Deep-Tissue Three-Photon 형광 현미경 검사 in Intact Mouse and Zebrafish Brain

요약

삼광자 현미경 검사는 마우스와 제브라피쉬 뇌와 같은 살아있는 생물학적 조직 깊숙한 곳에서 높은 시공간 분해능으로 고대비 형광 이미징을 가능하게 합니다.

초록

2광자 현미경 (2PM) 및 3 광자 현미경 (3PM)과 같은 다중 광자 현미경 기술은 세포 내 해상도로 생체 내 심부 조직 이미징을위한 강력한 도구입니다. 3PM은 생물학 실험실에서 널리 사용 된 2PM 이상의 심부 조직 이미징에 대한 두 가지 주요 이점을 가지고 있습니다 : (i) ~ 1,300 nm 또는 ~ 1,700 nm 여기 레이저를 사용하여 산란 조직에서 더 긴 감쇠 길이; (ii) 고차 비선형 여기로 인한 배경 형광 생성 감소. 그 결과, 3PM은 피질층에서 해마, 성인 제브라피쉬의 전뇌 전체에 이르기까지 온전한 마우스 뇌와 같은 산란 조직 깊숙한 곳에서 고대비 구조 및 기능적 이미징을 허용합니다.

오늘날 3PM에 적합한 레이저 소스가 상용화되어 기존의 2P(2P) 이미징 시스템을 3광자(3P) 시스템으로 전환할 수 있습니다. 또한 여러 상업용 3P 현미경을 사용할 수 있으므로 생물학 연구소에서이 기술을 쉽게 사용할 수 있습니다. 이 논문은 전형적인 3PM 설정, 특히 이미 2P 설정이있는 생물학 그룹을 대상으로하는 최적화를 보여 주며 손상되지 않은 마우스 및 성인 제브라 피쉬 뇌에서 생체 내 3D 이미징을 보여줍니다. 이 프로토콜은 현미경 정렬, ~ 1,300 및 ~ 1,700 nm 레이저 펄스의 프리 치핑, 동물 준비 및 성인 제브라 피쉬 및 마우스 두뇌 깊숙한 곳에서 중요한 3P 형광 이미징을 포함한 3P 이미징의 전체 실험 절차를 다룹니다.

서문

생명 과학에서 2PM 및 3PM과 같은 다중 광자 현미경 (MPM) 기술은 높은 시공간 분해능과 산란 조직의 높은 대비로 심층적 인 생체 내 이미징을위한 강력한 도구였습니다. 또한, 이러한 방법은 1 광자 공초점 현미경^1,2,3,4와 비교할 때 더 적은 광표백을 유발합니다. 3PM은 두 가지 주요 특징으로 인해 2PM과 비교할 때 더 깊은 조직 이미징에 유리합니다 : (i) 장파장 여기 (~ 1,300 nm 또는 ~ 1,700 nm)의 고용은 조직 산란을 감소시키고, (ii) 고차 여기 과정 (즉, 형광 신호는 원하지 않는 배경 형광을 억제하는 2PM의 여기 전력의 제곱 대신 3PM에서의 여기 전력의 입방체에 의존한다)³ . 결과적으로, 3PM은 손상되지 않은 성인 마우스 뇌 3,5,6,7,8,9,10,11의 해^{마와 같은} 살아있는 조직의 더 깊은 영역과 ^Ca2+를 포함한 성인 제브라피쉬 ¹²의 전뇌 전뇌에서 고대비 이미징을 가능하게합니다. 활동 기록 및 다색 관찰. 또한, 마우스와 성인 제브라피쉬^12,13의 손상되지 않은 두개골을 통해 오후 ³시로 고대비 이미지가 얻어졌습니다.

오늘날 ~1,300nm 및 ~1,700nm에서 3P 여기(3PE)에 적합한 여기 레이저 소스가 상용화되어 있습니다. 레이저 스캐닝 시스템은 2PM 및 3PM에 대해 본질적으로 동일하기 때문에, 기존의 2P 셋업을 3P 셋업으로 변환하는 것은 3PE용 상용화된 레이저의 설치와 함께 생물학 실험실에서 가능하다. 3P 형광 신호는 대물 렌즈의 레이저 전력, 펄스 지속 시간, 레이저 반복률 및 수치 조리개 (NA)에 따라 달라집니다. 회절-제한된 초점(즉, 대물 렌즈의 백 애퍼처가 여기 빔에 의해 오버필됨)을 가정하면, Eq(1)은 3PE로부터 생성된 초점 부피로부터의 시간-평균화된 형광 광자 플럭스를 기술한다.

(1)

여기서 f는 레이저 반복률이고, τ는 레이저 펄스 지속시간(반값에서 전폭), φ는 시스템 수집 효율이고, η는 형광 양자 효율이고, σ₃은 3P 흡수 단면이고, C는 형광단 농도이고, n0은 샘플 매질(예를 들어, 물)의 반사 지수이고, λ는 진공에서의 여기 파장이고, NA는 대물 렌즈의 개구수이고, ₃은 초점 볼륨의 공간 적분 상수이며, 대물 렌즈 아래의 시간 평균 여기 광자 플럭스(광자/s)이고, z는 이미지화된 깊이이고, EAL은 유효 감쇠 길이(¹⁴)이다. 여기서 우리는 EAL (전형적으> 100 μm)이 현미경의 축 분해능 (전형적으로 < 10 μm)보다 훨씬 크다고 가정하였다. 역축 근사치에서₃은 28.1¹⁴와 같습니다. g_p(3)은 여기 소스의 3차수 시간적 일관성이고, gp⁽³⁾은 하이퍼볼릭-세컨트-제곱 펄스 및 가우시안 펄스에 대해 각각 0.41 및 0.51이다. φ 수집 효율은 대물렌즈에 의한 형광 수집, 대물렌즈의 투과율, 이색성 거울의 반사율, 필터의 투과율, 및 검출기(예를 들어, 광승수관, 또는 PMT)의 검출 효율을 고려하여 추정될 수 있다. 3P 형광 강도는 다양한 파라미터에 크게 의존하기 때문에 3P 형광 신호를 최대화하기 위해서는 3P 설정의 최적화가 필요합니다.

이 프로토콜은 일반적인 3P 설정의 최적화 프로세스를 보여 주며, 이는 특히 2P 설정을 가지고 있으며 3P 이미징으로 기능을 확장하거나 상용 3P 설정을 최적의 성능으로 유지하려는 생물학 실험실에 유용합니다. 이 비디오 기사는 또한 살아있는 동물의 두뇌에서 심부 조직 3P 이미징을 보여줍니다. 첫 번째 섹션에서는 상용 레이저 소스 및 다중 광자 현미경을 사용한 일반적인 3P 설정의 최적화에 대해 설명합니다. 두 번째 및 세 번째 섹션에서는 뉴런 구조 및 활동의 3PM에 대한 제브라 피쉬 및 마우스 준비에 대해 각각 설명합니다. 마우스 두개골 절제술은 이전에 프로토콜 논문 및 ^15,16,17에보고되었습니다. 네 번째 섹션은 제브라 피쉬와 마우스 뇌에서 생체 내 3P 이미징을 보여줍니다.

프로토콜

제브라피쉬 및 마우스에 대한 모든 동물 실험 및 주거 절차는 코넬 대학 기관 동물 관리 및 사용 위원회 (IACUC) 지침에 따라 승인되고 수행되었습니다. 제브라피쉬와 마우스는 각각 실험 후 고농도 트리카인 용액과 이산화탄소 질식에 의해 안락사시켰다.

1. 삼광자 현미경 설정의 최적화

참고: 눈 보호를 위해 레이저 안전 안경을 착용하십시오. 광학을 배치하거나 이동할 때 빔 차단기로 레이저 빔을 차단하십시오. 레이저를 시각화하려면 적외선 뷰어 또는 적외선 검출기 카드를 사용하십시오.

1. 레이저를 켜고 비공선형 광 파라메트릭 증폭기(NOPA)의 아이들러 출력의 중심 파장을 ~1,300nm 또는 ~1,700nm로 설정합니다.
2. NOPA의 신호 포트(즉, ∼700-900 nm)로부터 빔라인 상에 얇은 커버 글라스를 놓고, 레이저 빔의 작은 부분을 Si 광 다이오드에 반사시켜 트리거링 신호를 얻는다(그림 1). 빔 차단기를 커버 글래스의 전송 경로에 배치합니다.
3. 펄스 압축기를 광 경로에 배치하여 펨토초 레이저를 프리처핑하여 오후 3시의 펄스 지속 시간을 최적화합니다. ~1,300nm 빔의 경우, 프리즘 쌍 압축기(^18,19)(예를 들어^, N-SF11 프리즘 쌍)를 배치한다. ~1,700nm 레이저의 경우 두께²⁰에 ~3mm의 Si 플레이트를 놓습니다. Si 플레이트와 레이저 경로 사이의 각도를 브루스터의 각도(1,700nm의 경우 ~73.9°)로 설정하여 레이저 투과율을 최대화합니다. Si 플레이트를 회전시켜 반사를 최소화하여 브루스터의 각도를 달성하십시오.
4. 플리퍼 미러를 배치하여 ~1,300nm와 ~1,700nm 빔 라인 사이를 편리하게 전환할 수 있습니다.
5. 레이저의 강도를 제어하기 위해 회전 스테이지에 장착된 반파판(예를 들어, ∼1,300 및 ∼1,700 nm에 적합한 무색 반파판)과 편광 빔 스플리터(PBS)를 배치한다. 빔 차단기를 PBS의 반사 경로에 배치한다.
   참고: 레이저는 높은 소멸 비율을 달성하기 위해 PBS를 수직으로 통과해야 합니다. 3PM의 레이저 전력은 반파판을 회전시켜 제어됩니다.
6. 얇은 커버 유리를 파워 컨트롤러 뒤와 옵티컬 셔터 앞의 광 경로에 배치하여 레이저 빔의 작은 부분을 파워 미터에 반사시킵니다. 파워 미터를 '기준 파워 미터'로 사용하여 이미징 중에 목표 아래의 레이저 파워를 계산합니다(1.12단계 참조).
7. 미러를 조정하여 빔을 3PM 시스템으로 전파하여 레이저 경로를 정렬합니다.
8. 번역 스테이지의 나이프 에지와 파워 미터를 사용하여 목표물의 뒤쪽 조리개 위치에서 빔 크기를 측정합니다. 빔 크기가 너무 작거나 너무 크지 않은지 확인하십시오.
   참고: 일반적으로 빔은 높은 NA 대물 렌즈를 약간 언더필하여 심층 조직 이미징을 위한 높은 전력 처리량을 달성합니다. 예를 들어, 올림푸스 목표물의 후면 조리개(~15mm 후면 조리개 직경)에서 ~10-13mm(1/e²)의 빔 크기는 ~0.7-0.9의 유효 NA를 달성하는 데 도움이 됩니다. 빔 크기가 너무 작으면 3P 신호가 약해지고 유효 NA가 낮기 때문에 공간 분해능이 악화됩니다. 빔 크기가 너무 크면 목표물의 뒤쪽 조리개에서 전력 손실로 인해 목표 아래에서 사용 가능한 최대 여기 전력이 약해집니다. 심부 조직 이미징의 경우, 한계 광선은 또한 조직 내의 더 긴 경로로 인해 더 높은 손실을 겪습니다.
9. 목표물의 뒤쪽 조리개에서 빔 크기가 적절하지 않은 경우 볼록렌즈와 같은 적절한 광학 요소를 레이저 빔 경로에 배치하여 빔 크기를 조정합니다.
   주: 불필요한 전력 손실을 방지하기 위해 레이저 빔이 galvo 미러보다 크지 않은지 확인하십시오.
10. 대물 렌즈를 오후 3시 설정에 놓습니다.
11. 자동 상관기를 사용하여 목표 후 펄스 지속 시간을 측정합니다. 펄스 지속 시간이 너무 긴 경우(예: >70fs) 펄스를 더 짧게 하도록 펄스 압축기를 조정하십시오. 오후 3시에는 ~50-70fs 펄스를 사용하고 레이저와 목표 사이에 놓인 Michelson 간섭계를 사용하여 자기 상관 측정에 대한 지연을 제공합니다.
    참고: 목표의 초점에 배치된 적절한 스펙트럼 응답을 갖는 광 다이오드(예를 들어, 1,200nm보다 큰 파장에 대한 실리콘 광 다이오드)는 비선형 검출기로서 편리하게 기능할 수 있고, 광 다이오드로부터의 이광자 광전류는 자기 상관 트레이스(²⁰)를 획득하는데 사용될 수 있다. ~ 1,300 nm의 프리즘 쌍 압축기는 두 가지 방법으로 조정할 수 있습니다 : (1) 두 프리즘 사이의 거리 변경; (2) 프리즘(들)을 프리즘의 기준선에 수직으로 이동시킴으로써 프리즘 유리에서 레이저 빔의 경로 길이를 변경한다. ~1,700nm의 Si 플레이트 압축기는 Si 플레이트를 더 두껍거나 얇은 Si 플레이트로 대체하여 조정할 수 있습니다.
12. 파워 미터를 대물 렌즈의 출력에 놓습니다. 목표 하에서 레이저 파워를 측정하고 기준 파워 미터의 값을 판독한다(1.6단계부터). 목표 하의 전력량과 기준 전력계에서 전력의 비율을 계산합니다.
    참고: 이미징 중에 목표 아래의 실제 레이저 전력은 전력 비율과 기준 전력계의 값에서 계산할 수 있습니다.
13. 목표 아래에서 파워 미터를 꺼냅니다.
14. [선택 사항] 이미징 시스템의 광자 샷 노이즈 제한 성능 확인
    참고: 이 작업을 수행하려면 1) 하나의 플루오레세인 또는 텍사스 레드 염료 풀(예: ~10μM), 2) 광자 계수기, 3) 오실로스코프 등의 요소가 필요합니다.
    1. 염료 풀 샘플을 3PM 대물 렌즈 아래에 놓습니다.
    2. 거리가 대물 렌즈의 작동 거리보다 작을 때까지 대물 렌즈를 염료 풀 위로 조심스럽게 내립니다.
    3. 렌즈와 염료 풀의 커버 글라스 사이에 물을 넣으십시오.
    4. 현미경의 출력 전력을 소량(예를 들어, ~1MHz 펄스 반복률로 <1mW)으로 설정하여 염료 풀의 표면을 찾습니다.
    5. 현미경의 라이브 세션을 시작하고 z 위치를 0으로 설정합니다.
    6. 목표물을 샘플로부터 천천히 움직여 염료 풀의 상단에 도달합니다 (커버 글라스에 의해 생성 된 세 번째 고조파 생성 (THG)으로 표시됨).
    7. 커버 글래스의 위치에서 z 위치를 0으로 설정합니다.
    8. 형광 채널에서 명확한 형광 신호가 보일 때까지 목표를 약간 낮춥니다.
    9. PMT의 출력을 BNC 스플리터에 연결합니다. 분배기의 출력을 광자 카운터 및 이미지 수집 시스템에 연결합니다.
    10. 레이저 파워를 초당 광자 카운트가 레이저 반복률의 5%보다 낮은 값으로 설정한다(예를 들어, 1MHz 레이저가 사용될 때 50,000 광자/s).
    11. 소프트웨어를 사용하여 시야각을 가능한 최소한으로 줄이고 밝기가 이미지 전체에서 균일한지 확인하십시오.
    12. 프레임 속도를 초당 1.0프레임으로 설정합니다.
    13. 광자 카운터의 획득 기간을 t = 프레임당 픽셀 수 × 픽셀 유지 시간 및 적절한 판별기 레벨로 설정합니다.
    14. 동등한 기간 동안 광자 수와 픽셀 수를 동시에 수집합니다. 픽셀 수를 얻으려면 전체 이미지의 평균 픽셀 값과 평균 및 표준 편차 값을 수집합니다.
    15. 1.14.14단계를 반복하여 여기 레이저를 차단하여 어두운 광자 수와 픽셀 수를 얻습니다.
    16. 소프트웨어의 라이브 획득을 중지하십시오.
    17. 광자 카운트(단계 1.14.14에서 획득)와 총 픽셀 카운트(단계 1.14.14에서 획득)에서 다크 카운트(단계 1.14.15에서 획득)를 뺍니다.
    18. 어두운 뺀 총 픽셀 수를 어두운 뺀 광자 수로 나눕니다(1.14.17단계에서 얻음). 얻은 값을 픽셀 값에서 광자 수까지의 '변환 계수'(즉, 픽셀 값 / 광자)로 사용하십시오.
    19. 픽셀 카운트의 평균 및 표준 편차(단계 1.14.14에서 얻어짐)를 광자 카운트, 즉 이를 '변환 계수'(단계 1.14.18에서 얻음)로 나눕니다. 광자 수의 평균과 표준 편차를 비교하십시오. 이미징 시스템 성능이 샷 노이즈 한계에 근접한 경우 표준 편차가 광자 카운트 평균의 제곱근과 거의 같은지 확인하십시오.
15. [선택 사항] 현미경의 신호 검출 효율을 검증하십시오.
    1. 현미경 성능과 신호 검출 효율을 테스트하려면 1.14.1-1.14.17 단계에 따라 광자 수를 구하십시오. 단계 1.14.15를 위해, 염료를 위한 용매로 만들어진 빈 샘플을 만들고, 염료 풀에 대한 것과 동일한 힘으로 레이저를 켠 채로 블랭크 샘플에 대한 광자 카운트를 구한다. 염료 풀에서 광자 카운트에서 빈 카운트를 빼서 형광 광자 카운트를 얻습니다.
    2. 플루오레세인 또는 텍사스 레드^10,22 및 Eq. (1)의 알려진 3P 단면^을 사용하여 (백 조리개를 적절하게 채우는 데 효과적인 NA가 있음) 예상 광자 카운트를 계산 한 다음 계산 된 값을 실험적으로 측정 된 광자 카운트와 비교하십시오. 두 광자 수를 실험실 노트북에 나중에 참조 할 수 있도록 현미경에 대한 테스트 결과로 기록하십시오.
       참고: 계산된 값과 측정된 값이 서로 가까이 있는지 확인하십시오(예: 2배 이내). 시스템의 이러한 정량적 테스트는 시간이 지남에 따라 일관된 이미징 성능을 보장하기 위해 특히 유용합니다.

2. 오후 3시 물고기 준비

참고: 이 절차를 위해 장갑과 실험실 코트를 착용하십시오. 실험에 따라 성인 제브라 피쉬를 선택하십시오. ~ 15 분 이내에 전체 준비 (2.1 ~ 2.7 단계)를 완료하십시오.

1. ~ 0.5cm의 2 % 고용융점 한천으로 페트리 접시를 준비하십시오. 한천의 직사각형 구멍을 물고기보다 길고 약간 넓게 자릅니다. 왁스를 사용하여 얇은 튜브 (물고기의 입에 물을 관류시키기 위해)를 직사각형의 한쪽 끝이있는 Petri 접시에 부착하십시오. 왁스를 사용하여 페트리 접시의 가장자리에 더 큰 직경의 튜브 (물 제거용)를 부착하십시오.
2. 실험을 위해 물고기를 선택하십시오. 물고기가 완전히 반응하지 않고 깊게 마취 될 때까지 행크의 용액에 0.2 mg / mL 트리카인 용액 (pH 7.2)으로 물고기를 마취하십시오.
3. 젖은 스폰지에 물고기를 옆으로 놓습니다. 미세주사기를 사용하여 3μL의 판쿠로늄 브로마이드(행크 용액의 경우 0.4μg/μL)를 역궤도로 주입하여 물고기를 마비시킵니다. 행크의 용액에 물고기를 잠깐 넣어 완전히 마비되었는지 확인하십시오.
4. 물고기 등쪽을 페트리 접시에 올려 놓고 머리를 튜빙쪽으로 향하게하십시오. 포셉을 사용하여 튜브를 조작하고 물고기의 입을 부드럽게 열고 튜브를 입으로 밀어 넣습니다. 튜빙이 물고기의 입 뒤쪽에 오도록 물고기를 튜빙 쪽으로 부드럽게 밀어 넣습니다.
5. 물고기 주위의 한천을 빠르고 부드럽게 말리고 물고기 꼭대기의 물을 제거하십시오. 실험실 조직의 작은 조각을 실험실 접착제에 담그고 물고기의 양쪽에있는 한천과 아가미에 물고기의 등 꼬리 위에 조직을 넣으십시오.
   참고 : 물고기를 밀거나 압력을 가하지 마십시오. 아가미에 접착제가 붙지 않도록주의하십시오.
6. 머리 표면에 직접 작은 부피바카인 한 방울을 발라서 레이저가 피부에 닿을 부위에서 이미징하는 동안 물고기를 마취하십시오.
7. 물고기와 함께 페트리 접시를 현미경으로 가져 와서 물고기 시설 물로 채 웁니다. 튜브를 워터 펌프에 연결하여 시스템 물을 2 mL / min으로 물고기의 입으로 펌핑하고 동시에 동일한 속도로 접시에서 관류 용액을 제거하십시오. 물이 버블러로 산소를 공급하고 수족관 히터로 ~ 30 °C로 따뜻하게하십시오.
   참고 : 물고기는 이제 이미징 할 준비가되었습니다. 이미징하는 동안 세 번째 고조파 생성 (THG) 신호의 혈류를 모니터링하여 물고기의 건강을 모니터링하십시오 (섹션 4.1 참조). 3P 이미징은 또한 가상 현실²³ 동안 이미징하는 동안 머리를 고정하고 신체 움직임을 허용하기 위해 2P 이미징에 사용되는 것과 같은보다 정교한 어류 준비와 호환되어야합니다. 이 완전히 비 침습적 인 이미징은 척추 동물에 대한 다른 연구에서 전형적 인 것처럼 두개골 제거의 필요성을 피하고 침습적 연구 및 관련 통증을 최소화하기위한 단계입니다.

3. 오후 3시를위한 마우스 준비

참고: 다음 절차 중에는 장갑, 수술용 마스크 및 실험실 코트를 착용하십시오. 실험에 따라 마우스 라인을 선택하십시오. 마우스는 수술 전에 12:12 시간의 밝은 어둠주기 아래에 보관해야합니다. 전체 수술 (3.2-3.11 단계)은 무균이며 모든 수술 도구는 사용 전에 멸균해야합니다. 두개골 절제술은 ~ 1 시간이 걸립니다.

1. 도넛 모양(직경 4.5-6.5mm) 커버슬립과 커버슬립 디스크(직경 5mm)를 깨끗한 파라필름 위에 놓습니다. 바늘을 사용하여 소량의 광학 접착제를 도넛 모양의 커버슬립을 커버슬립 디스크에 붙입니다. 파라 필름의 디스크 도넛 커버 슬립을 자외선으로 10-20 분 동안 치료하십시오. 파라필름에서 디스크 도넛 커버슬립 전체를 제거하고 핀셋을 사용하여 과도한 접착제와 70% 에탄올을 긁어 이물질을 제거합니다.
   참고: 커버슬립은 두께가 ~0.17mm입니다. 도넛 모양의 커버 슬립은 만성 이미징을 위해 뇌에 적절한 압력을 가하는 데 사용됩니다.
2. 마우스를 유도 챔버에서 3% 이소플루란과 20%_O2 가스 혼합물로 마취시킨다. 마우스의 무게를 재십시오. 마우스를 가열 패드의 경향이있는 위치에 놓습니다. 가열 패드의 온도를 ~ 37 °C로 설정하십시오.
3. 마취 마스크를 배치하여 입체 조영 장치의 입 구멍에 윗니를 고정시킵니다. 귀에 이어 바를 고정하십시오. 수술 중에 2 % 이소플루란과 20 %_O2 가스 혼합물로 마취를 유지하십시오.
   참고: 마우스의 반응을 모니터링하여 이소플루란의 농도를 조정하십시오. 호흡 속도 (깊은 수면의 경우 ~ 1Hz)를보고 발을 꼬집어 수술 전에 어떤 반응을 보임으로써 마취 수준을 확인하십시오.
4. 윤활을 위해 눈 연고를 눈에 바르십시오. 눈꺼풀을 닫습니다. 모든 수술 조명을 켭니다. 수술 전에 마우스 체중을 기준으로 케토프로펜, 덱사메타손 및 글리코피롤레이트를 피하 주사한다.
   참고 : 약물 용량은 케토프로펜, 덱사메타손 및 글리코 피롤레이트의 경우 각각 2 mg / mL, 0.1 mg / mL 및 0.1 mg / mL입니다. 케토프로펜, 덱사메타손 및 글리코피롤레이트의 주사량은 체중에 따라 다르며 각각 2.5μL/g, 2μL/g 및 2μL/g입니다.
5. 머리의 면류관과 귀 근처에서 머리카락을 제거하십시오.
   1. 가위 또는 머리 깎기로 가능한 한 많은 머리카락을 자르고 수술 부위에서 잘린 머리카락을 제거하십시오.
   2. 적절한 양의 탈모 크림을 바르십시오. 1분 정도 기다립니다.
   3. 식염수에 적신 면봉을 사용하여 머리카락과 크림을 제거하십시오.
   4. 모발이 완전히 제거될 때까지 3.5.2단계와 3.5.3단계를 반복합니다.
   5. 5 % 포비돈 요오드 용액을 바른 다음 피부에 70 % 에탄올을 바르면 그 부위를 정화하십시오. 이 과정을 세 번 반복하십시오.
6. 머리에 아트로핀 (체중 기준, 0.02-0.05 mg / kg)을 피하 주사하십시오. 1분 정도 기다립니다.
7. 두개골을 노출시키기 위해 머리의 크라운에있는 피부를 자르십시오. 브레그마 포인트와 람다 포인트가 모두 노출되어 있는지 확인하십시오. 생체 적합성 접착제를 사용하여 가장자리에 남아있는 피부 조직을 두개골에 붙여서 드릴링 먼지가 피부 아래로 들어가는 것을 방지합니다 (면역 반응을 유발할 수 있음).
8. 수술 마커를 사용하여 관심 영역 위에 직경 5mm 원을 그립니다. 예를 들어, 체세포 감각 피질과 시각 피질의 대부분을 덮고있는 브레그마에 ~ 2.5mm 측면 및 2mm caudal 영역의 중심을 선택하십시오.
9. 원을 따라 천천히 드릴링하고 식염수를 바르면 중간에 두개골에 수분을 공급하십시오. 두개골을 제거하기 전에 마지막 절반의 드릴링 속도를 늦추고 두개골을 식염수로 덮으십시오. 포셉으로 두개골을 부드럽게 열고 식염수에 담근 멸균 젤폼의 작은 조각을 적용하여 뇌의 출혈을 즉시 막으십시오. 식염수를 사용하여 뇌에 수분을 공급하십시오.
10. 준비된 디스크 도넛 커버슬립의 측면에 식염수 한 방울을 바르고 뇌 조직을 향하게하십시오. 디스크 도넛 커버슬립의 돌출된 디스크 부분을 두개골 창에 넣습니다. 입체 택시 장치가 가지고있는 긴 막대를 사용하여 커버 슬립 두개골 창문의 디스크 부분을 뇌 표면으로 부드럽게 눌러 도넛 부분이 두개골을 단단히 덮도록하십시오. 디스크 도넛 커버슬립 주위의 부분을 면봉으로 말리십시오.
11. 도넛 모양의 가장자리 아래에 생체 적합성 접착제 층을 바르십시오. 디스크 도넛 커버 슬립의 도넛 부분 아래 및 주위에 치과 시멘트 믹스 층을 적용하십시오. 치과 시멘트 위에 접착제의 다른 층을 적용하십시오. 5 % 포도당 (체중 기준, 10 μL / g)은 수술 중에 매 시간마다 피하 주사하여 동물 에너지를 제공 할 수 있습니다.
12. 마취 시스템을 종료하십시오. 마우스를 입체 전술 장치로부터 떼어낸다. 마우스를 ~37°C의 가열 패드와 마취 장치를 사용하여 즉시 맞춤형 소형 입체 장치로 옮깁니다.
13. 마우스를 맞춤형 소형 입체 택시 장치의 가열 패드 위에 놓기 쉬운 위치에 놓습니다. 온도를 ~ 37 °C로 설정하십시오. 윗니를 입체 관념 장치의 입 구멍에 고정시키고 귀 막대를 마우스의 귀에 고정시킵니다. 마취 튜브에 넣고, 1.5% 이소플루란 및 20%_O2 가스 혼합물로 마취를 유지한다.
    참고: 이제 마우스를 이미징할 준비가 되었습니다. 마우스를 다음 이미징 절차 동안 마취 상태로 유지하십시오. 마우스의 반응을 모니터링하여 이소플루란의 농도를 조정한다.

4. 물고기와 쥐 두뇌의 생체 내 영상

1. 제브라피쉬 뇌의 생체 내 영상
   참고: 대물 렌즈 아래에서 물고기 뇌를 제대로 찾기 위해 보조 전하 결합 장치(CCD) 카메라가 광역 이미징을 위한 여기 조명과 동일한 경로에 사용됩니다.
   1. 현미경을 설치하고 전원을 보정하십시오 (섹션 1에 설명 된대로).
   2. 현미경에 낮은 배율 (일반적으로 4x) 대물을두십시오.
   3. 물고기와 튜브가 들어있는 페트리 접시를 현미경 아래에 놓습니다.
   4. 발광 다이오드(LED) 광원을 사용하여 페트리 접시를 비춥니다.
   5. 이미지 수집 소프트웨어의 카메라 모드를 엽니다(그림 2).
   6. 라이브를 클릭합니다.
   7. 화면 오른쪽에서 채널 A 를 선택합니다.
   8. 히스토그램 설정을 조정하여 이미지를 명확하게 볼 수 있습니다.
      참고: 필요에 따라 업데이트해야 합니다.
   9. 모터 컨트롤러의 모터 설정을 Base로 설정합니다.
   10. 물고기가 보일 때까지 목표를 낮춥니다.
       참고: 대물 렌즈가 머리와 물리적으로 접촉하지 않도록 하십시오.
   11. 물고기 머리의 중심을 시야의 중앙에 놓습니다.
   12. 목표물을 위로 움직여 물고기 머리에서 멀리 떨어뜨립니다.
   13. 저배율 대물 렌즈를 오후 3시용 높은 NA 대물 렌즈로 교체합니다.
       참고: 저배율 렌즈와 높은 NA 대물 렌즈는 파초점일 필요는 없지만 물고기가 높은 NA 대물 렌즈의 시야 내에 있는지 확인할 수 있을 만큼 충분히 가까이 있어야 합니다.
   14. 대물 렌즈를 천천히 낮추어 목표물이 머리와 물리적으로 접촉하지 않도록하십시오. CCD 카메라 소프트웨어에서 머리 상단이 보이면 목표물의 움직임을 중지합니다. z 위치를 0 μm로 설정합니다.
       참고: 침수 목표를 사용할 때 대물 렌즈 아래에 기포가 없는지 확인하십시오.
   15. LED 광원을 끄고 시스템 주변의 어두운 커튼을 닫습니다.
   16. 3P 이미징을 위해 이미징 수집 소프트웨어를 Multiphoton GG 모드로 설정하고 대물 렌즈 아래의 전력을 1mW 미만(최대 1MHz 펄스 반복률)으로 설정합니다.
   17. 모터 설정 버튼을 모터 컨트롤러의 기본 에서 목표로 변경합니다.
   18. 방의 조명을 끄십시오.
   19. PMT를 켜고 오후 3시 여기 소스 셔터를 엽니다. 뼈의 윤곽선이 뼈의 THG로 인한 자가형광 및 THG 신호 채널로 인한 형광 신호 채널에서 나타나는지 확인하십시오(그림 2C).
   20. 더 깊이 이미징할 때 전력 레벨을 높여 다른 깊이에서 이미징을 수행합니다.
2. 마우스 뇌의 생체 내 영상
   참고 : 이미징 중에 매 시간마다 마취 된 마우스에 5 % 포도당을 주입하십시오. 복용량은 체중 (10 μL / g)을 기준으로합니다.
   1. 3P 이미징을 위해 이미징 수집 소프트웨어를 Multiphoton GG 모드로 설정하고 대물 렌즈 아래의 전력을 1mW 미만(최대 1MHz 펄스 반복률)으로 설정합니다.
      참고: 수차를 줄이기 위해 수술 창이 대물 렌즈에 수직으로 배치되어 있는지 확인하십시오. 미세 조정은 입체 택시 장치를 틸팅함으로써 수행된다.
   2. 대물렌즈를 창문 가까이로 이동시키고 대물렌즈와 두개골창 사이에 물을 바르는 단계; 모든 모터의 축 값을 0으로 설정합니다.
      참고 : ~ 1,700 nm에서_H2O의 광 흡수가 크므로 ~ 1-2mm의 수심 후에 ~ 1,700 nm의 레이저 전력이 크게 감소합니다. ~1,700nm 여기의 경우, 물에 의한 흡수를 줄이기 위해 1,700nm에서 훨씬 작은 흡수를 갖는_D2O를 사용하십시오.
   3. 이미지 수집 소프트웨어에서 라이브 버튼을 클릭하고 PMT 채널(예: 형광 신호 채널 하나와 THG 신호 채널 하나)을 엽니다. 필요에 따라 PMT 게인 과 배경 레벨 을 조정합니다.
   4. 대물 렌즈를 천천히 위로 움직여 큰 혈관과 창 유리 표면으로부터 THG 채널을 모니터링하여 창 표면을 찾습니다. 필요한 경우 창 방향을 조정합니다(4.2.12단계의 메모 참조). 모터를 제로 로 설정하여 뇌의 표면을 정의합니다.
   5. 이미징을 수행하고 이미징 깊이에 따라 전력 레벨을 조정합니다.

결과

이 프로토콜의 성공적인 완성은 최적의 광 파라미터 (예를 들어, 펄스 지속시간, NA) 및 생체내 3PM에 적합한 동물 제제를 갖는 적절하게 정렬된 현미경을 초래할 것이다. 상업적으로 입수가능한 3P 셋업은 ~1,300 nm 및 ~1,700 nm 모두에 적합한 미러 및 렌즈를 포함한다; 따라서 여기 파장이 1,300nm와 1,700nm 사이에서 전환될 때 광학의 변화가 필요하지 않습니다. 3P 셋업의 렌즈에 1,300 및 1,700nm에 적합한 코팅이 없는 경우 레이저 전력 손실을 줄이기 위해 적절한 렌즈로 교체해야 합니다. 최적화 된 3PM과 적절한 동물 준비로 높은 콘트라스트를 가진 생체 내 형광 및 THG 이미지를 뇌 깊숙이 수집 할 수 있습니다.

도 3은 온전한 성인 제브라피쉬의 대표적인 3P 이미지를 보여준다. 성인 제브라피쉬 뇌에서 유전자 표지된 뉴런의 고해상도, 비침습적, 심층 영상화는 3PM을 사용하여 달성된다. 텔렌스팔론 영역의 영상이 2PM^24,25,26,27을 사용하여 성인 제브라피쉬 뇌에서 보고되었지만^, 3PM은 텔렌스팔론 전체와 다른 기술을 사용하여 관찰하기가 더 어렵거나 불가능한 영역에 접근할 수 있게 한다. 광학 구조체 및 소뇌에서 세포층의 분포는 도 3C에서 관찰될 수 있다. 성공적인 이미징 세션에서, 뼈는 THG 채널에서 볼 수 있고 형광 채널에서 볼 수 있는 뉴런이다. 성인 제브라피쉬 영상의 경우, 현미경의 카메라 기능을 사용하여 물고기를 찾습니다(그림 3A). 이 단계는 유리 창이 뇌에 쉽게 접근 할 수있을만큼 충분히 크기 때문에 마우스 뇌 영상에 필요하지 않습니다. 성인 제브라피쉬 뇌의 고해상도 구조 이미지는 이전 섹션에서 설명한 시스템을 사용하여 얻어졌다. 두개골은 THG 채널 (그림 3B)에서 볼 수 있으며, 이는 뇌를 탐색하고 상단 표면을 찾는 데 도움이됩니다. 도 3C에서 관찰된 바와 같이, 뉴런은 성인 뇌 깊숙한 곳에서 높은 신호-배경비(SBR)로 구별될 수 있다. 뇌 위의 조직은 자기 형광으로 인해 형광 채널에서 볼 수 있습니다.

도 4는 1,340 nm 여기¹⁰을 갖는 성인 마우스 뇌에서 THG (파란색) 신호와 함께 GCaMP6s 표지된 뉴런 (녹색) 및 텍사스 레드 표지된 혈관 (적색)의 다색 3P 이미지를 도시한다. 이미지는 이전 작품⁽¹⁰)으로부터 재생된다. 도 4에서, 초점에서의 펄스 에너지는 충분한 형광 및 THG 신호를 얻기 위해 전체 깊이에서 ∼1.5 nJ로 유지되었고, 최대 평균 레이저 전력은 ∼70 mW였다. 펄스 지속 시간은 ∼60 fs로 조정되었고, 유효 NA는 ~0.8이었다. 3PM 설정을 최적화하여 CA1 해마 영역에서 뇌 표면에서 1.2mm까지 고대비 이미지를 성공적으로 얻을 수 있었습니다(그림 4A,B). 도 4C, D는 10분 기록 세션 동안 750μm의 깊이에서 GCaMP6s 표지된 뉴런의^Ca2+ 활성 흔적을 보여주며, 높은 기록 충실도를 보여준다.

여기 레이저가 잘못 정렬되면 시야각을 가로 지르는 신호 밝기의 불균일성이 관찰 될 수 있습니다. 추가적으로, 펄스 지속시간, 초점에서의 여기 펄스 에너지 및 효과적인 NA와 같은 레이저 파라미터가 최적화되지 않으면, 물고기 두개골 또는 마우스 뇌의 두개골 절제술 창으로부터의 THG 이미지가 보이지 않을 것이고/있거나 높은 여기 펄스 에너지(예를 들어, 초점에서 >2nJ/펄스)를 필요로 할 것이다. 따라서 뇌 표면의 THG 신호는 심부 조직 이미징을 시작하기 전에 최적화 된 3PM 설정을위한 지표로 사용할 수 있습니다.

그림 1: 오후 3시 설정의 개략적인 그림. 여기 레이저의 파장은 ~1,300nm 또는 ~1,700nm로 설정되며, NOPA의 아이들러 포트에서 출력됩니다. 프리즘 쌍 압축기와 Si 플레이트 압축기는 여기 레이저 펄스를 프리처프하기 위해 각각 ~ 1,300 nm 및 ~ 1,700 nm 레이저에 사용됩니다. ~1,300nm 및 ~1,700nm 레이저 빔은 플리퍼 미러로 전환할 수 있습니다. NOPA의 신호 포트는 트리거링 신호를 획득하는데 사용된다. 반파판 및 PBS가 여기 전력을 제어하기 위해 사용된다. 형광과 THG는 GaAsP PMT에 의해 검출됩니다. 이색성 미러와 대역 통과 필터의 적절한 조합은 형광과 THG 신호를 분리하는 데 사용됩니다. 약어 : 3PM = 3 광자 현미경; NOPA = 비공선형 광학 파라메트릭 증폭기; PBS = 편광 빔 스플리터; THG = 세 번째 고조파 생성; DAQ = 데이터 수집; PMT = 광배수 튜브. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 2: 물고기의 생체 내 이미징을 위한 대표적인 스크린샷(프로토콜 섹션 4.1). (A) 4x 대물 렌즈가 장착된 이미지 수집 소프트웨어의 카메라 모드 보기. 소프트웨어의 주요 기능은 다음과 같이 개요 및 번호가 매겨집니다 : 1. 이미지 획득 소프트웨어의 이미징 모드. 모드 옵션은 카메라, 멀티 광자 및 멀티 광자 GG입니다. CCD 카메라를 사용한 백색광 이미징의 경우 카메라 모드가 선택됩니다. 2. 라이브 버튼을 클릭하면 카메라 (또는 다중 광자 옵션의 경우 PMT)가 켜지고 현미경의 실시간 뷰를 관찰 할 수 있습니다. 3. 캡처 설정 탭에서 원하는 이미징 파라미터(전력, 위치, 깊이)가 설정됩니다. 4. 캡처 탭에서 이미지를 저장할 폴더 위치가 할당됩니다. 이 탭에서 이미징을 시작할 수 있습니다. 5. Z Control 설정은 z 스테이지 모터를 이동하여 이미징의 깊이를 제어합니다. 6. 제브라 피쉬 머리의 대표 이미지. 머리의 로스트랄 쪽은 왼쪽에 있습니다. (B) 25x 대물 렌즈를 사용한 카메라 모드의 대표적인 모습. (C) (B)에서 본 영상의 THG 이미지를 포함하는 다중광자 GG 모드의 대표도. 약어: CCD = 전하 결합 장치; PMT = 광승수 튜브; THG = 세 번째 고조파 세대. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 3: 이미지 획득 소프트웨어로 획득한 성인 제브라피쉬 뇌의 대표적인 이미지. (A) 4x 대물 렌즈로 획득한 성인 제브라피쉬 머리의 카메라 모드 이미지. 이미지의 맨 위는 로스트랄 방향입니다. OT 로브와 CB가 윤곽을 그립니다. (B) (A)의 THG 이미지가 포함된 25x 대물렌즈로 멀티광자 GG 모드에서 획득한 대표적인 영상. (C) 소뇌와 다양한 깊이의 뉴런의 세포질에서 GFP가 발현되는 광학 텍텀의 교차점에서 성인 제브라 피쉬 뇌의 형광 이미지. 스케일 바 = 100 μm. 약어: OT = 옵틱 텍탐; CB = 소뇌; THG = 세 번째 고조파 생성; GFP = 녹색 형광 단백질. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 4: 마우스 뇌에서 1,340 nm 여기 시 GCaMP6 s 표지된 뉴런(녹색), 텍사스 적색 표지된 혈관(적색) 및 3차 고조파 생성(파란색)의 다색 3 PM. (A) 270 x 270 μm(프레임당 512 x 512 픽셀)의 시야각을 갖는 뇌 표면으로부터 1,200 μm까지 내려오는 Z-스택 이미지. 레이저 파워는 초점에서 ~1.5 nJ 펄스 에너지를 유지하기 위해 이미징 깊이에 따라 변화되었다. 목표 하에서의 최대 평균 전력은 70mW였다. (B) 다양한 이미징 깊이에서 선택된 2D 이미지. (c) 270 x 270 μm (256 x 256 픽셀)의 시야각을 갖는 경막 아래 750 μm의 활동 기록 부위. (d) (C)에 표시된 표지된 뉴런으로부터 깨어 있는 마우스에 기록된 자발적인 뇌 활동 흔적. 프레임 속도는 8.3Hz였고, 픽셀 체류 시간은 0.51μs였다. 레이저 반복률은 2MHz이고 대물 렌즈 아래의 평균 전력은 56mW였습니다. 각 트레이스는 기준선으로 정규화되고 0.72s 시간 상수의 해밍 창을 사용하여 저역 통과를 필터링했습니다. 스케일 바 = 50 μm. 이 그림과 그림 전설은 ¹⁰에서 재현됩니다. 약어 : 3PM = 3 광자 현미경. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 5: 마우스 뇌의 신피질에서 효과적인 감쇠 길이. EAL (마젠타 라인)은 75% 물 조성을 가정하여 조직 산란 (적색 선) 및 조직 (청색 선)에서의 수분 흡수로부터 계산된다. 검은 별은 마우스 뇌의 신피질에서 EIL의 보고된 실험 데이터 3,21,28,29를 나타낸다. EAL은 조직마다 다릅니다. 약어: EAL = 유효 감쇠 길이. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

여기 파장 (nm)	침수	최대 레이저 전력 (엠W)	초점에서 최대 펄스 에너지* (nJ)	마우스 피질의 전형적인 EAL (μm)	마우스 피질의 영상 깊이** (mm)	목표 하의 펄스 에너지 *** (nJ)	최대 레이저 반복률**** (메가헤르츠)
1300	H2O또는D2O	100	2	~300	0.8	~14	~7
					1.2	~55	~2
					1.6	~210	~0.5
					2.1	~1100	~0.1
1700	D2O	50	3	~400	0.8	~7	~7
					1.2	~20	~2.5
					1.6	~55	~1
					2.1	~190	~0.3

표 1: 마우스 피질 영상화를 위한 전형적인 3P 여기 조건.
* 높은 NA (~ 1.0) 목표, ~ 50 fs의 펄스 폭 및 형광 단백질 (예 : GFP 및 RFP)과 같은 전형적인 형광단.
** EAL이 전체 피질에서 균일하다는 가정하에.
초점에서 ~1nJ/펄스를 달성하기 위해, EAL 및 이미징 깊이로부터 계산.
목표 하의 펄스 에너지와 최대 허용 레이저 전력으로부터 계산됩니다.
약어: 3P = 삼광자; NA = 수치 개구; GFP = 녹색 형광 단백질; RFP = 적색 형광 단백질; EAL = 유효 감쇠 길이.

토론

이 프로토콜은 상용 현미경 및 레이저 소스로 3P 이미징을 설정하는 단계별 절차를 설명합니다. 2PM에 비해, 3PM은 마우스 뇌 해마에서와 같이 더 깊은 영역에서의 광학 접근을 필요로 하는 어플리케이션에서 이점을 갖는다. 3PM은 주로 신경 과학에 사용되지만 3PM은 심부 조직 관찰을 위해 림프절, 뼈 및 종양과 같은 다른 조직에 잠재적으로 적용될 수 있습니다.

이미징 시스템이 샷 노이즈 제한에 근접하여 수행되는지 확인하는 것이 중요하며, 이는 감지 및 데이터 수집 전자 장치가 PMT 후 이미지에 무시할 수 있는 노이즈를 기여하도록 보장합니다. 검출된 광자 수의 불확실성은 근본적으로 광자 샷 노이즈에 의해 제한된다. 샷-노이즈 제한 성능은 고이득 광검출기(예를 들어, PMT)를 사용하는 전형적인 다중 광자 현미경에서 달성될 수 있다. 광자 샷 노이즈는 푸아송 통계 분포를 따르며, 여기서 분포의 표준 편차는 분포 평균의 제곱근과 같습니다. 샷 노이즈 제한 성능을 확인하려면 프로토콜 섹션의 1.14단계를 따르십시오.

_H2O에 의한 광 감쇠를 피하기 위해, 침지용으로_D2O를 사용하는 것이 특히 ~1,700nm 여기의 경우 도움이 된다. _D2O를 사용하는 경우 ~10분마다 D2O를 새로 고치거나 이미징 중에 D2O/_H2O교환을 피하기 위해대량의_D2O를사용해야 합니다. 하나는 또한 방 환경(³)으로부터_D2O를 밀봉할 수 있다. 장거리 작동 거리(WD) 대물 렌즈(예: 4mm 이상의 WD)를 이미징에 사용하는 경우, 침지 액체 두께는 2-3mm를 초과할 수 있습니다. 증가 된 두께는 ~ 1,300 nm₂₁에서도^H2O 흡수를 무시할 수 없게 만듭니다. 따라서,_D2O는 긴 WD 대물렌즈를 사용하는 경우 1,300 nm 3PM의 경우에도 필요할 수 있다.

3P 형광 강도는 초점에서의 여기 펄스 에너지의 큐브(Eq. (1))에 의존하기 때문에, 적절한 레이저 파워를 설정하는 것은 살아있는 조직에서 열적 및 비선형 손상을 피하면서 적절한 3P 형광 신호를 얻기 위해 특히 중요하다. 평균 레이저 전력은 열 손상 임계값 이하로 유지되어야 합니다. 예를 들어, 마우스 뇌에서, 열 조직 손상을 피하기 위해, 마우스 뇌 표면의 평균 전력은 1 mm 깊이에서 ~1,300 nm 여기 및 230 μm x 230 μm 21의 시야각(FOV)을 위해 ~¹⁰⁰ mW 이하로 유지되어야 한다. 마찬가지로, ~1,700nm에서의 평균 전력은 ~1mm 깊이에서 ~50mW 이하로 유지되어야 하고, FOV는 ~230μm x 230μm(미공개 데이터)로 유지되어야 한다. 또한, 여기 포화 및 잠재적 비선형 손상을 피하기 위해, 여기 펄스 에너지는 ~1,300 nm 및 ~1,700 nm 여기, 각각 30 내지 2 nJ 및 3 nJ^로 유지되어야 한다.

조직의 광 흡수 및 산란으로 인해 초점의 펄스 에너지는 1 EAL에 의해 조직 침투 후 1 / e (~ 37 %)로 감쇠됩니다. EAL은 상이한 조직 및 여기 파장에 따라, 예를 들어, 마우스 뇌의 신피질에서, EAL은 ~1,300 nm 및 ~1,700 nm에서 각각 ~300 μm 및 ~400 μm이고, 각각 ^3,29이다(도 5). 따라서, 동일한 펄스 에너지를 n개의 EAL의 깊이에서 초점(예를 들어, 1nJ/펄스)으로 유지하려면, 표면 펄스 에너지에 1nJ × en을 곱해야 ^한다. 구조적 및 기능적 역학의 빠른 이미징을 위해, 높은 반복률(1MHz 이상에서)을 갖는 여기 레이저가 높은 프레임 레이트^5,6,7,10을 달성하는 것이 바람직하다. 그러나 펄스 에너지 요구 사항 및 평균 레이저 전력 제한은 적용 가능한 반복률을 제한합니다.

예를 들어, 4 EALs에서 적당히 깊은 영역을 이미지 할 때 (즉, 1,300 nm 여기가있는 마우스 피질에서 ~ 1.2 mm), 표면에서 ~ 55 nJ / 펄스가 1 nJ / 펄스의 초점을 유지해야합니다. 평균 전력 제한이 100mW인 경우 ~2MHz 레이저 반복률을 적용할 수 있습니다. 그러나 7 EAL의 깊이에서 더 깊이 이미지화하려면 초점에서 1 nJ / 펄스를 유지하기 위해 표면에서 ~ 1,100 nJ / 펄스가 필요합니다. 열 손상을 피하기 위해 최대 평균 전력이 100mW라고 가정하면 레이저 반복률을 0.1MHz로 줄여 표면에서 1,100nJ/펄스를 달성해야 합니다. 표 1은 마우스 뇌 피질에서의 전형적인 영상화 조건을 요약한 것이다. 표 1의 이미징 깊이는 EAL이 전체 마우스 피질에서 균일하다고 가정한다.

더욱이, 심부 조직 3PM에서의 레이저 전력 제한으로 인해, 프레임 레이트와 이미지 픽셀 크기 사이에 트레이드오프가 존재하며, 이는 칼슘 이미징과 같은 기능적 이미징에 특히 중요하다. 최대 가용 레이저 반복률은 초점에서 요구되는 펄스 에너지 및 위에서 논의된 바와 같이 적용 가능한 평균 레이저 전력, 예를 들어, 1,300nm 여기와 함께 ~4 EAL에 상응하는 깊이에서 2MHz에 기초하여 각 깊이에서 결정된다. 일반적으로 이미징에는 픽셀당 적어도 하나의 펄스가 필요합니다. 따라서, 최소 이용가능한 픽셀 체류 시간은 레이저 반복률, 예를 들어, 2MHz 여기를 갖는 0.5μs/픽셀에 의해 결정된다.

3P 이미지에서 높은 공간 해상도(측면 1μm)를 유지하려면 1픽셀을 ~1μm2의 영역, 예를 들어 250 x 250μm2의 FOV의 경우 256 x²⁵⁶픽셀로 설정하는 것이^{이상적입니다.} 따라서, 상당히 큰 FOV로 빠른 이미징을 수행하기 위해(예를 들어, 250 x 250 μm2, 256 x²⁵⁶ 픽셀), 0.5 MHz, 1 MHz 및 2 MHz 펄스 반복률은 각각 ~7.6, ~15 및 ~30 프레임/s의 이론적인 최대 프레임 레이트를 제공한다. 마찬가지로, 레이저 반복률의 최적화는 목표 깊이, 스캔 속도 및 FOV에 따라 열 손상 임계값 하에서 적절한 펄스 에너지를 적용하는 데 필수적입니다. 이미징 속도를 증가시키기 위해, 적응형 여기 소스가 뉴런(³¹)에 필요에 따라 레이저 펄스를 전달함으로써 뉴런(즉, 관심 영역) 상의 모든 여기 펄스를 집중시키는데 사용될 수 있다.

3PM은 마우스 뇌의 두개골, 뼈 및 백질층(즉, 외부 캡슐)과 같은 고도로 산란된 매질을 통해 그리고 살아있는 조직 내의 심층 영상화에서 2PM과 비교할 때 유리하다. EIL이 길수록 3PE의 고차 비선형 여기가 심부 조직 이미징에 도움이됩니다. 예를 들어, 마우스 피질에서 GCaMP6을 이미지화하기 위해, 920 nm 여기를 갖는 2P 형광 신호는 690 μm에서 얕은 영역에서 1,300 nm 여기를 갖는 3P 형광 신호보다 높다(즉, 1,300 nm에서 ∼2.3 EALs)²¹. 그러나, 920 nm에 비해 1,300 nm에서 더 긴 EEL로 인해, 3PE는 ~690 μm의 깊이에서 2P 여기(2PE)보다 더 강한 형광을 제공하고 21 더 깊은^{21에서 더} 강한 형광을 제공한다. 이 깊이는 '신호 크로스오버 깊이'로 정의되며, 여기서 2PE 및 3PE의 형광 신호 강도는 동일한 반복률 및 동일한 최대 허용 평균 전력⁽²¹)과 동일하다. 신호 크로스오버 깊이는 2PE 및 3PE 및 형광단에 대한 여기 파장에 따라 달라집니다.

실제로, 920nm 여기는 더 적은 흡수로 인해 1,300nm 여기보다 더 높은 평균 레이저 파워를 허용합니다. 그러나 2PE의 평균 전력이 높을수록 신호 크로스 오버 깊이가 0.9 EALs⁴ 만 푸시됩니다. 또한, 샘플이 조밀하게 라벨링될 때, 3PE는 훨씬 더 높은 SBR의 추가적인 이점을 갖는다. 따라서 신호 크로스 오버 길이에 도달하기 전에도 3PM은 2PM보다 이미징에 더 좋을 수 있습니다. 예를 들어, ~2%의 부피 분율(즉, 라벨링 밀도)을 갖는 마우스 뇌 혈관조직을 영상화할 때, 100 mW의 여기 파워를 갖는 1,300 nm 3PM은 플루오레세인에 대해 ∼700 μm의 깊이에서 200 mW의 여기 파워로 920 nm 2PM을 능가한다.

도 3PM은 얇지만 고도로 산란되는 층을 통해 이미징할 때 여기 빔의 포인트 확산 기능을 왜곡시키고 디포커스 배경(⁴)을 생성할 수 있는 장점이 있다. 예를 들어, 마우스 뇌의 무손상 두개골을 통해, 2PM 이미지는 뇌 표면(¹³)으로부터 <100 μm의 얕은 깊이에서도 디포커스 배경을 겪는다. 유사한 디포커스 배경이 2PM에서 마우스 뇌(³²)에서 백질을 통한 1,280 nm 여기와 함께 관찰되었다. 따라서, 조직이 탁한 층을 통해 영상화되는 경우, 라벨링 밀도에 관계없이 고콘트라스트 이미징을 위해 3PM이 2PM보다 바람직하다.

우리는 최근에 비드 팬텀과 3PM의 이미징 깊이 한계가 8^EALs 33 이상임을 보여주는 이론적 분석을보고했습니다. 8 EAL은 마우스 피질에서 ~ 1,700 nm 여기가있는 ~ 3 mm와 동일합니다. 그러나 현재 사용 가능한 레이저는 마우스 뇌에서 8 EAL을 달성하기에 충분한 펄스 에너지를 가지고 있지 않습니다. 더 강한 레이저의 추가 개발은 현재 3PM의 이미징 깊이 제한을 밀어 낼 것입니다.

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
5% Povidone-iodine	Amazon	NDC 67818-155-32	Aceptical cleaning of surgical areas
70% Ethanol	Thermo Fisher Scientific	CAS 64-17-5	Aceptical cleaning of surgical areas
Agarose	Sigma	A4718-256	Preparing zebrafish chamber
Atropine	Cornell Veterinary Care
Bergamo II	Thorlabs		Multiphoton Imaging Microscope
Bupivacaine	Cornell Veterinary Care
Dexamethasone	Cornell Veterinary Care
Donut shape glass (ID4.5, OD6.5)	Potomac Photonics		Cover glass used for craniotomy
eye ointment (or topical ophthalmic ointment)	Puralube Vet Ointment	NDC 17033-211-38	Used as a lubricant to prevent irritation or to relieve dryness of the eye during surgery and anesthesia
GaAsP Amplified PMT	Thorlabs	PMT2100	PMT detector
Glucose	Cornell Veterinary Care
Glycopyrrolate	Cornell Veterinary Care
Heater (800 W)	Finnex		Aquarium heater for zebrafish water)
Isoflurane USP 250 mL	Piramal	NDC 66794-0013-25	For anesthesia of mice
Ketoprofen	Cornell Veterinary Care
Kimwipes	Kimtech		Laboratory tissue for preparing zebrafish
Nanofil syringe (10 micrometer) with 36 G needle	WPI	NANOFIL + NF36BV	Syringe and needle for injection of pancuronium bromide
Optical Adhesive	Norland	NOA 68	To stick round coverslip and donut shape glass together.
Pancuronium Bromide	Cornell Veterinary Care
Peristaltic Pump	Elemental Science	ESI MP2	Water pump for zebrafish setup
Polyethylene tubing (I.D. 0.58 mm., O.D. 0.965 mm.)	Elemental Science	MP2 pump tubing	Tubing that goes in the mouth of the zebrafish
Round Cover Slip German Glass #1.5, 5 mm	Electron Microscopy Sciences	7229605	Cover glass used for craniotomy
Spirit-NOPA	Spectra Physics		Tunable Optical Parametric Amplifier
SR400	Stanford Research Systems	SR400	Photon counter
Standard Photodiode Power Sensor	Thorlabs	S122C	Power detector
Sterilized phosphate buffered saline (PBS)	Millipore Sigma	SKU 806552-500ml	Used during mouse brain surgery
Surgical drape	Dynarex disposable towel drape	4410	For aceptical mouse surgery
Thin strip boxing wax	Corning Rubber Co., Inc.		Holding tubing in place in zebrafish chamber
ThorImage	Thorlabs		Image acquisition software
Tricaine (Ethyl-m-aminobenzoate methanesulfonate salt)	MP	103106	Zebrafish anesthesia and euthanasia
Tygon tubing (I.D. 1/16 in., O.D. 1/8 in.)	Tygon		Tubing for water flow for zebrafish preparation
VaporGuard	VetEquip	931401	For recycling isoflurane
Vetbond tissue adhesive	3M	1469SB	To glue the glass window on the mouse skull, and to glue the laboratory tissue when preparing the fish.
XLPLN25XWMP2	Olympus		Multiphoton Excitation Dedicated Objective