) (مع NA فعال لحساب ملء الفتحة الخلفية بشكل صحيح) لحساب عدد الفوتونات المتوقع ثم مقارنة القيمة المحسوبة مع عدد الفوتونات المقاسة تجريبيا. سجل كلا من عدد الفوتونات في دفتر ملاحظات المختبر كنتائج اختبار للمجهر للمراجع المستقبلية.
      ملاحظة: تأكد من أن القيم المحسوبة والمقاسة قريبة من بعضها البعض (على سبيل المثال، ضمن عامل 2). هذه الاختبارات الكمية للنظام مفيدة بشكل خاص لضمان أداء التصوير المتسق بمرور الوقت.

2. إعداد الأسماك ل 3PM

ملاحظة: ارتد قفازات ومعطفا مختبريا لهذا الإجراء. اختر الزرد البالغ وفقا للتجربة. قم بإنهاء التحضير بالكامل (الخطوات من 2.1 إلى 2.7) في غضون 15 دقيقة تقريبا.

  1. تحضير طبق بتري مع ~ 0.5 سم من 2٪ من أجار درجة الانصهار عالية. قطع حفرة مستطيلة في أجار أطول وأوسع قليلا من الأسماك. استخدم الشمع لإرفاق أنابيب رقيقة (لتروية الماء في فم السمكة) بطبق بتري مع نهاية واحدة في المستطيل. استخدم الشمع لتوصيل أنابيب ذات قطر أكبر (لإزالة الماء) بحافة طبق بتري.
  2. اختر السمك للتجربة. تخدير الأسماك بمحلول تريكاين 0.2 ملغم / مل (الرقم الهيدروجيني 7.2) في محلول هانك حتى لا تستجيب الأسماك تماما وتخدير عميق.
  3. ضع السمك على جانبه على إسفنجة مبللة. باستخدام حقنة دقيقة ، حقن 3 ميكرولتر من بروميد الباكورونيوم (0.4 ميكروغرام / ميكرولتر في محلول هانك) لشل الأسماك. ضع السمك في محلول هانك لفترة وجيزة لضمان إصابته بالشلل التام.
  4. ضع السمك الظهري الجانبي في طبق بتري مع توجيه الرأس نحو الأنابيب. باستخدام الملقط للتلاعب بالأنابيب ، افتح فم السمكة بلطف وحرك الأنبوب في الفم. حرك السمكة برفق نحو الأنابيب بحيث تكون الأنابيب في الجزء الخلفي من فم السمكة.
  5. بسرعة ولكن بلطف تجفيف الآجار حول الأسماك وإزالة الماء فوق الأسماك. اغمس قطعة صغيرة من أنسجة المختبر في غراء المختبر وضع الأنسجة على الآجار على جانبي السمكة وفوق ظهر السمكة الذيلية إلى الخياشيم.
    ملاحظة: لا تضغط على الأسماك أو تضغط. كن حذرا لتجنب الحصول على الغراء على الخياشيم.
  6. ضع قطرة صغيرة من بوبيفاكايين مباشرة على سطح الرأس لتخدير الأسماك أثناء التصوير في المنطقة التي سيلامس فيها الليزر الجلد.
  7. أحضر طبق بتري مع السمك إلى المجهر واملأه بمياه مرافق الأسماك. قم بتوصيل الأنابيب بمضخة مياه لضخ مياه النظام عند 2 مل / دقيقة في فم السمكة وفي نفس الوقت قم بإزالة محلول التروية من الطبق بنفس المعدل. تأكد من أكسجة الماء باستخدام فقاعة وتسخينه إلى ~ 30 درجة مئوية باستخدام سخان حوض السمك.
    ملاحظة: الأسماك جاهزة الآن للتصوير. راقب صحة الأسماك عن طريق مراقبة تدفق الدم في إشارة الجيل التوافقي الثالث (THG) أثناء التصوير (انظر القسم 4.1). يجب أن يكون التصوير ثلاثي الأبعاد متوافقا أيضا مع مستحضرات الأسماك الأكثر تطورا مثل تلك المستخدمة في التصوير 2P لإصلاح الرأس والسماح بحركات الجسم أثناء التصوير أثناء الواقع الافتراضي23. هذا التصوير غير الغازي تماما يتجنب الحاجة إلى إزالة الجمجمة كما هو معتاد في دراسات أخرى للفقاريات وهو خطوة نحو تقليل الأبحاث الغازية والألم المرتبط بها.

3. إعداد الماوس ل 3PM

ملاحظة: ارتد قفازات وقناعا جراحيا ومعطفا مختبريا أثناء الإجراءات التالية. اختر خط الماوس وفقا للتجربة. يجب وضع الفأر تحت دورة الضوء والظلام لمدة 12:12 ساعة قبل الجراحة. الجراحة بأكملها (الخطوات 3.2-3.11) معقمة ، ويجب تعقيم جميع أدوات الجراحة قبل الاستخدام. يستغرق بضع القحف ~ 1 ساعة.

  1. ضع غطاء على شكل دونات (قطره 4.5-6.5 مم) وقرص غطاء (قطره 5 مم) على بارافيلم نظيف. استخدم إبرة لتطبيق كمية صغيرة من المادة اللاصقة البصرية للصق الغطاء على شكل دونات على قرص الغطاء. علاج غطاء القرص دونات على parafilm تحت الأشعة فوق البنفسجية لمدة 10-20 دقيقة. قم بإزالة غطاء القرص بالكامل من البارافيلم ، واستخدم الملقط لخدش الغراء الزائد والإيثانول بنسبة 70٪ لإزالة الحطام.
    ملاحظة: يبلغ سمك الأغطية ~ 0.17 مم. يستخدم الغطاء على شكل دونات لتطبيق الضغط المناسب على الدماغ للتصوير المزمن.
  2. تخدير الفأر مع 3 ٪ من الأيزوفلوران و 20 ٪ من خليط الغاز O2 في غرفة الحث. وزن الماوس. ضع الماوس في وضع عرضة على وسادة التدفئة. اضبط درجة حرارة وسادة التدفئة على ~ 37 درجة مئوية.
  3. إصلاح الأسنان العلوية في ثقب الفم لجهاز مجسمة مع وضع قناع مخدر. إصلاح قضبان الأذن على الأذنين. الحفاظ على التخدير مع 2 ٪ من الأيزوفلوران و 20 ٪ من خليط غاز O2 أثناء الجراحة.
    ملاحظة: اضبط تركيز الأيزوفلوران عن طريق مراقبة استجابة الماوس. تحقق من مستوى التخدير من خلال مراقبة معدل التنفس (~ 1 هرتز للنوم العميق) وقرص القدمين للتحقق من أي رد فعل قبل الجراحة.
  4. ضع مرهم العين على العينين للتزييت. أغلق الجفون. قم بتشغيل جميع أضواء الجراحة. حقن الكيتوبروفين تحت الجلد ، ديكساميثازون ، وغليكوبيرولات بناء على وزن جسم الفأر قبل الجراحة.
    ملاحظة: جرعات الدواء هي 2 ملغ / مل ، 0.1 ملغ / مل ، و 0.1 ملغ / مل للكيتوبروفين ، ديكساميثازون ، وغليكوبيرولات ، على التوالي. تعتمد أحجام حقن الكيتوبروفين والديكساميثازون والجليكوبيرولات على وزن الجسم وهي 2.5 ميكرولتر / غرام و 2 ميكرولتر / غرام و 2 ميكرولتر / غرام ، على التوالي.
  5. إزالة الشعر على تاج الرأس وبالقرب من الأذنين.
    1. قص أكبر قدر ممكن من الشعر باستخدام مقص أو ماكينة قص الشعر وإزالة الشعر المقطوع من موقع الجراحة.
    2. ضع كمية مناسبة من كريم إزالة الشعر. انتظر لمدة 1 دقيقة.
    3. قم بإزالة الشعر والكريم باستخدام قطعة قطن مبللة بمحلول ملحي.
    4. كرر الخطوتين 3.5.2 و 3.5.3 حتى تتم إزالة الشعر بالكامل.
    5. ضع 5٪ من محلول البوفيدون واليود ثم 70٪ إيثانول على الجلد لتطهير المنطقة. كرر العملية ثلاث مرات.
  6. إعطاء حقنة تحت الجلد من الأتروبين (جرعة على أساس وزن الجسم ، 0.02-0.05 ملغ / كغ) على الرأس. انتظر لمدة 1 دقيقة.
  7. قطع الجلد على تاج الرأس لفضح الجمجمة. تأكد من أن نقطة bregma ونقطة lambda مكشوفة. قم بلصق أنسجة الجلد المتبقية على حافة الجمجمة باستخدام غراء متوافق حيويا لتجنب حفر الغبار من الدخول تحت الجلد (مما قد يثير استجابة مناعية).
  8. استخدم علامة جراحية لرسم دائرة قطرها 5 مم فوق المنطقة محل الاهتمام. على سبيل المثال ، اختر مركز المنطقة ~ 2.5 مم جانبي و 2 مم ذيلي إلى البريجما ، والتي تغطي معظم القشرة الحسية الجسدية والقشرة البصرية.
  9. حفر على طول الدائرة ببطء وتطبيق المالحة لترطيب الجمجمة عند الانتهاء من منتصف الطريق. إبطاء سرعة الحفر للنصف الأخير وتغطية الجمجمة بمحلول ملحي قبل إزالة الجمجمة. افتح الجمجمة بلطف باستخدام الملقط وتطبيق قطعة صغيرة من رغوة الجل المعقمة المنقوعة في محلول ملحي لوقف أي نزيف في الدماغ على الفور. حافظ على رطوبة الدماغ باستخدام المياه المالحة.
  10. ضع قطرة من المحلول الملحي على جانب غطاء القرص دونات المحضر المواجه لأنسجة المخ. ضع جزء القرص البارز من غطاء القرص دونات في نافذة الجمجمة. استخدم قضيبا طويلا يحمله الجهاز المجسمة للضغط برفق على جزء القرص من نافذة الجمجمة المغطاة على سطح الدماغ ، مما يضمن أن جزء الدونات يغطي الجمجمة بإحكام. جفف المنطقة المحيطة بغطاء القرص دونات بقطعة قطن.
  11. ضع طبقة من الغراء المتوافق حيويا تحت الحافة على شكل دونات. ضع طبقة من مزيج أسمنت الأسنان تحت وحول جزء الدونات من غطاء القرص-دونات. ضع طبقة أخرى من الغراء فوق أسمنت الأسنان. يمكن حقن 5٪ من الجلوكوز (الجرعة بناء على وزن الجسم ، 10 ميكرولتر / جم) تحت الجلد كل ساعة أثناء الجراحة لتوفير الطاقة الحيوانية.
  12. أغلق نظام التخدير. حرر الماوس من الجهاز التجسيمي. انقل الماوس إلى جهاز تجسيمي مدمج مخصص على الفور ، مع وسادة تدفئة عند ~ 37 درجة مئوية وجهاز تخدير.
  13. ضع الماوس في وضع عرضة على وسادة التدفئة الخاصة بجهاز التنظير المجسمة المدمج المخصص. اضبط درجة الحرارة على ~ 37 درجة مئوية. ثبت الأسنان العلوية في فتحة الفم للجهاز التجسيمي وقضبان الأذن على آذان الماوس. ضع أنابيب التخدير ، وحافظ على التخدير بنسبة 1.5٪ من الأيزوفلوران و 20٪ من خليط غاز O2.
    ملاحظة: الماوس جاهز الآن للتصوير. حافظ على تخدير الماوس أثناء إجراءات التصوير التالية. اضبط تركيز الأيزوفلوران عن طريق مراقبة استجابة الماوس.

4. التصوير داخل الجسم في أدمغة الأسماك والفئران

  1. التصوير داخل الجسم في دماغ الزرد
    ملاحظة: لتحديد موقع دماغ السمكة بشكل صحيح تحت العدسة الموضوعية، يتم استخدام كاميرا جهاز ثانوي مقترن بالشحن (CCD) على نفس مسار ضوء الإثارة للتصوير واسع المجال.
    1. قم بإعداد المجهر ومعايرة الطاقة (كما هو موضح في القسم 1).
    2. ضع هدفا منخفض التكبير (عادة 4x) على المجهر.
    3. ضع طبق بتري الذي يحتوي على الأسماك والأنابيب تحت المجهر.
    4. استخدم مصدر ضوء الصمام الثنائي الباعث للضوء (LED) لإضاءة طبق بتري.
    5. افتح وضع الكاميرا الخاص ببرنامج الحصول على الصور (الشكل 2).
    6. انقر على بث مباشر.
    7. اختر القناة A على الجانب الأيسر من الشاشة.
    8. اضبط إعدادات الرسم البياني لرؤية الصورة بوضوح.
      ملاحظة: يجب تحديثها حسب الحاجة.
    9. اضبط إعداد المحرك على وحدة التحكم في المحرك على Base.
    10. خفض الهدف حتى تصبح الأسماك مرئية.
      ملاحظة: تأكد من أن العدسة الموضوعية لا تقوم بأي اتصال جسدي مع الرأس.
    11. ضع مركز رأس السمكة في وسط مجال الرؤية.
    12. حرك الهدف لأعلى وبعيدا عن رأس السمكة.
    13. استبدل العدسة المستهدفة منخفضة التكبير بالعدسة عالية الهدف NA لمدة 3 مساء.
      ملاحظة: لا يلزم أن تكون عدسة التكبير المنخفض والعدسة عالية NA الموضوعية متشابهة البؤرة ولكن يجب أن تكون قريبة بما يكفي لضمان أن الأسماك تقع ضمن مجال رؤية عدسة NA الموضوعية العالية.
    14. اخفض العدسة الموضوعية ببطء ، مع التأكد من أن الهدف لا يقوم بأي اتصال جسدي مع الرأس. في برنامج كاميرا CCD ، توقف عن تحريك الهدف عندما يكون الجزء العلوي من الرأس مرئيا. اضبط موقع z على 0 ميكرومتر.
      ملاحظة: تأكد من عدم وجود فقاعات هواء تحت العدسة الموضوعية عند استخدام هدف الغمر بالماء.
    15. أطفئ مصدر ضوء LED وأغلق الستارة الداكنة حول النظام.
    16. اضبط برنامج اقتناء التصوير على وضع GG متعدد الفوتونات للتصوير 3P واضبط الطاقة تحت العدسة الموضوعية على أقل من 1 ميجاوات (مع معدل تكرار نبضة ~ 1 ميجاهرتز).
    17. قم بتغيير زر إعداد المحرك من القاعدة إلى الهدف على وحدة التحكم في المحرك.
    18. أطفئ الأنوار في الغرفة.
    19. قم بتشغيل PMTs وافتح مصراع مصدر الإثارة 3PM. تأكد من ظهور مخطط للعظم في قناة إشارة التألق بسبب التألق الذاتي وفي قناة إشارة THG بسبب THG للعظم (الشكل 2C).
    20. قم بإجراء التصوير على أعماق مختلفة عن طريق زيادة مستويات الطاقة عند التصوير بشكل أعمق.
  2. التصوير داخل الجسم في دماغ الفأر
    ملاحظة: حقن الجلوكوز 5٪ في الماوس المخدر كل ساعة أثناء التصوير. تعتمد الجرعة على وزن الجسم (10 ميكرولتر / جم).
    1. اضبط برنامج اقتناء التصوير على وضع GG متعدد الفوتونات للتصوير 3P واضبط الطاقة تحت العدسة الموضوعية على أقل من 1 ميجاوات (مع معدل تكرار نبضة ~ 1 ميجاهرتز).
      ملاحظة: تأكد من وضع نافذة الجراحة عموديا على العدسة الموضوعية لتقليل الانحراف. يتم إجراء الضبط الدقيق عن طريق إمالة الجهاز المجسم.
    2. حرك العدسة الموضوعية بالقرب من النافذة وتطبيق الماء بين الهدف ونافذة الجمجمة ؛ تعيين قيم المحور لجميع المحركات إلى الصفر.
      ملاحظة: امتصاص الضوء في H 2 O عند ~ 1700 نانومتر كبير ، مما يقلل بشكل كبير من طاقة الليزر ~ 1700 نانومتر بعد عمق ~1-2مم من الماء. بالنسبة للإثارة ~ 1,700 نانومتر ، استخدم D2O ، الذي يحتوي على امتصاص أصغر بكثير عند 1700 نانومتر ، للغمر بالماء لتقليل امتصاص الماء.
    3. انقر على الزر Live في برنامج الحصول على الصور وافتح قنوات PMT ، على سبيل المثال ، قناة إشارة فلورية واحدة وقناة إشارة THG واحدة. اضبط كسب PMT ومستوى الخلفية حسب الحاجة.
    4. حرك ببطء العدسة الموضوعية لتحديد موقع سطح النافذة عن طريق مراقبة قناة THG من الأوعية الدموية الكبيرة وسطح زجاج النافذة. اضبط اتجاه النافذة (انظر الملاحظة في الخطوة 4.2.12) إذا لزم الأمر. صفر المحركات لتحديد سطح الدماغ.
    5. قم بإجراء التصوير وضبط مستوى الطاقة وفقا لعمق التصوير.

النتائج

سيؤدي الانتهاء بنجاح من هذا البروتوكول إلى مجهر محاذاة بشكل صحيح مع معلمات الضوء المثلى (على سبيل المثال ، مدة النبض ، NA) والاستعدادات الحيوانية المناسبة في الجسم الحي 3PM. يتضمن إعداد 3P المتاح تجاريا مرايا وعدسات مناسبة لكل من ~ 1,300 نانومتر و ~ 1,700 نانومتر. لذلك ، لا يلزم إجراء أي تغيير في البصريات عند تبديل الطول الموجي للإثارة بين 1300 نانومتر و 1700 نانومتر. إذا لم يكن للعدسات في إعداد 3P طلاء مناسب ل 1,300 و 1,700 نانومتر ، فيجب استبدالها بأخرى مناسبة لتقليل فقد طاقة الليزر. مع 3PM الأمثل والإعداد المناسب للحيوانات ، يمكن جمع صور التألق و THG في الجسم الحي ذات التباين العالي في أعماق الأدمغة.

يوضح الشكل 3 صورا تمثيلية ثلاثية الأبعاد لأسماك الزرد البالغة السليمة. يتم تحقيق تصوير عالي الدقة وغير جراحي وعميق للخلايا العصبية المصنفة وراثيا في دماغ الزرد البالغ باستخدام الساعة 3 مساء. على الرغم من أنه تم الإبلاغ عن التصوير في منطقة telencephalon في دماغ الزرد البالغ باستخدام 2PM 24,25,26,27 ، إلا أن 3PM يتيح الوصول إلى telencephalon بأكمله والمناطق الأكثر تحديا أو المستحيل ملاحظتها باستخدام تقنيات أخرى. يمكن ملاحظة توزيع طبقات الخلايا في التكتوم البصري والمخيخ في الشكل 3C. في جلسة تصوير ناجحة، يكون العظم مرئيا في قناة THG والخلايا العصبية مرئية في قناة التألق. بالنسبة لتصوير أسماك الزرد البالغة ، تم استخدام ميزة الكاميرا في المجهر لتحديد موقع الأسماك (الشكل 3A). هذه الخطوة ليست ضرورية لتصوير دماغ الفأر لأن النافذة الزجاجية كبيرة بما يكفي لجعل الدماغ سهل الوصول. تم الحصول على صور هيكلية عالية الدقة لدماغ الزرد البالغ باستخدام النظام الموصوف في الأقسام السابقة. تظهر الجمجمة في قناة THG (الشكل 3B) ، مما يساعد على التنقل في الدماغ والعثور على السطح العلوي. كما لوحظ في الشكل 3C ، يمكن تمييز الخلايا العصبية بنسبة إشارة إلى خلفية عالية (SBR) في عمق دماغ البالغين. الأنسجة فوق الدماغ مرئية في قناة التألق بسبب التألق الذاتي.

يوضح الشكل 4 صورا متعددة الألوان ل 3P للخلايا العصبية المصنفة GCaMP6s (باللون الأخضر) والأوعية الدموية ذات العلامات الحمراء في تكساس (الحمراء) جنبا إلى جنب مع إشارات THG (الأزرق) في دماغ الفأر البالغ مع إثارة 1,340 نانومتر10. الصور مستنسخة من العمل السابق10. في الشكل 4 ، تم الحفاظ على طاقة النبض في التركيز عند ~ 1.5 نانوجول في العمق بأكمله للحصول على إشارات التألق و THG الكافية ، وكان الحد الأقصى لمتوسط طاقة الليزر ~ 70 mW. تم تعديل مدة النبض إلى ~ 60 fs ، وكان NA الفعال ~ 0.8. مع تحسين إعداد 3PM ، تم الحصول على صور عالية التباين بنجاح حتى 1.2 مم من سطح الدماغ ، في منطقة الحصين CA1 (الشكل 4A ، B). يوضح الشكل 4C ، D آثار نشاط Ca2 + للخلايا العصبية الموسومة GCaMP6s على عمق 750 ميكرومتر لجلسة تسجيل مدتها 10 دقائق ، مما يدل على دقة تسجيل عالية.

إذا كان ليزر الإثارة غير محاذاة ، فقد يلاحظ عدم الانتظام في سطوع الإشارة عبر مجال الرؤية. بالإضافة إلى ذلك ، إذا لم يتم تحسين معلمات الليزر ، مثل مدة النبض ، وطاقة نبض الإثارة عند التركيز ، و NA الفعال ، فلن تكون صورة THG من جمجمة السمك أو نافذة بضع القحف في دماغ الفأر مرئية و / أو تتطلب طاقة نبض إثارة عالية (على سبيل المثال ، >2 nJ / نبضة عند التركيز). وبالتالي ، يمكن استخدام إشارات THG على سطح الدماغ كمؤشر لإعداد 3PM الأمثل قبل البدء في تصوير الأنسجة العميقة.

figure-results-3648
الشكل 1: رسم تخطيطي لإعداد الساعة 3مساء. يتم تعيين الطول الموجي لليزر الإثارة عند ~ 1,300 نانومتر أو ~ 1,700 نانومتر ، وهو ناتج من منفذ الخمول في NOPA. يتم استخدام ضاغط زوج المنشور وضاغط لوحة Si لليزر ~ 1,300 نانومتر و ~ 1,700 نانومتر ، على التوالي ، لتحفيز نبضة ليزر الإثارة. يمكن تبديل حزم الليزر ~ 1,300 نانومتر و ~ 1,700 نانومتر مع مرايا الزعانف. يتم استخدام منفذ إشارة NOPA للحصول على إشارة التشغيل. يتم استخدام نصف لوحة موجية و PBS للتحكم في قوة الإثارة. يتم الكشف عن التألق و THG بواسطة GaAsP PMTs. يتم استخدام مجموعات مناسبة من المرايا ثنائية اللون ومرشحات تمرير النطاق الترددي لفصل إشارات التألق و THG. الاختصارات: 3PM = المجهر ثلاثي الفوتونات. NOPA = مكبر صوت بارامتري بصري غير خطي ؛ PBS = مقسم شعاع الاستقطاب ؛ THG = الجيل التوافقي الثالث ؛ DAQ = الحصول على البيانات; PMT = أنبوب المضاعف الضوئي. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-4823
الشكل 2: لقطات شاشة تمثيلية للتصوير داخل الجسم في الأسماك (قسم البروتوكول 4.1). (أ) عرض وضع الكاميرا لبرنامج الحصول على الصورة مع عدسة موضوعية 4x في مكانها. يتم تحديد الميزات الرئيسية للبرنامج وترقيمها على النحو التالي: 1. وضع التصوير لبرنامج الحصول على الصور. خيارات الوضع هي الكاميرا والفوتون المتعدد والفوتون المتعدد GG. بالنسبة للتصوير بالضوء الأبيض باستخدام كاميرا CCD، يتم اختيار وضع الكاميرا . 2. يؤدي النقر فوق الزر Live إلى تشغيل الكاميرا (أو PMTs إذا كان ذلك في خيارات الفوتون المتعدد) ، ويمكن ملاحظة عرض المجهر في الوقت الفعلي. 3. في علامة التبويب إعداد الالتقاط ، يتم تعيين معلمات التصوير المطلوبة (الطاقة والموقع والعمق). 4. في علامة التبويب التقاط ، يتم تعيين موقع مجلد للصور المراد حفظها. يمكن بدء التصوير في علامة التبويب هذه. 5. يتحكم إعداد Z Control في عمق التصوير عن طريق تحريك محرك المرحلة z. 6. صورة تمثيلية لرأس الزرد. الجانب السطحي من الرأس على اليسار. (ب) عرض تمثيلي لوضع الكاميرا مع عدسة موضوعية 25x. (ج) عرض تمثيلي لوضع GG متعدد الفوتونات يحتوي على صورة THG للصورة التي تظهر في (B). الاختصارات: CCD = جهاز مقترن بالشحنة. PMT = أنبوب المضاعف الضوئي ؛ THG = الجيل التوافقي الثالث. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-6533
الشكل 3: صور تمثيلية لدماغ الزرد البالغ الذي تم الحصول عليه باستخدام برنامج الحصول على الصور. (أ) صورة وضع الكاميرا لرأس الزرد البالغ التي تم الحصول عليها باستخدام عدسة موضوعية 4x. الجزء العلوي من الصورة هو اتجاه السطح. يتم تحديد فصوص OT و CB. (ب) صورة تمثيلية تم الحصول عليها في وضع GG متعدد الفوتونات مع عدسة موضوعية 25x تحتوي على صورة THG ل (A). (ج) صور التألق لدماغ الزرد البالغ عند تقاطع المخيخ والتكتوم البصري حيث يتم التعبير عن GFP في سيتوبلازم الخلايا العصبية في أعماق مختلفة. أشرطة المقياس = 100 ميكرومتر. الاختصارات: OT = التكتام البصري; CB = المخيخ; THG = الجيل التوافقي الثالث ؛ GFP = بروتين الفلورسنت الأخضر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-7573
الشكل 4: متعدد الألوان 3 مساء من الخلايا العصبية المصنفة GCaMP6s (أخضر) ، وأوعية دموية تحمل علامة حمراء في تكساس (حمراء) ، والجيل التوافقي الثالث (أزرق) عند إثارة 1,340 نانومتر في دماغ الماوس. (A) صور Z-stack تصل إلى 1,200 ميكرومتر من سطح الدماغ مع مجال رؤية 270 × 270 ميكرومتر (512 × 512 بكسل لكل إطار). تنوعت طاقة الليزر وفقا لعمق التصوير للحفاظ على طاقة نبض ~ 1.5 نانو جول في التركيز. وكان الحد الأقصى لمتوسط القدرة تحت الهدف 70 ميغاواط. (ب) صور مختارة 2D على أعماق تصوير مختلفة. (ج) موقع تسجيل النشاط عند 750 ميكرومتر تحت الجرة مع مجال رؤية 270 × 270 ميكرومتر (256 × 256 بكسل). (د) آثار نشاط الدماغ التلقائي المسجلة في فأر مستيقظ من الخلايا العصبية الموصوفة المشار إليها في (C). كان معدل الإطارات 8.3 هرتز ، مع وقت سكن بكسل قدره 0.51 ميكروثانية. كان معدل تكرار الليزر 2 ميجاهرتز ، وكان متوسط الطاقة تحت العدسة الموضوعية 56 ميجاوات. تم تطبيع كل أثر إلى خط الأساس الخاص به وتمت تصفيته باستخدام نافذة هامينغ ثابتة زمنيا تبلغ 0.72 ثانية. أشرطة المقياس = 50 ميكرومتر. يتم استنساخ هذا الرقم وأسطورة الشكل من 10. اختصار: 3PM = المجهر ثلاثي الفوتونات. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-9167
الشكل 5: طول التوهين الفعال في القشرة المخية الحديثة لدماغ الفأر. يتم حساب EAL (الخط الأرجواني) من تشتت الأنسجة (الخط الأحمر) وامتصاص الماء في الأنسجة (الخط الأزرق) ، بافتراض تكوين الماء بنسبة 75٪. تشير النجوم السوداء إلى البيانات التجريبية المبلغ عنها ل EAL في القشرة المخية الحديثة لدماغ الفأر3،21،28،29. لاحظ أن EAL يختلف في الأنسجة المختلفة. اختصار: EAL = طول التوهين الفعال. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الطول الموجي للإثارة
(نانومتر)		مياه الغمرأقصى طاقة ليزر
(ميغاواط)		طاقة نبض قصوى عند التركيز البؤري*
(نيوجيرسي)		EAL نموذجي في قشرة الفأر
(ميكرومتر)		عمق التصوير في قشرة الفأر**
(مم)		طاقة النبض تحت الهدف***
(نيوجيرسي)		الحد الأقصى لمعدل تكرار الليزر****
(ميغاهرتز)
1300H2O أو D2O figure-results-10681100 figure-results-107782~ 3000.8~ 14~ 7
1.2~ 55~ 2
1.6~ 210~ 0.5
2.1~ 1100~ 0.1
1700د2س figure-results-1121450 figure-results-113103~ 4000.8~ 7~ 7
1.2~ 20~ 2.5
1.6~ 55~ 1
2.1~ 190~ 0.3

الجدول 1: ظروف الإثارة النموذجية 3P لتصوير قشرة الفأر.
* مع هدف NA مرتفع (~ 1.0) ، وعرض النبض ~ 50 fs ، والفلوروفورات النموذجية مثل البروتينات الفلورية (على سبيل المثال ، GFP و RFP).
** مع افتراض أن EAL موحد في القشرة بأكملها.
لتحقيق ~ 1 نانوجول / نبض في التركيز البؤري ، محسوبة من EAL وعمق التصوير.
محسوبة من طاقة النبض تحت الهدف والحد الأقصى لطاقة الليزر المتساهلة.
الاختصارات: 3P = ثلاثة فوتون. NA = فتحة عددية; GFP = بروتين الفلورسنت الأخضر; RFP = بروتين الفلورسنت الأحمر; EAL = طول التوهين الفعال.

Discussion

يشرح هذا البروتوكول الإجراءات خطوة بخطوة لإعداد التصوير 3P باستخدام المجهر التجاري ومصدر الليزر. بالمقارنة مع 2PM ، تتمتع 3PM بميزة في التطبيقات التي تتطلب الوصول البصري في المناطق العميقة مثل الحصين في دماغ الماوس. على الرغم من أن 3PM يستخدم في الغالب في علم الأعصاب ، إلا أنه يمكن تطبيق 3PM في أنسجة أخرى مثل الغدد الليمفاوية والعظام والأورام لمراقبة الأنسجة العميقة.

من المهم التحقق من أن نظام التصوير يعمل بالقرب من حد ضوضاء اللقطة ، مما يضمن أن إلكترونيات الكشف والحصول على البيانات تساهم بضوضاء ضئيلة في الصورة بعد PMTs. إن عدم اليقين في عدد الفوتونات المكتشفة محدود بشكل أساسي بسبب ضوضاء الفوتون الملتقطة. يمكن تحقيق أداء محدود لضوضاء اللقطة في مجهر نموذجي متعدد الفوتونات باستخدام كاشف ضوئي عالي الكسب (على سبيل المثال ، PMT). تتبع ضوضاء لقطة الفوتون توزيعا إحصائيا لبواسون ، حيث يكون الانحراف المعياري للتوزيع مساويا للجذر التربيعي لمتوسط التوزيع. للتحقق من الأداء المحدود لضوضاء اللقطة، اتبع الخطوة 1.14 في قسم البروتوكول.

لتجنب توهين الضوء بواسطة H 2 O ،يعد استخدام D2O للغمر مفيدا ، خاصة بالنسبة للإثارة ~ 1,700 نانومتر. عند استخدام D 2 O ، من الضروري تحديث D 2 O كل 10 دقائق تقريبا أو استخدام حجم كبير من D 2 O لتجنب تبادل D 2 O / H2Oأثناء التصوير. يمكن للمرء أيضا إغلاق D2O من بيئة الغرفة3. إذا تم استخدام عدسة موضوعية لمسافة العمل الطويلة (WD) (على سبيل المثال، WD عند 4 مم أو أكثر) للتصوير، فقد يتجاوز سمك سائل الغمر 2-3 مم. زيادة سمك يجعل امتصاص H2O لا يستهان به حتى عند ~ 1300 نانومتر21. لذلك ، قد يكون D2O ضروريا حتى بالنسبة ل 1300 نانومتر 3 مساء عند استخدام عدسة WD موضوعية طويلة.

نظرا لأن شدة التألق 3P تعتمد على مكعب طاقة نبض الإثارة عند التركيز (Eq. (1)) ، فإن ضبط طاقة الليزر المناسبة مهم بشكل خاص للحصول على إشارات فلورية 3P كافية مع تجنب التلف الحراري وغير الخطي في الأنسجة الحية. يجب أن يبقى متوسط طاقة الليزر أقل من عتبة الضرر الحراري. في دماغ الفأر ، على سبيل المثال ، لتجنب تلف الأنسجة الحرارية ، يجب الاحتفاظ بمتوسط الطاقة على سطح دماغ الفأر عند أو أقل من ~ 100 mW لإثارة ~ 1,300 nm على عمق 1 mm ومع مجال رؤية (FOV) من 230 ميكرومتر × 230 ميكرومتر21. وبالمثل ، يجب الاحتفاظ بمتوسط الطاقة عند ~ 1700 نانومتر عند أو أقل من ~ 50 ميجاوات على عمق ~ 1 مم و FOV ~ 230 ميكرومتر × 230 ميكرومتر (بيانات غير منشورة). علاوة على ذلك ، لتجنب تشبع الإثارة والضرر غير الخطي المحتمل ، يجب الاحتفاظ بطاقة نبض الإثارة عند figure-discussion-25412 نانوجول و 3 نانوجول ل ~ 1300 نانومتر و ~ 1700 نانومتر figure-discussion-2665إثارة ، على التوالي30.

بسبب امتصاص الضوء والتشتت في الأنسجة ، يتم تخفيف طاقة النبض في التركيز إلى 1 / e (~ 37 ٪) بعد اختراق الأنسجة بواسطة 1 EAL. يختلف EAL في الأنسجة المختلفة ومع الأطوال الموجية للإثارة ، على سبيل المثال ، في القشرة المخية الجديدة لدماغ الفأر ، يكون EAL ~ 300 ميكرومتر و ~ 400 ميكرومتر عند ~ 1,300 نانومتر و ~ 1,700 نانومتر ، على التوالي 3,29 (الشكل 5). لذلك ، للحفاظ على نفس طاقة النبض في التركيز (على سبيل المثال ، 1 nJ / pulse) على عمق n EALs ، يجب ضرب طاقة النبض السطحي في 1 nJ × en. للتصوير السريع للديناميكيات الهيكلية والوظيفية ، من المستحسن استخدام ليزر الإثارة بمعدل تكرار مرتفع (عند 1 ميجاهرتز أو أعلى) لتحقيق معدل إطارات مرتفع5،6،7،10. ومع ذلك ، فإن متطلبات طاقة النبض ومتوسط حد طاقة الليزر يقيدان معدل التكرار المعمول به.

على سبيل المثال ، عندما نصور منطقة عميقة بشكل معتدل عند 4 EALs (أي ~ 1.2 مم في قشرة الماوس مع إثارة 1300 نانومتر) ، يلزم ~ 55 نانوجول / نبضة على السطح للحفاظ على 1 نانوجول / نبضة في التركيز. عندما يكون متوسط الحد من الطاقة 100 ميجاوات ، يمكننا تطبيق معدل تكرار ليزر ~ 2 ميجاهرتز. ومع ذلك ، للحصول على صورة أعمق على عمق 7 EALs ، يلزم وجود 1100 nJ / نبضة على السطح للحفاظ على 1 nJ / pulse عند التركيز. بافتراض أن الحد الأقصى لمتوسط الطاقة هو 100 ميجاوات لتجنب التلف الحراري ، يجب تقليل معدل تكرار الليزر إلى 0.1 ميجاهرتز لتحقيق نبضة 1,100 nJ / على السطح. يلخص الجدول 1 ظروف التصوير النموذجية في قشرة دماغ الفأر. لاحظ أن أعماق التصوير في الجدول 1 تفترض أن EAL موحد في قشرة الفأر بأكملها.

علاوة على ذلك ، بسبب الحد من طاقة الليزر في الأنسجة العميقة 3PM ، توجد مفاضلة بين معدل الإطارات وحجم بكسل الصورة ، وهو أمر مهم بشكل خاص للتصوير الوظيفي مثل تصوير الكالسيوم. يتم تحديد الحد الأقصى لمعدل تكرار الليزر المتاح في كل عمق بناء على طاقة النبض المطلوبة عند التركيز ومتوسط طاقة الليزر المعمول بها كما نوقش أعلاه ، على سبيل المثال ، 2 ميجاهرتز على عمق يعادل ~ 4 EALs مع إثارة 1300 نانومتر. بشكل عام ، يتطلب التصوير نبضة واحدة على الأقل لكل بكسل. وبناء على ذلك، يتم تحديد الحد الأدنى من وقت بقاء البكسل المتاح من خلال معدل تكرار الليزر، على سبيل المثال، 0.5 ميكروثانية/بكسل مع إثارة 2 ميغاهرتز.

للحفاظ على الدقة المكانية العالية (~ 1 ميكرومتر في الجانبية) في صور 3P ، من المثالي تعيين 1 بكسل على مساحة ~ 1 ميكرومتر 2 ، على سبيل المثال ، 256 × 256 بكسل ل FOV من 250 × 250 ميكرومتر2. وبالتالي ، لإجراء تصوير سريع باستخدام FOV كبير إلى حد كبير (على سبيل المثال ، 250 × 250 ميكرومتر 2 مع 256 × 256 بكسل) ، فإن معدلات تكرار النبض 0.5 ميجاهرتز و 1 ميجاهرتز و2 ميجاهرتز تعطي معدلات الإطارات القصوى النظرية ~ 7.6 و ~ 15 و ~ 30 إطارا / ثانية ، على التوالي. وبالمثل ، فإن تحسين معدل تكرار الليزر أمر ضروري ، اعتمادا على العمق المستهدف ، وسرعة المسح الضوئي ، و FOV ، لتطبيق طاقة نبض كافية تحت عتبة الضرر الحراري. لزيادة سرعة التصوير ، يمكن استخدام مصدر الإثارة التكيفي لتركيز جميع نبضات الإثارة على الخلايا العصبية (أي المناطق ذات الاهتمام) عن طريق توصيل نبضات الليزر عند الطلب إلى الخلايا العصبية31.

يعد 3PM مفيدا عند مقارنته ب 2PM في التصوير العميق داخل الأنسجة الحية ومن خلال وسائط مبعثرة للغاية مثل الجمجمة والعظام وطبقة المادة البيضاء (أي الكبسولة الخارجية) لدماغ الفأر. كلما طالت EAL والإثارة غير الخطية ذات الترتيب الأعلى ل 3PE تفيد تصوير الأنسجة العميقة. على سبيل المثال ، لتصوير GCaMP6 في قشرة الماوس ، تكون إشارة التألق 2P مع إثارة 920 نانومتر أعلى من إشارة التألق 3P مع إثارة 1300 نانومتر في المناطق الضحلة عند 690 ميكرومتر (أي ~ 2.3 EALs عند figure-discussion-65631300 نانومتر)21. ومع ذلك ، نظرا لطول EAL عند 1300 نانومتر مقارنة ب 920 نانومتر ، فإن 3PE يعطي تألقا أقوى من إثارة 2P (2PE) على عمق ~ 690 ميكرومتر وأعمق21. يتم تعريف هذا العمق على أنه "عمق تقاطع الإشارة" ، حيث تكون قوة إشارة التألق 2PE و 3PE متطابقة مع نفس معدل التكرار ونفس الحد الأقصى المسموح به متوسط القوى21. يعتمد عمق تقاطع الإشارة على الأطوال الموجية للإثارة ل 2PE و 3PE والفلوروفور.

في الممارسة العملية ، تسمح الإثارة 920 نانومتر بمتوسط طاقة ليزر أعلى من إثارة 1300 نانومتر بسبب امتصاص الماء الأقل. ومع ذلك ، فإن متوسط الطاقة الأعلى ل 2PE سيدفع عمق تقاطع الإشارة فقط بمقدار 0.9 EALs4. بالإضافة إلى ذلك ، عندما يتم تصنيف العينة بكثافة ، فإن 3PE لديه ميزة إضافية تتمثل في SBR أعلى بكثير. لذلك ، حتى قبل الوصول إلى طول تقاطع الإشارة ، يمكن أن يكون 3PM أفضل للتصوير من 2PM. على سبيل المثال ، عند تصوير الأوعية الدموية لدماغ الماوس ، والتي تحتوي على جزء حجمي (أي كثافة وضع العلامات) تبلغ ~ 2٪ ، فإن 1,300 نانومتر 3PM مع قوة إثارة 100 ميجاوات تتفوق على 920 نانومتر 2 مساء مع قوة إثارة 200 ميجاوات على عمق ~ 700 ميكرومتر للفلوريسين.

تتمتع 3PM أيضا بميزة عند التصوير من خلال طبقة رقيقة ولكنها مبعثرة للغاية قد تشوه وظيفة انتشار النقاط لشعاع الإثارة وتولد خلفية إلغاء التركيزالبؤري 4. على سبيل المثال ، من خلال الجمجمة السليمة لدماغ الفأر ، تعاني صور 2PM من خلفية إلغاء التركيز البؤري حتى على عمق ضحل يبلغ <100 ميكرومتر من سطح الدماغ13. لوحظت خلفية مماثلة لإلغاء التركيز البؤري في الساعة 2 مساء مع إثارة 1,280 نانومتر من خلال المادة البيضاء في دماغ الفأر32. لذلك ، عندما يتم تصوير الأنسجة من خلال طبقات عكرة ، يفضل 3PM على 2PM للتصوير عالي التباين بغض النظر عن كثافة وضع العلامات.

لقد أبلغنا مؤخرا عن تحليل وهمي ونظري للخرز يوضح أن حد عمق التصوير في الساعة 3 مساء يزيد عن 8 EALs33 ؛ 8 EALs تعادل ~ 3 مم مع إثارة ~ 1700 نانومتر في قشرة الماوس. ومع ذلك ، فإن الليزر المتاح حاليا لا يحتوي على طاقة نبضية كافية لتحقيق 8 EALs في دماغ الماوس. مزيد من التطوير لليزر أقوى سيدفع الحد الأقصى لعمق التصوير الحالي البالغ 3 مساء.

Disclosures

ويعلن صاحبا البلاغ عدم وجود مصالح متنافسة.

Acknowledgements

تم دعم هذا العمل من قبل NSF DBI-1707312 Cornell NeuroNex Hub و NIH 1U01NS103516.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
5% Povidone-iodineAmazonNDC 67818-155-32Aceptical cleaning of surgical areas
70% EthanolThermo Fisher ScientificCAS 64-17-5Aceptical cleaning of surgical areas
AgaroseSigmaA4718-256Preparing zebrafish chamber
AtropineCornell Veterinary Care
Bergamo IIThorlabsMultiphoton Imaging Microscope
BupivacaineCornell Veterinary Care
DexamethasoneCornell Veterinary Care
Donut shape glass (ID4.5, OD6.5)Potomac PhotonicsCover glass used for craniotomy
eye ointment (or topical ophthalmic ointment)Puralube Vet OintmentNDC 17033-211-38Used as a lubricant to prevent irritation or to relieve dryness of the eye during surgery and anesthesia
GaAsP Amplified PMTThorlabsPMT2100PMT detector
GlucoseCornell Veterinary Care
GlycopyrrolateCornell Veterinary Care
Heater (800 W)FinnexAquarium heater for zebrafish water)
Isoflurane USP 250 mLPiramalNDC 66794-0013-25For anesthesia of mice
KetoprofenCornell Veterinary Care
KimwipesKimtechLaboratory tissue for preparing zebrafish
Nanofil syringe (10 micrometer) with 36 G needleWPINANOFIL + NF36BVSyringe and needle for injection of pancuronium bromide
Optical AdhesiveNorlandNOA 68To stick round coverslip and donut shape glass together.
Pancuronium BromideCornell Veterinary Care
Peristaltic PumpElemental ScienceESI MP2Water pump for zebrafish setup
Polyethylene tubing (I.D. 0.58 mm., O.D. 0.965 mm.)Elemental ScienceMP2 pump tubingTubing that goes in the mouth of the zebrafish
Round Cover Slip German Glass #1.5, 5 mmElectron Microscopy Sciences7229605Cover glass used for craniotomy
Spirit-NOPASpectra PhysicsTunable Optical Parametric Amplifier
SR400Stanford Research SystemsSR400Photon counter
Standard Photodiode Power SensorThorlabsS122CPower detector
Sterilized phosphate buffered saline (PBS)Millipore SigmaSKU 806552-500mlUsed during mouse brain surgery
Surgical drapeDynarex disposable towel drape4410For aceptical mouse surgery
Thin strip boxing waxCorning Rubber Co., Inc.Holding tubing in place in zebrafish chamber
ThorImageThorlabsImage acquisition software
Tricaine (Ethyl-m-aminobenzoate methanesulfonate salt)MP103106Zebrafish anesthesia and euthanasia
Tygon tubing (I.D. 1/16 in., O.D. 1/8 in.)TygonTubing for water flow for zebrafish preparation
VaporGuardVetEquip931401For recycling isoflurane
Vetbond tissue adhesive3M1469SBTo glue the glass window on the mouse skull, and to glue the laboratory tissue when preparing the fish.
XLPLN25XWMP2OlympusMultiphoton Excitation Dedicated Objective

References

  1. Denk, W., Strickler, J. H., Webb, W. W. Two-photon laser scanning fluorescence microscopy. Science. 248 (4951), 73-76 (1990).
  2. Helmchen, F., Denk, W. Deep tissue two-photon microscopy. Nature Methods. 2 (12), 932-940 (2005).
  3. Horton, N. G., et al. In vivo three-photon microscopy of subcortical structures within an intact mouse brain. Nature Photonics. 7 (3), 205-209 (2013).
  4. Wang, T., Xu, C. Three-photon neuronal imaging in deep mouse brain. Optica. 7 (8), 947-960 (2020).
  5. Ouzounov, D. G., et al. In vivo three-photon imaging of activity of GCaMP6-labeled neurons deep in intact mouse brain. Nature Methods. 14 (4), 388-390 (2017).
  6. Weisenburger, S., et al. Volumetric Ca2+ imaging in the mouse brain using hybrid multiplexed sculpted light microscopy. Cell. 177 (4), 1050-1066 (2019).
  7. Yildirim, M., Sugihara, H., So, P. T. C., Sur, M. Functional imaging of visual cortical layers and subplate in awake mice with optimized three-photon microscopy. Nature Communications. 10, 177 (2019).
  8. Takasaki, K., Abbasi-Asl, R., Waters, J. Superficial bound of the depth limit of two-photon imaging in mouse brain. eNeuro. 7 (1), (2020).
  9. Guesmi, K., et al. Dual-color deep-tissue three-photon microscopy with a multiband infrared laser. Light, Science & Applications. 7, 12 (2018).
  10. Hontani, Y., Xia, F., Xu, C. Multicolor three-photon fluorescence imaging with single-wavelength excitation deep in mouse brain. Science Advances. 7 (12), 3531 (2021).
  11. Liu, H., et al. In vivo deep-brain structural and hemodynamic multiphoton microscopy enabled by quantum dots. Nano Letters. 19 (8), 5260-5265 (2019).
  12. Chow, D. M., et al. Deep three-photon imaging of the brain in intact adult zebrafish. Nature Methods. 17 (6), 605-608 (2020).
  13. Wang, T., et al. Three-photon imaging of mouse brain structure and function through the intact skull. Nature Methods. 15 (10), 789-792 (2018).
  14. Xu, C., Webb, W. W. Multiphoton excitation of molecular fluorophores and nonlinear laser microscopy. Topics in Fluorescence Spectroscopy. 5. , 471-540 (2002).
  15. Mostany, R., Portera-Cailliau, C. A craniotomy surgery procedure for chronic brain imaging. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (12), e680 (2008).
  16. Łukasiewicz, K., Robacha, M., Bożycki, &. #. 3. 2. 1. ;., Radwanska, K., Czajkowski, R. Simultaneous two-photon in vivo imaging of synaptic inputs and postsynaptic targets in the mouse retrosplenial cortex. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (109), e53528 (2016).
  17. Kyweriga, M., Sun, J., Wang, S., Kline, R., Mohajerani, M. H. A large lateral craniotomy procedure for mesoscale wide-field optical imaging of brain activity. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (123), e52642 (2017).
  18. Gordon, J. P., Martinez, O. E., Fork, R. L. Negative dispersion using pairs of prisms. Optics Letters. 9 (5), 150-152 (1984).
  19. Entenberg, D., et al. Setup and use of a two-laser multiphoton microscope for multichannel intravital fluorescence imaging. Nature Protocols. 6 (10), 1500-1520 (2011).
  20. Horton, N. G., Xu, C. Dispersion compensation in three-photon fluorescence microscopy at 1,700 nm. Biomedical Optics Express. 6 (4), 1392-1397 (2015).
  21. Wang, T., et al. Quantitative analysis of 1300-nm three-photon calcium imaging in the mouse brain. eLife. 9, 53205 (2020).
  22. Cheng, L. -. C., Horton, N. G., Wang, K., Chen, S. -. J., Xu, C. Measurements of multiphoton action cross sections for multiphoton microscopy. Biomedical Optics Express. 5 (10), 3427-3433 (2014).
  23. Huang, K. -. H., et al. A virtual reality system to analyze neural activity and behavior in adult zebrafish. Nature Methods. 17 (3), 343-351 (2020).
  24. Jacobson, G. A., Rupprecht, P., Friedrich, R. W. Experience-dependent plasticity of odor representations in the telencephalon of zebrafish. Current Biology. 28 (1), 1-14 (2018).
  25. Li, J., et al. Early development of functional spatial maps in the zebrafish olfactory bulb. Journal of Neuroscience. 25 (24), 5784-5795 (2005).
  26. Barbosa, J. S., et al. Live imaging of adult neural stem cell behavior in the intact and injured zebrafish brain. Science. 348 (6236), 789-793 (2015).
  27. Dray, N., et al. Large-scale live imaging of adult neural stem cells in their endogenous niche. Development. 142 (20), 3592-3600 (2015).
  28. Kobat, D., et al. Deep tissue multiphoton microscopy using longer wavelength excitation. Optics Express. 17 (16), 13354-13364 (2009).
  29. Wang, M., Wu, C., Sinefeld, D., Li, B., Xia, F., Xu, C. Comparing the effective attenuation lengths for long wavelength in vivo imaging of the mouse brain. Biomedical Optics Express. 9 (8), 3534-3543 (2018).
  30. Vogel, A., Noack, J., Hüttman, G., Paltauf, G. Mechanisms of femtosecond laser nanosurgery of cells and tissues. Applied Physics B. 81 (8), 1015-1047 (2005).
  31. Li, B., Wu, C., Wang, M., Charan, K., Xu, C. An adaptive excitation source for high-speed multiphoton microscopy. Nature Methods. 17 (2), 163-166 (2019).
  32. Kobat, D., Horton, N. G., Xu, C. In vivo two-photon microscopy to 1.6-mm depth in mouse cortex. Journal of Biomedical Optics. 16 (10), 106014 (2011).
  33. Akbari, N., Rebec, M. R., Xia, F., Xu, C. Imaging deeper than the transport mean free path with multiphoton microscopy. Biomedical Optics Express. 13, 452-463 (2022).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

179

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved