JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

يرتبط النضوب خارج الخلية للجلوكوز الموسوم بالفلورسنت بامتصاص الجلوكوز ويمكن استخدامه للفحص عالي الإنتاجية لامتصاص الجلوكوز في الأعضاء المستثناة ومزارع الخلايا.

Abstract

يزيد وباء السكري المستمر في جميع أنحاء العالم من الطلب على تحديد العوامل البيئية والغذائية والغدد الصماء والوراثية واللاجينية التي تؤثر على امتصاص الجلوكوز. يعد قياس التألق داخل الخلايا طريقة تستخدم على نطاق واسع لاختبار امتصاص الجلوكوز المسمى بالفلورسنت (FD-glucose) في الخلايا في المختبر ، أو لتصوير الأنسجة المستهلكة للجلوكوز في الجسم الحي. يقيم هذا الفحص امتصاص الجلوكوز في نقطة زمنية مختارة. يفترض التحليل داخل الخلايا أن عملية التمثيل الغذائي للجلوكوز FD أبطأ من استقلاب الجلوكوز الداخلي ، الذي يشارك في التفاعلات والإشارات الهدامة والمبتنائية. ومع ذلك ، فإن استقلاب الجلوكوز الديناميكي يغير أيضا آليات الامتصاص ، الأمر الذي يتطلب قياسات حركية لامتصاص الجلوكوز استجابة لعوامل مختلفة. توضح هذه المقالة طريقة لقياس استنفاد الجلوكوز FD-CELLULAR والتحقق من ارتباطها بامتصاص الجلوكوز FD-داخل الخلايا في الخلايا والأنسجة خارج الجسم الحي. قد يكون استنفاد الجلوكوز خارج الخلية قابلا للتطبيق على الدراسات الحركية عالية الإنتاجية والمعتمدة على الجرعة ، بالإضافة إلى تحديد المركبات ذات النشاط الجلايسيمي وآثارها الخاصة بالأنسجة.

Introduction

يرتفع الطلب على قياس امتصاص الجلوكوز جنبا إلى جنب مع الحاجة الماسة لمعالجة الزيادة الوبائية في العديد من الأمراض التي تعتمد على استقلاب الجلوكوز. تعتمد الآليات الكامنة وراء الأمراض الأيضية التنكسية والاضطرابات العصبية والمعرفية1 والالتهابات2 والأمراض المعدية3 والسرطان4,5 ، وكذلك الشيخوخة6 ، على استقلاب الجلوكوز للطاقة وتخزينها ، وعمليات الابتنائية ، والبروتين ، وتعديل الجينات ، والإشارات ، وتنظيم الجينات ، وتخليق الأحماض النووية وتكرارها 7,8,9 . يرتبط داء السكري (DM) ارتباطا مباشرا بخلل في تنظيم امتصاص الجلوكوز. DM هو مجموعة من الأمراض المزمنة مثل داء السكري من النوع 1 و -2 و -3 ، وسكري الحمل ، ومرض السكري عند بدء النضج لدى الشباب ، وأنواع أخرى من هذا المرض الناجم عن العوامل البيئية و / أو الوراثية. في عام 2016 ، أظهر أول تقرير عالمي لمنظمة الصحة العالمية عن مرض السكري أن عدد البالغين الذين يعيشون مع DM الأكثر انتشارا قد تضاعف أربع مرات تقريبا منذ عام 1980 إلى 422 مليون بالغ10 ، وهذا العدد من مرضى DM آخذ في الارتفاع بشكل كبير على مدى العقود القليلة الماضية. في عام 2019 وحده ، كان تقدير 1.5 مليون حالة وفاة ناتجا مباشرة عن DM10. ويرجع هذا الارتفاع الكبير إلى ارتفاع النوع 2 DM والظروف التي تقوده ، بما في ذلك زيادة الوزن والسمنة10. كشفت جائحة COVID-19 عن زيادة بمقدار الضعف في معدل الوفيات لدى المرضى الذين يعانون من DM مقارنة بعامة السكان ، مما يشير إلى الدور العميق ولكن غير المفهوم جيدا لاستقلاب الجلوكوز في الدفاع المناعي3. تتطلب الوقاية والتشخيص المبكر والعلاج من DM والسمنة والأمراض الأخرى تحسين قياسات امتصاص الجلوكوز بواسطة الأنسجة المختلفة ، وتحديد العوامل البيئية11 والغذائية 12 والغدد الصماء 13 والجينية14 والعوامل اللاجينية 15 التي تؤثر على امتصاص الجلوكوز.

في الأبحاث ، يتم قياس امتصاص الجلوكوز داخل الخلايا و / أو الأنسجة بشكل شائع بواسطة الجلوكوز المسمى بالفلورسنت (FD-glucose) في المختبر16،17،18 وفي الجسم الحي19. أصبح FD-glucose طريقة مفضلة مقارنة بالطرق الأكثر دقة باستخدام الجلوكوز 20 المسمى إشعاعيا ، وتحليل التحليل الطيفي للكتلةالتحليلي 21 ، والأيض 22 ، وطرق الرنين المغناطيسي النووي 23 ، والتصوير المقطعي بالإصدار البوزيتروني / التصوير المقطعي المحوسب (PET / CT) 5,24. على عكس امتصاص الجلوكوز FD ، قد تتضمن الطرق التحليلية التي تتطلب المزيد من المواد البيولوجية إعداد عينة متعددة الخطوات ، وأدوات باهظة الثمن ، وتحليل البيانات المعقدة. تم استخدام قياسات فعالة وغير مكلفة لامتصاص الجلوكوز FD في مزارع الخلايا في تجارب إثبات المفهوم وقد تتطلب التحقق من الصحة بطرق أخرى.

أساس تطبيق FD-glucose لدراسات امتصاص الجلوكوز هو انخفاض التمثيل الغذائي للجلوكوز FD-glucose مقارنة بالجلوكوز الداخلي25. ومع ذلك ، يتم توزيع كل من الجلوكوز الداخلي والجلوكوز FD ديناميكيا بين جميع المقصورات الخلوية للاستخدام في العمليات الابتنائية والهدامية والإشارات. يتداخل التقسيم والمعالجة المعتمدة على الوقت25 من FD-glucose مع قياسات التألق ، ويمثل العوامل المحددة الرئيسية لاستخدام هذا الفحص في تجارب الفحص عالية الإنتاجية ، والتحليل الحركي ، وزراعة الخلايا ثلاثية الأبعاد ، والثقافات المشتركة ، وتجارب إكسبورت الأنسجة. هنا ، نقدم بيانات توضح وجود علاقة عالية بين استنفاد الجلوكوز خارج الخلية من الجلوكوز FD وامتصاصه داخل الخلايا ، مما يشير إلى استنفاد الجلوكوز خارج الخلية من الجلوكوز FD كقياس بديل لامتصاص الجلوكوز داخل الخلايا. تم تطبيق قياس استنفاد الجلوكوز خارج الخلية للتحقق من صحة الاختلافات الخاصة بالأنسجة في امتصاص الجلوكوز في الفئران المعالجة بالأنسولين ودواء تجريبي18 لتوفير دليل على مبدأ هذه الطريقة.

يصف البروتوكول الحالي قياسات داخل الخلايا وخارجها (الشكل 1) لامتصاص الجلوكوز FD في خلايا 3T3-L1. تشرح أقسام البروتوكول 1-7 زراعة الخلايا ونموها لمدة 48 ساعة ؛ تجويع الخلايا ، والتحفيز ، والقياسات الأساسية خارج الخلية ؛ وقياسات ما بعد التحفيز لجلوكوز FD-الجلوكوز خارج الخلية والقياسات داخل الخلايا لجلوكوز FD والبروتين. يصف قسم البروتوكول 8 القياس خارج الجسم الحي للامتصاص خارج الخلية من الجلوكوز FD في الأنسجة التي تم تشريحها من الفئران ob / ob في وجود وغياب الأنسولين ومركب الأحماض الأمينية 2 (AAC2) الموصوف في مكان آخر18.

Protocol

تمت الموافقة على الدراسات على الحيوانات من قبل اللجنة المؤسسية لرعاية الحيوانات واستخدامها بجامعة ولاية أوهايو (OSU ، البروتوكول 2007A0262-R4).

ملاحظة: يجب أن تتم جميع الإجراءات في خزانة السلامة الأحيائية من الفئة الثانية مع تشغيل المنفاخ وإطفاء الأنوار.

1. إعداد المواد

ملاحظة: جميع المواد مدرجة في جدول المواد.

  1. إعداد الوسط 1 ، الطرد المركزي المتوسط 2 ، وحلول التخزين والعمل من الفلورسنت 2-deoxy-2-[(7-nitro-2,1,3-benzoxadiazol-4-yl) amino]-D-glucose (2-NBDG أو FD-glucose) وفقا للجدول 1 في خزانة السلامة الأحيائية من الفئة الثانية. حماية FD-glucose من الضوء طوال التجربة عن طريق إطفاء جميع الأضواء تحت غطاء المحرك.
  2. استخدم كواشف زراعة الخلايا الجاهزة للاستخدام: التربسين-EDTA ، المالحة العازلة بالفوسفات (PBS) ، ووسط النسر المعدل الخالي من الجلوكوز والخالي من الفينول الأحمر من Dulbecco (فيما يلي ، DMEM الخالي من الجلوكوز).
  3. استخدم 20 مل من المخزن المؤقت لتحليل الترسبات المناعية الإشعاعية (RIPA).
    ملاحظة: في الأقسام التالية، تتم مقارنة النضوب خارج الخلية والامتصاص داخل الخلايا لجرعات مختلفة من الجلوكوز FD-glucose في الخلايا الليفية 3T3-L1 مع وبدون تحفيز الأنسولين (الشكل 2).

2. 3T3-L1 زراعة الخلايا وصيانتها

  1. استزراع الخلايا الليفية للماوس 3T3-L1 عن طريق طلاء 1 × 106 خلايا مخففة في 20 مل من المتوسط 1 في لوحين 96 بئرا. لوحة 100 ميكرولتر من تعليق الخلايا لكل بئر ، مما يضمن الحفاظ على تجانس هذا التعليق عن طريق الخلط. تنمو الخلايا لمدة 48 ساعة في حاضنة 37 درجة مئوية (5٪ CO2 ورطوبة 95٪) دون تغيير الوسائط حتى حوالي 70٪ -80٪ التقاء.
  2. الحفاظ على الخلايا ملتقية وصائمة عن طريق زراعتها في نفس الوسط لمدة 48 ساعة. تختلف مدة الحضانة من 24-72 ساعة اعتمادا على حالة هدم الصيام المطلوبة.

3. تجويع خلايا 3T3-L1

  1. صب الوسائط من الخلايا في لوحات 96 بئر. امتص السائل المتبقي باستخدام مناشف ورقية معقمة.
  2. شطف طبق 96 بئر مع 100 ميكرولتر من PBS لكل بئر وامتصاص السائل المتبقي مع المناشف الورقية المعقمة.
  3. أضف 100 ميكرولتر من DMEM الخالي من الجلوكوز لكل بئر واحتضنه لمدة 40 دقيقة. اضبط وقت الحضانة اعتمادا على نوع الخلية والمحفزات والمستوى المطلوب من الصيام.
    ملاحظة: قد يتطلب وقت الحضانة التحسين اعتمادا على الموسم.

4. إعداد حلول الجلوكوز FD بتركيزات مختلفة

ملاحظة: تفحص التجربة في الشكل 2 الوسائط خارج الخلية وبين الخلايا مع وبدون تحفيز مع الأنسولين.

  1. استخدم ثمانية نسخ متماثلة (صف واحد في صفيحة 96 بئرا) لكل حالة تحفيز. لذلك ، قم بإعداد 1 مل لكل حالة تحفيز (محددة في الجدول 2 وأدناه).
  2. استخدم ثمانية شروط تحفيز بدون أنسولين: FD-glucose من 2.5 ميكروغرام / مل ، 1 ميكروغرام / مل ، 0.5 ميكروغرام / مل ، 0.2 ميكروغرام / مل ، 0.1 ميكروغرام / مل ، 0.1 ميكروغرام / مل ، 0.05 ميكروغرام / مل ، و 0 ميكروغرام / مل ، و 0 ميكروغرام / مل (التحكم بدون FD-glucose) في لوحة واحدة 96 بئر.
  3. استخدم ثمانية شروط تحفيز مع الأنسولين (10 ميكروغرام / مل ، التركيز النهائي): FD-glucose من 2.5 ميكروغرام / مل ، 1 ميكروغرام / مل ، 0.5 ميكروغرام / مل ، 0.2 ميكروغرام / مل ، 0.2 ميكروغرام / مل ، 0.1 ميكروغرام / مل ، 0.05 ميكروغرام / مل ، و 0 ميكروغرام / مل ، و 0 ميكروغرام / مل (التحكم بدون FD-glucose) في لوحة أخرى من 96 بئرا.
  4. لإعداد ظروف التحفيز ، قم بتخفيف 1 ميكرولتر من محلول عمل FD-glucose 5 mg / mL (الجدول 1) في 999 ميكرولتر من DMEM الخالي من الجلوكوز للحصول على 1 مل من محلول مخزون العمل (1: 1000 تخفيف أو 5 ميكروغرام / مل).
    1. باستخدام حل مخزون العمل هذا ، قم بإعداد 1:2000 و 1:5000 و 1:10,000 و 1:25,000 و 1:50,000 و 1:100,000 تخفيف من الجلوكوز FD للحصول على 2.5 ميكروغرام / مل ، و 1 ميكروغرام / مل ، و 0.5 ميكروغرام / مل ، و 0.2 ميكروغرام / مل ، و 0.1 ميكروغرام / مل ، و 0.05 ميكروغرام / مل (الجدول 2) في أنبوبين مل مباشرة قبل التجارب في خزانة السلامة الأحيائية بدون أضواء.
  5. كرر الخطوة 4.4 وأضف 1 ميكرولتر من الأنسولين (10 ملغم / مل ، التركيز النهائي) إلى كل شرط من الشروط المحددة أعلاه.
    ملاحظة: التركيز النهائي للأنسولين في هذه العينات هو 10 ميكروغرام/مل = 1.7 نانومول/مل. لتحقيق التجانس ، أضف الأنسولين إلى الأنابيب قبل إضافة حلول أخرى.

5. علاج الخلايا 3T3-L1 الجائعة

  1. بعد 40 دقيقة من الحضانة ، قم بصب DMEM الخالي من الجلوكوز من كل بئر في ألواح 96 بئرا وامتص السائل المتبقي بمناشف ورقية معقمة.
  2. أضف 100 ميكرولتر (لكل بئر) من كل من ظروف المعالجة المختلفة الموضحة أعلاه إلى الآبار على طول عمود واحد ، و 100 ميكرولتر (لكل بئر) من نفس حالة المعالجة إلى الآبار على طول الصف (ثمانية تكرارات) في كل من لوحات 96 بئرا. قم بتسمية الألواح التي استخدمت الظروف مع الأنسولين وبدونه. أضف DMEM الخالي من الجلوكوز وحده إلى آبار التحكم (n = 8).
  3. احتضن اللوحة لمدة 40 دقيقة في حاضنة زراعة الخلايا (37 درجة مئوية ، 5٪ CO2 ، و 95٪ رطوبة) في الظلام.

6. قياسات خارج الخلية وبين الخلايا لخلايا 3T3-L1 المحفزة

  1. بعد تحفيز الخلايا لمدة 40 دقيقة ، انقل وسائط التحفيز من كلا اللوحتين إلى لوحات جديدة من 96 بئرا تحافظ على نفس التخطيط التجريبي.
  2. قم بصب أي محلول متبقي من لوحات 96-well الأصلية المحفزة بخلايا على مناشف ورقية معقمة.
  3. اختياريا ، اغسل الخلايا باستخدام PBS. قم بإزالة PBS وصب أي محلول متبقي على مناشف ورقية معقمة.
  4. أضف 100 ميكرولتر من المخزن المؤقت لتحلل RIPA إلى كل بئر. اختياريا، أضف مثبط الأنزيم البروتيني إلى مخزن RIPA المخزن المؤقت لحماية البروتينات. ضع الأطباق التي تحتوي على RIPA في شاكر لمدة 30 دقيقة.
  5. باستخدام قارئ الصفائح الدقيقة (جدول المواد) ، قم بقياس التألق عند الإثارة (Ex) والأطوال الموجية للانبعاث (Em) من 485 و 535 نانومتر ، على التوالي ، أولا في الوسط الذي يحتوي على FD-glucose خارج الخلية ، ثم اللوحة ذات الخلايا التي تحلل RIPA في نهاية حضانة 30 دقيقة (انظر الخطوة 6.4).

7. التطبيع القائم على البروتين لامتصاص الجلوكوز داخل الخلايا

ملاحظة: يعتمد امتصاص الجلوكوز داخل الخلايا على رقم الخلية. تتناسب مستويات البروتين في المحللات الخلوية مع أعداد الخلايا التي تسمح بتطبيع مستويات الجلوكوز FD-glucose داخل الخلايا إلى عدد الخلايا في كل بئر.

  1. قم بإجراء فحص بروتين BCA وفقا لتعليمات الشركة المصنعة (انظر جدول المواد). حدد تركيزات البروتين في كل بئر يحتوي على خلايا RIPA-lysed.
  2. استخدم 10 ميكرولتر من متجانس RIPA وقم بقياس تركيزات البروتين في ثلاثة أضعاف لزيادة دقة القياسات في لوحات 96 بئرا.
  3. حدد كمية البروتين استنادا إلى معايير البروتين (0 و 10 و 20 و 30 و 40 و 50 و 60 ميكروغرام / مل من البروتين) التي تم تحليلها مع عينات على كل طبق من 96 بئرا.
  4. قياس الامتصاص عند 562 نانومتر وتحديد تركيزات البروتين في كل عينة بناء على صيغة الانحدار الخطي التي تم الحصول عليها لمعيار البروتين.
  5. تطبيع مستويات الجلوكوز FD-الجلوكوز داخل الخلايا باستخدام قيمة الفلورسنت / تركيز البروتين في كل بئر. استنزاف الجلوكوز FD-الجلوكوز خارج الخلية لا يتطلب التطبيع.
  6. اختياريا، استخدم متوسط قيم خط الأساس في عينات التحكم للتطبيع الإضافي (100٪).

8. القياس خارج الجسم الحي لاستنفاد الجلوكوز FD خارج الخلية في الأعضاء

  1. عالج الفئران مسبقا بمركبات تحفز استقلاب الجلوكوز قبل تشريح العضو ، على النحو التالي.
  2. استخدم الفئران الذكور Lepob البالغة من العمر تسعة أسابيع (n = 11). إطعام جميع الفئران مع اتباع نظام غذائي تشاو منتظم قبل التجربة.
  3. قم بتعيين الفئران عشوائيا إلى ثلاث مجموعات للحقن داخل الصفاق (i.p).
    1. حقن الفئران من مجموعة Lepob الضابطة مع 0.1 مل من PBS المعقمة (n = 4).
    2. حقن الفئران من مجموعة الأنسولين Lepob مع 0.1 مل من PBS المعقمة ، التي تحتوي على 12 وحدة دولية من الأنسولين البشري لكل غرام من وزن الجسم (BW) (n = 3).
    3. حقن الفئران من مجموعة AAC2 Lepob مع 0.1 مل من PBS المعقمة ، التي تحتوي على 0.1 نانومول AAC2 لكل غرام من وزن الجسم (BW) (n = 4).
  4. بعد 15 دقيقة ، تخضع الفئران لاستنشاق 5٪ من الأيزوفلوران وإخراج الدم عن طريق ثقب القلب من الحيوانات المخدرة26.
  5. تشريح الأنسجة الدهنية البيضاء الحشوية (200 ملغ) والكبد (200 ملغ) والدماغ كله من كل. استخدم غطاء أمان أحيائي من الفئة الثانية لمعالجة الأنسجة.
  6. قم بإعداد محلول عمل FD-glucose (0.29 mM) في DMEM الخالي من الجلوكوز في خزانة السلامة البيولوجية من الفئة الثانية بدون ضوء.
  7. قم بقياس تألق محلول عمل FD-glucose (0.29 mM) عند الإثارة والأطوال الموجية للانبعاثات من 485 و 535 نانومتر ، على التوالي ، باستخدام قارئ microplate.
  8. احتضان الأنسجة / الأعضاء التي تم حصادها في صفيحة من 6 آبار تحتوي على PBS لمدة 1 دقيقة. تعامل مع كل نسيج أو عضو في بئر منفصل.
  9. بعد 1 دقيقة ، ضع كل منديل على منشفة ورقية معقمة لامتصاص PBS. انقل الأنسجة / الأعضاء إلى صفيحة منفصلة من 6 آبار تحتوي على 4000 ميكرولتر من DMEM الخالي من الجلوكوز واحتضنها لمدة 2 دقيقة.
  10. بعد 2 دقيقة ، قم بإزالة الأنسجة ونقلها إلى آبار صفيحة من 6 آبار تحتوي على محلول عمل 0.29 mM FD-glucose (1 مل / بئر). احتضان لوحات 6 آبار تحتوي على أنسجة في محلول عمل FD-glucose عند 37 درجة مئوية (5٪ CO2 ورطوبة 95٪).
  11. جمع 100 ميكرولتر من محلول عمل الجلوكوز FD-glucose من كل بئر بعد 0 و 10 و 20 و 30 و 40 و 60 و 90 و 120 دقيقة من الحضانة ، لتحليل حركية استنفاد الجلوكوز FD خارج الخلية. رجه قبل وبعد التجميع.
  12. انقل 100 ميكرولتر من محلول عمل FD-glucose إلى صفائح 96 بئرا لقياس التألق عند الإثارة والأطوال الموجية للانبعاثات البالغة 485 و 535 نانومتر ، على التوالي ، باستخدام قارئ microplate.
  13. تطبيع التألق إلى قيمة 0 دقيقة (100٪) لكل عضو في كل (الشكل 3).

النتائج

تم قياس المدخول داخل الخلايا واستنفاد الجلوكوز خارج الخلية في الخلايا الدهنية 3T3-L1 ، استجابة لتركيزات مختلفة من الجلوكوز FD (الشكل 2) مع وبدون تحفيز الأنسولين. يوضح الشكل 2A زيادة تعتمد على الجرعة في امتصاص الجلوكوز داخل الخلايا ، والذي زاد بشكل كبير في وجود ا?...

Discussion

أظهرت المقارنة المباشرة لاستنفاد الجلوكوز خارج الخلية مع امتصاص الجلوكوز داخل الخلايا الطبيعي في مزرعة الخلايا وجود علاقة عالية ، مما يشير إلى أن استنفاد الجلوكوز خارج الخلية يمكن أن يكون قياسا بديلا لتقييم امتصاص الجلوكوز. يمكن أن يستخدم قياس الجلوكوز FD-glucose خارج الخلية مجموعة واسعة من ...

Disclosures

ليس لدى المؤلفين أي مشاكل للكشف عنها وليس لديهم تضارب في المصالح.

Acknowledgements

تم دعم المشروع من قبل جائزة رالف وماريان فالك لمحفز البحوث الطبية وجائزة كاثلين كيلي. وشملت الإعانات الأخرى المركز الوطني للموارد البحثية UL1RR025755 و NCI P30CA16058 (OSUCCC) ، وخارطة طريق المعاهد الوطنية للصحة للبحوث الطبية. المحتوى هو مسؤولية المؤلفين وحدهم ولا يمثل وجهات النظر الرسمية للمركز الوطني لموارد البحوث أو المعاهد الوطنية للصحة.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
3T3-L1 mouse fibroblastsATCCCL-173Cell line
96-well platesFalcon353227Plastic ware
B6.V-Lepob/J male miceJackson Laboratorystock number 000632Mice
BioTek Synergy H1 modular multimode microplate reader (Fisher Scientific, US)Fisher Scientific, US B-SHTDevice
Bovine serumGibco/ThermoFisher161790-060Cell culture
Calf serumGibco/ThermoFisher26010-066Cell culture
Cell incubatorFormaSeries II Water JacketDevice
Diet (mouse/rat diet, irradiated)EnvigoTeklad LM-485Diet
Dimethylsulfoxide (DMSO)Sigma LifeScienceD2650-100mLReagent
Dulbecco's Modified Eagle MediumGibco/ThermoFisher 11965-092Cell culture
EthanolSigma AldrichE7023-500mLReagent
Fluorescent 2-deoxy-2-[(7-nitro-2,1,3-benzoxadiazol-4-yl) amino]-D-glucose)Sigma72987-1MGAssay
Glucose-free and phenol red-free DMEMGibco/ThermoFisherA14430-01Cell culture
Human insulin 10 mg/mLMilliporeSigma, Cat N 91077CCat N 91077CReagent
Isoflurane, 5%Henry ScheinNDC 11695-6776-2Anestaetic
Penicillin/streptomycin (P/S)Gibco/ThermoFisher15140-122Cell culture
Phosphate buffered solutionSigma-AldrichDA537-500 mLCell culture
Pierce bicinchoninic acid (BCA) protein assayThermoFisherCat N23225Assay
Radioimmunoprecipitation assay lysis bufferSanta Cruz Biotechnologysc-24948Assay
Trypsin-EDTA (0.05%)Gibco/ThermoFisher 25300-054Cell culture

References

  1. Kyrtata, N., Emsley, H. C. A., Sparasci, O., Parkes, L. M., Dickie, B. R. A systematic review of glucose transport alterations in Alzheimer's disease. Frontiers in Neuroscience. 15, 568 (2021).
  2. Garcia-Carbonell, R., et al. Critical role of glucose metabolism in rheumatoid arthritis fibroblast-like synoviocytes. Arthritis Rheumatology. 68 (7), 1614-1626 (2016).
  3. Kumar, A., et al. Is diabetes mellitus associated with mortality and severity of COVID-19? A meta-analysis. Diabetes & Metabolic Syndrome: Clinical Research & Review. 14 (4), 535-545 (2020).
  4. Lee, J. H., et al. Different prognostic impact of glucose uptake in visceral adipose tissue according to sex in patients with colorectal cancer. Scientific Reports. 11 (1), 21556 (2021).
  5. Miner, M. W. G., et al. Comparison of: (2S,4R)-4-[(18)F]Fluoroglutamine, [(11)C]Methionine, and 2-Deoxy-2-[(18)F]Fluoro-D-Glucose and two small-animal PET/CT systems imaging rat gliomas. Frontiers in Oncology. 11 (18), 730358 (2021).
  6. Gumbiner, B., Thorburn, A. W., Ditzler, T. M., Bulacan, F., Henry, R. R. Role of impaired intracellular glucose metabolism in the insulin resistance of aging. Metabolism. 41 (10), 1115-1121 (1992).
  7. Ebrahimi, A. G., et al. Beta cell identity changes with mild hyperglycemia: Implications for function, growth, and vulnerability. Molecular Metabolism. 35, 100959 (2020).
  8. Ruberto, A. A., et al. KLF10 integrates circadian timing and sugar signaling to coordinate hepatic metabolism. Elife. 10, 65574 (2021).
  9. Stocks, B., Zierath, J. R. Post-translational modifications: The signals at the intersection of exercise, glucose uptake, and insulin sensitivity. Endocrinology Reviews. , (2021).
  10. World Health Organization. Global report on diabetes. World Health Organization. , (2016).
  11. Kolb, H., Martin, S. Environmental/lifestyle factors in the pathogenesis and prevention of type 2 diabetes. BMC Medicine. 15 (1), 131 (2017).
  12. Galicia-Garcia, U., et al. Pathophysiology of type 2 diabetes mellitus. International Journal of Molecular Science. 21 (17), 6275 (2020).
  13. Petrov, M. S., Basina, M. DIAGNOSIS OF ENDOCRINE DISEASE: Diagnosing and classifying diabetes in diseases of the exocrine pancreas. European Journal of Endocrinology. 184 (4), 151-163 (2021).
  14. Sirdah, M. M., Reading, N. S. Genetic predisposition in type 2 diabetes: A promising approach toward a personalized management of diabetes. Clinical Genetics. 98 (6), 525-547 (2020).
  15. Ramos-Lopez, O., Milagro, F. I., Riezu-Boj, J. I., Martinez, J. A. Epigenetic signatures underlying inflammation: an interplay of nutrition, physical activity, metabolic diseases, and environmental factors for personalized nutrition. Inflammation Research. 70 (1), 29-49 (2021).
  16. Yamamoto, N., et al. Measurement of glucose uptake in cultured cells. Current Protocols in Pharmacology. 71 (1), 12-14 (2015).
  17. Yang, L., et al. A sensitive and simple HPLC-FLD-based method for the measurement of intracellular glucose uptake. Food Chemistry. 372, 131218 (2021).
  18. Lee, A., et al. Amino acid-based compound activates atypical PKC and leptin receptor pathways to improve glycemia and anxiety like behavior in diabetic mice. Biomaterials. 239, 119839 (2020).
  19. Shukla, S. K., Mulder, S. E., Singh, P. K. Hypoxia-mediated in vivo tumor glucose uptake measurement and analysis. Methods in Molecular Biology. 1742, 107-113 (2018).
  20. Jakson, I., Ujvari, D., Brusell Gidlof, S., Linden Hirschberg, A. Insulin regulation of solute carrier family 2 member 1 (glucose transporter 1) expression and glucose uptake in decidualizing human endometrial stromal cells: an in vitro study. Reproductive Biology and Endocrinology. 18 (1), 117 (2020).
  21. Saparbaev, E., et al. Identification and quantification of any isoforms of carbohydrates by 2D UV-MS fingerprinting of cold ions. Analytical Chemistry. 92 (21), 14624-14632 (2020).
  22. Schulz, A., et al. Targeted metabolomics of pellicle and saliva in children with different caries activity. Scientific Reports. 10 (1), 697 (2020).
  23. Shulman, R. G. Nuclear magnetic resonance studies of glucose metabolism in non-insulin-dependent diabetes mellitus subjects. Molecular Medicine. 2 (5), 533-540 (1996).
  24. Cochran, B. J., et al. In vivo PET imaging with [(18)F]FDG to explain improved glucose uptake in an apolipoprotein A-I treated mouse model of diabetes. Diabetologia. 59 (18), 1977-1984 (2016).
  25. Lloyd, P. G., Hardin, C. D., Sturek, M. Examining glucose transport in single vascular smooth muscle cells with a fluorescent glucose analog. Physiological Research. 48 (6), 401-410 (1999).
  26. Beeton, C., Garcia, A., Chandy, K. G. Drawing blood from rats through the saphenous vein and by cardiac puncture. Journal of Visualized Experiments. (7), e266 (2007).
  27. DiSilvestro, D. J., et al. Leptin production by encapsulated adipocytes increases brown fat, decreases resistin, and improves glucose intolerance in obese mice. PLoS One. 11 (4), 0153198 (2016).
  28. Friedman, J. M. Leptin and the endocrine control of energy balance. Nature Metabolism. 1 (8), 754-764 (2019).
  29. Guillam, M. T., Burcelin, R., Thorens, B. Normal hepatic glucose production in the absence of GLUT2 reveals an alternative pathway for glucose release from hepatocytes. Proceedings of the National Academy of Sciences. 95 (21), 12317-12321 (1998).
  30. Guillam, M. T., et al. Early diabetes and abnormal postnatal pancreatic islet development in mice lacking Glut-2. Nature Genetics. 17 (3), 327-330 (1997).
  31. Barros, L. F., et al. Kinetic validation of 6-NBDG as a probe for the glucose transporter GLUT1 in astrocytes. Journal of Neurochemistry. 109, 94-100 (2009).
  32. Sprinz, C., et al. Effects of blood glucose level on 18F-FDG uptake for PET/CT in normal organs: A systematic review. PLoS One. 13 (2), 0193140 (2018).
  33. Johnson, T. V., Martin, K. R. Development and characterization of an adult retinal explant organotypic tissue culture system as an in vitro intraocular stem cell transplantation model. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 49 (8), 3503-3512 (2008).
  34. de Urquiza, A. M., et al. Docosahexaenoic acid, a ligand for the retinoid X receptor in mouse brain. Science. 290 (5499), 2140-2144 (2000).
  35. Olson, A. L., Pessin, J. E. Structure, function, and regulation of the mammalian facilitative glucose transporter gene family. Annual Review of Nutrition. 16 (1), 235-256 (1996).
  36. Muhanna, D., Arnipalli, S. R., Kumar, S. B., Ziouzenkova, O. Osmotic adaptation by Na(+)-dependent transporters and ACE2: correlation with hemostatic crisis in COVID-19. Biomedicines. 8 (11), 460 (2020).
  37. Ligasova, A., Koberna, K. DNA dyes-highly sensitive reporters of cell quantification: comparison with other cell quantification methods. Molecules. 26 (18), 5515 (2021).
  38. DeFronzo, R. A., Tobin, J. D., Andres, R. Glucose clamp technique: a method for quantifying insulin secretion and resistance. American Journal of Physiology. 237 (3), 214-223 (1979).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

182

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved