דלדול גלוקוז חוץ-תאי כמדד עקיף לספיגת גלוקוז בתאים וברקמות Ex Vivo

Summary

דלדול חוץ-תאי של גלוקוז המסומן באופן פלואורסצנטי מתואם עם ספיגת גלוקוז, וניתן להשתמש בו לבדיקת תפוקה גבוהה של ספיגת גלוקוז באיברים שנכרתו ובתרביות תאים.

Abstract

המגיפה העולמית המתמשכת של סוכרת מגבירה את הביקוש לזיהוי גורמים סביבתיים, תזונתיים, אנדוקריניים, גנטיים ואפיגנטיים המשפיעים על ספיגת גלוקוז. מדידת פלואורסצנציה תוך-תאית היא שיטה נפוצה לבדיקת ספיגת גלוקוז המסומן בפלואורסצנטיות (FD-glucose) בתאים במבחנה, או להדמיית רקמות הצורכות גלוקוז in vivo. מחקר זה מעריך את ספיגת הגלוקוז בנקודת זמן נבחרת. הניתוח התוך-תאי מניח כי חילוף החומרים של FD-גלוקוז איטי יותר מזה של גלוקוז אנדוגני, המשתתף בתגובות ואיתות קטבוליים ואנבוליים. עם זאת, חילוף החומרים הדינמי של הגלוקוז משנה גם את מנגנוני הספיגה, מה שידרוש מדידות קינטיות של ספיגת גלוקוז בתגובה לגורמים שונים. מאמר זה מתאר שיטה למדידת דלדול FD-גלוקוז חוץ-תאי ומאמת את המתאם שלה עם ספיגת FD-גלוקוז תוך-תאית בתאים וברקמות ex vivo. דלדול גלוקוז חוץ-תאי עשוי להיות ישים פוטנציאלית למחקרים קינטיים ותלויי מינון בתפוקה גבוהה, כמו גם לזיהוי תרכובות עם פעילות גליקמית והשפעותיהן הספציפיות לרקמות.

Introduction

הביקוש למדידת ספיגת גלוקוז עולה יחד עם הצורך הקריטי לטפל בעלייה במגפה במספר רב של מחלות התלויות בחילוף החומרים של הגלוקוז. המנגנונים הבסיסיים של מחלות מטבוליות ניווניות, הפרעות נוירולוגיות וקוגניטיביות¹, דלקת² ומחלות זיהומיות³, סרטן ^4,5, כמו גם הזדקנות⁶, תלויים בחילוף החומרים של גלוקוז לאנרגיה ולאגירתה, תהליכים אנבוליים, חלבון ושינוי גנים, איתות, ויסות גנים וסינתזה ושכפול של חומצות גרעין ^7,8,9 . סוכרת (DM) קשורה ישירות לתקלה בוויסות ספיגת הגלוקוז. DM הוא ספקטרום של מחלות כרוניות כגון סוכרת מסוג 1, -2 ו -3, סוכרת הריונית, סוכרת הריון, סוכרת בשלות של צעירים, וסוגים אחרים של מחלה זו הנגרמת על ידי גורמים סביבתיים ו / או גנטיים. בשנת 2016, הדו"ח הגלובלי הראשון של ארגון הבריאות העולמי על סוכרת הראה כי מספר המבוגרים החיים עם ה- DM הנפוץ ביותר כמעט הוכפל פי ארבעה מאז 1980 ל -422 מיליון מבוגרים¹⁰, ומספר זה של חולי DM עלה באופן אקספוננציאלי בעשורים האחרונים. בשנת 2019 לבדה, הערכה של 1.5 מיליון מקרי מוות נגרמה ישירות על ידי DM¹⁰. עלייה דרמטית זו נובעת מהעלייה ב-DM מסוג 2 ומהתנאים המניעים אותו, כולל עודף משקל והשמנת יתר¹⁰. מגפת COVID-19 חשפה עלייה של פי שניים בתמותה בקרב חולי דושן בהשוואה לאוכלוסייה הכללית, מה שמרמז על התפקיד העמוק אך הלא מובן של חילוף החומרים של גלוקוז בהגנה החיסונית³. מניעה, אבחון מוקדם וטיפול ב-DM, השמנת יתר ומחלות אחרות דורשים אופטימיזציה של מדידות של ספיגת גלוקוז על ידי רקמות שונות, וזיהוי של גורמים סביבתיים¹¹, תזונתיים¹², אנדוקריניים¹³,^{גנטיים 14}, ו-15 אפיגנטיים המשפיעים על ספיגת גלוקוז.

במחקר, ספיגה תוך-תאית ו/או רקמות של גלוקוז נמדדת בדרך כלל על-ידי גלוקוז המסומן בפלואורסצנט (FD-גלוקוז) במבחנה 16,17,18 ו-in vivo¹⁹. FD-גלוקוז הפך לשיטה מועדפת בהשוואה לשיטות מדויקות יותר באמצעות גלוקוז מסומן^{רדיואקטיבית 20}, ניתוח ספקטרוסקופיית מסה אנליטית²¹, מטבוליקה²², שיטות תהודה מגנטית גרעינית²³, וטומוגרפיה של פליטת פוזיטרונים/טומוגרפיה ממוחשבת (PET/CT)^5,24. שלא כמו ספיגת גלוקוז FD, שיטות אנליטיות הדורשות יותר חומר ביולוגי עשויות לכלול הכנת דגימה רב-שלבית, מכשירים יקרים וניתוח נתונים מורכב. מדידות יעילות וזולות של ספיגת FD-גלוקוז בתרביות תאים שימשו בניסויי הוכחת היתכנות ועשויות לדרוש אימות בשיטות אחרות.

הבסיס ליישום FD-גלוקוז למחקרי ספיגת גלוקוז הוא חילוף החומרים המופחת של FD-גלוקוז בהשוואה לגלוקוז אנדוגני²⁵. עם זאת, הן גלוקוז אנדוגני והן FD-גלוקוז מופצים באופן דינמי בין כל התאים התאיים לשימוש בתהליכים אנאבוליים, קטבוליים ואיתות. המידור והעיבוד תלוי הזמן²⁵ של FD-גלוקוז מפריעים למדידות הפלואורסצנטיות, ומייצגים את הגורמים המגבילים העיקריים לשימוש בבדיקה זו בניסויי סינון בתפוקה גבוהה, ניתוח קינטי, תרבית תאים תלת-ממדית, תרביות משותפות וניסויי הסבר רקמות. כאן אנו מספקים נתונים המדגימים מתאם גבוה בין הידלדלות החוץ-תאית של גלוקוז FD לבין ספיגתו התוך-תאית, מה שמצביע על הידלדלות חוץ-תאית של FD-גלוקוז כמדידה פונדקאית לספיגת גלוקוז תוך-תאי. המדידה של דלדול חוץ-תאי של גלוקוז יושמה כדי לאמת הבדלים ספציפיים לרקמות בספיגת הגלוקוז בעכברים שטופלו באינסולין ובתרופה ניסיונית¹⁸ כדי לספק הוכחה עקרונית לשיטה זו.

הפרוטוקול הנוכחי מתאר מדידות תוך-תאיות וחוץ-תאיות (איור 1) של ספיגת FD-גלוקוז בתאי 3T3-L1. סעיפי פרוטוקול 1-7 מסבירים את התרבית והצמיחה של תאים במשך 48 שעות; הרעבת תאים, גירוי ומדידות חוץ-תאיות בסיסיות; ומדידות לאחר גירוי של FD-גלוקוז חוץ-תאי ומדידות תוך-תאיות של FD-גלוקוז וחלבון. פרוטוקול סעיף 8 מתאר את מדידת ה-ex vivo של ספיגה חוץ-תאית של FD-גלוקוז ברקמות שנותחו מעכברי ob/ob בנוכחות והיעדר תרכובת אינסולין וחומצות אמינו 2 (AAC2) שתוארה במקום אחר¹⁸.

Protocol

מחקרים בבעלי חיים אושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים של אוניברסיטת אוהיו (OSU, פרוטוקול 2007A0262-R4).

הערה: כל ההליכים חייבים להיעשות בארון בטיחות ביולוגית מדרגה II עם המפוח דולק והאורות כבויים.

1. הכנת חומרים

הערה: כל החומרים רשומים בטבלת החומרים.

1. הכן בינוני 1, צנטריפוגה בינונית 2, ופתרונות אחסון ועבודה של פלואורסצנטי 2-דאוקסי-2-[(7-nitro-2,1,3-benzoxadiazol-4-yl) אמינו]-D-גלוקוז (2-NBDG או FD-גלוקוז) על פי טבלה 1 בארון בטיחות ביולוגית Class II. הגן על FD-גלוקוז מפני אור לאורך כל הניסוי על ידי כיבוי כל האורות מתחת למכסה המנוע.
2. השתמשו בריאגנטים מוכנים לשימוש מתרביות תאים: טריפסין-EDTA, מי מלח עם מאגר פוספט (PBS), ומדיום הנשר המהונדס של דולבקו ללא גלוקוז ופנול ללא אדום (להלן, DMEM נטול גלוקוז).
3. השתמש ב-20 מ"ל של מאגר תזה של בדיקת רדיו-אימונופרציפציה (RIPA).
   הערה: בסעיפים הבאים, דלדול חוץ-תאי וספיגה תוך-תאית של מינוני FD-גלוקוז שונים מושווים בפיברובלסטים 3T3-L1 עם ובלי גירוי אינסולין (איור 2).

2. תרבית תאים 3T3-L1 ותחזוקה

1. פיברובלסטים של עכבר 3T3-L1 בתרבית 3T3-L1 על ידי ציפוי 1 x 10⁶ תאים מדוללים ב-20 מ"ל של מדיום 1 בשתי צלחות של 96 בארות. צלחת 100 μL של תרחיף התא לכל באר, מה שמבטיח לשמור על הומוגניות של תרחיף זה על ידי ערבוב. לגדל תאים במשך 48 שעות באינקובטור של 37 מעלות צלזיוס (5% CO₂ ו-95% לחות) מבלי לשנות את המדיה עד למפגש של כ-70%-80%.
2. לשמור על תאים נפגשים וצומים על ידי התרבות שלהם באותו מדיום במשך 48 שעות. שנה את זמן הדגירה בין 24-72 שעות בהתאם למצב הקטבולי הרצוי של צום.

3. הרעבה של תאי 3T3-L1

1. דקאנט מדיה מתאים בלוחות 96 הבאר. סופגים את הנוזל הנותר באמצעות מגבות נייר סטריליות.
2. יש לשטוף את צלחת ה-96 באר עם 100 μL של PBS לבאר ולספוג את הנוזל הנותר במגבות נייר סטריליות.
3. הוסיפו 100 μL של DMEM ללא גלוקוז לבאר ודגרו למשך 40 דקות. התאם את זמן הדגירה בהתאם לסוג התא, לגירויים ולרמת הצום הרצויה.
   הערה: זמן הדגירה עשוי לדרוש אופטימיזציה בהתאם לעונה.

4. הכנת תמיסות FD-גלוקוז עם ריכוזים שונים

הערה: הניסוי באיור 2 בוחן מדיה חוץ-תאית ובין-תאית עם ובלי גירוי באמצעות אינסולין.

1. השתמש בשמונה שכפולים (שורה אחת בלוחית של 96 בארות) עבור כל מצב גירוי. לכן, הכן 1 מ"ל עבור כל תנאי גירוי (המפורטים בטבלה 2 ומטה).
2. השתמש בשמונה תנאי גירוי ללא אינסולין: FD-גלוקוז של 2.5 מיקרוגרם/מ"ל, 1 מיקרוגרם/מ"ל, 0.5 מיקרוגרם/מ"ל, 0.2 מיקרוגרם/מ"ל, 0.1 מיקרוגרם/מ"ל, 0.05 מיקרוגרם/מ"ל ו-0 מיקרוגרם/מ"ל (שליטה ללא FD-גלוקוז) בצלחת אחת של 96 בארות.
3. השתמש בשמונה תנאי גירוי עם אינסולין (10 מיקרוגרם/מ"ל, ריכוז סופי): FD-גלוקוז של 2.5 מיקרוגרם/מ"ל, 1 מיקרוגרם/מ"ל, 0.5 מיקרוגרם/מ"ל, 0.2 מיקרוגרם/מ"ל, 0.1 מיקרוגרם/מ"ל, 0.05 מיקרוגרם/מ"ל ו-0 מיקרוגרם/מ"ל (שליטה ללא FD-גלוקוז) בצלחת אחרת של 96 בארות.
4. כדי להכין תנאי גירוי, דיללו 1 μL של תמיסת עבודה של 5 מ"ג/מ"ל FD-גלוקוז (טבלה 1) ב-999 μL של DMEM ללא גלוקוז כדי לקבל 1 מ"ל של תמיסת מלאי עובד (1:1000 דילול או 5 מיקרוגרם/מ"ל).
   1. באמצעות תמיסת מלאי עבודה זו, הכינו 1:2000, 1:5000, 1:10,000, 1:25,000, 1:50,000 ו-1:100,000 דילולים של גלוקוז FD כדי להשיג 2.5 מיקרוגרם/מ"ל, 1 מיקרוגרם/מ"ל, 0.5 מיקרוגרם/מ"ל, 0.2 מיקרוגרם/מ"ל, 0.1 מיקרוגרם/מ"ל ו-0.05 מיקרוגרם/מ"ל (טבלה 2) בצינורות של 2 מ"ל מיד לפני הניסויים בארון בטיחות ביולוגית ללא אורות.
5. חזור על שלב 4.4 והוסף 1 μL של אינסולין (10 מ"ג/מ"ל, ריכוז סופי) לכל אחד מהמצבים שצוינו לעיל.
   הערה: הריכוז הסופי של אינסולין בדגימות אלה הוא 10 מיקרוגרם/מ"ל = 1.7 ננומול/מ"ל. כדי להשיג הומוגניזציה, יש להוסיף אינסולין לצינורות לפני הוספת פתרונות אחרים.

5. טיפול בתאי 3T3-L1 מורעבים

1. לאחר 40 דקות של דגירה, הוציאו את ה-DMEM נטול הגלוקוז מכל באר בצלחות של 96 באר וספגו את הנוזלים הנותרים במגבות נייר סטריליות.
2. הוסף 100 μL (לכל באר) כל אחד ממצבי הטיפול השונים שתוארו לעיל לבארות לאורך עמודה אחת, ו-100 μL (לכל באר) מאותו מצב טיפול לבארות לאורך השורה (שמונה שכפולים) בשתי צלחות 96 הבאר. סמן את הצלחות שניצלו את התנאים עם ובלי אינסולין. הוסיפו DMEM ללא גלוקוז בלבד לבארות הבקרה (n = 8).
3. דגירו את הצלחת למשך 40 דקות בחממת תרביות תאים (37 מעלות צלזיוס, 5% CO₂ ו-95% לחות) בחושך.

6. מדידות חוץ-תאיות ובין-תאיות לתאי 3T3-L1 מגורה

1. לאחר שהתאים מגורה במשך 40 דקות, העבירו את מדיית הגירוי משתי הצלחות ללוחות חדשים בני 96 בארות, תוך שמירה על אותה פריסה ניסיונית.
2. נקו כל תמיסה שנותרה מהצלחות המקוריות של 96 בארות עם תאים על מגבות נייר סטריליות.
3. לחלופין, לשטוף תאים עם PBS. יש להסיר PBS ולפרק כל תמיסה שנותרה על מגבות נייר סטריליות.
4. הוסף 100 μL של מאגר ה-RIPA lysis לכל באר. לחלופין, הוסיפו מעכב פרוטאזות למאגר RIPA כדי להגן על חלבונים. מניחים צלחות המכילות RIPA בשייקר למשך 30 דקות.
5. באמצעות קורא מיקרו-פלטות (טבלת חומרים), מודדים פלואורסצנציה באורכי גל של עירור (Ex) ופליטה (Em) של 485 ו-535 ננומטר, בהתאמה, תחילה במדיום המכיל FD-גלוקוז חוץ-תאי, ולאחר מכן, את הצלחת עם תאים עם RIPA-lysed בסוף 30 דקות דגירה (ראו שלב 6.4).

7. נורמליזציה מבוססת חלבון של ספיגת גלוקוז תוך-תאית

הערה: ספיגת FD-גלוקוז תוך-תאית תלויה במספר התא. רמות החלבון בליזאטים תאיים פרופורציונליות למספרי התאים המאפשרים לנרמל את רמות ה-FD-גלוקוז התוך-תאיות למספר התאים בכל באר.

1. בצע בדיקת חלבון BCA בהתאם להוראות היצרן (ראה טבלת חומרים). לכמת את ריכוזי החלבון בכל באר המכילה תאים עם RIPA.
2. השתמשו ב-10 μL של ההומוגנט RIPA ומדדו ריכוזי חלבונים במשולש כדי להגביר את דיוק המדידות בלוחות של 96 בארות.
3. כימות חלבון על סמך תקני חלבון (0, 10, 20, 30, 40, 50 ו-60 מיקרוגרם/מ"ל) שנותחו יחד עם דגימות על כל צלחת של 96 בארות.
4. מדוד את הספיגה ב- 562 ננומטר וכימת את ריכוזי החלבון בכל דגימה בהתבסס על נוסחת הרגרסיה הליניארית שהתקבלה עבור תקן החלבון.
5. נרמלו את רמות ה-FD-גלוקוז התוך-תאי על-ידי שימוש בערך פלואורסצנטי/ריכוז חלבון בכל באר. דלדול גלוקוז FD חוץ-תאי אינו דורש נורמליזציה.
6. לחלופין, השתמש בערכי הבסיס הממוצעים בדגימות בקרה לצורך נורמליזציה נוספת (100%).

8. מדידת Ex vivo של דלדול גלוקוז FD חוץ-תאי באיברים

1. Pretreat עכברים עם תרכובות המעוררות את חילוף החומרים של גלוקוז לפני כריתת האיברים, כדלקמן.
2. השתמש בעכברים זכרים בני תשעה שבועות של Lep^ob (n = 11). האכילו את כל העכברים בדיאטת צ'או רגילה לפני הניסוי.
3. הקצה עכברים באופן אקראי לשלוש קבוצות עבור זריקות תוך-צפקיות (כלומר).
   1. הזריקו לעכברים מקבוצת הביקורת Lep^ob עם 0.1 מ"ל של PBS סטרילי (n = 4).
   2. הזריקו לעכברים מקבוצת האינסולין Lep^ob 0.1 מ"ל של PBS סטרילי, המכיל 12 אינסולין אנושי יבעירוני לגרם של משקל גוף (BW) (n= 3).
   3. הזריקו לעכברים מקבוצת AAC2 Lep^ob עם 0.1 מ"ל של PBS סטרילי, המכיל 0.1 ננומול AAC2 לגרם של משקל גוף (BW) (n = 4).
4. לאחר 15 דקות, העמידו את העכברים בשאיפה של 5% איזופלורן והקזת דם על ידי ניקור לב מבעלי החיים המורדמים²⁶.
5. לנתח רקמת שומן לבן אפידידימלית קרבית (200 מ"ג), כבד (200 מ"ג) ומוח שלם מכל חיה. השתמש במכסה מנוע בטיחות ביולוגית Class II לטיפול ברקמות.
6. הכן FD-גלוקוז (0.29 mM) פתרון עבודה ב- DMEM ללא גלוקוז בארון בטיחות ביולוגית Class II ללא אור.
7. מדוד את הפלואורסצנציה של תמיסת עבודה FD-גלוקוז (0.29 mM) באורכי גל של עירור ופליטה של 485 ו-535 ננומטר, בהתאמה, באמצעות קורא מיקרו-פלטות.
8. דגירה של הרקמות/איברים שנקטפו בצלחת בעלת 6 בארות המכילה PBS למשך דקה אחת. טפלו בכל רקמה או איבר בבאר נפרדת.
9. לאחר דקה אחת, מניחים כל רקמה על מגבת נייר סטרילית כדי לספוג PBS. מעבירים רקמות/איברים לצלחת נפרדת של 6 בארות המכילה 4,000 μL של DMEM ללא גלוקוז ודגירה למשך 2 דקות.
10. לאחר 2 דקות, הסר והעביר את הרקמות לבארות של צלחת 6 בארות המכילה תמיסת עבודה של 0.29 mM FD-גלוקוז (1 מ"ל / באר). דגירה של 6 צלחות באר המכילות רקמות בתמיסת FD-גלוקוז בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס (5% CO₂ ו-95% לחות).
11. אסוף 100 μL של תמיסת FD-גלוקוז עובד מכל באר לאחר 0, 10, 20, 30, 40, 60, 90, ו 120 דקות של דגירה, כדי לנתח את הקינטיקה של דלדול גלוקוז FD חוץ-תאי. יש לנער לפני ואחרי האיסוף.
12. העברת 100 μL של תמיסת עבודה FD-גלוקוז לתוך לוחות 96 באר כדי למדוד את הפלואורסצנציה באורכי גל של עירור ופליטה של 485 ו-535 ננומטר, בהתאמה, באמצעות קורא מיקרו-לוחיות.
13. נרמלו את הפלואורסצנציה לערך של 0 דקות (100%) עבור כל איבר בכל חיה (איור 3).

תוצאות

הצריכה התוך-תאית ודלדול הגלוקוז החוץ-תאי נמדדו בפראדיפוציטים של 3T3-L1, בתגובה לריכוזים שונים של FD-גלוקוז (איור 2) עם ובלי גירוי אינסולין. איור 2A מדגים עלייה תלוית מינון בספיגה התוך-תאית של FD-גלוקוז, שהייתה מוגברת באופן משמעותי בנוכחות אינסולין. הירידה המקבילה ...

Discussion

ההשוואה הישירה של דלדול FD-גלוקוז חוץ-תאי עם ספיגת גלוקוז תוך-תאית מנורמלת בתרבית תאים הראתה מתאם גבוה, מה שמרמז על כך שהתרוקנות גלוקוז חוץ-תאית עשויה להיות מדידה פונדקאית להערכת ספיגת גלוקוז. המדידה של FD-גלוקוז חוץ-תאי יכולה להשתמש במגוון רחב של ריכוזי גלוקוז FD, וגם 0.5-2.5 מיקרוגרם FD-גלוקוז/מ"...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
3T3-L1 mouse fibroblasts	ATCC	CL-173	Cell line
96-well plates	Falcon	353227	Plastic ware
B6.V-Lepob/J male mice	Jackson Laboratory	stock number 000632	Mice
BioTek Synergy H1 modular multimode microplate reader (Fisher Scientific, US)	Fisher Scientific, US	B-SHT	Device
Bovine serum	Gibco/ThermoFisher	161790-060	Cell culture
Calf serum	Gibco/ThermoFisher	26010-066	Cell culture
Cell incubator	Forma	Series II Water Jacket	Device
Diet (mouse/rat diet, irradiated)	Envigo	Teklad LM-485	Diet
Dimethylsulfoxide (DMSO)	Sigma LifeScience	D2650-100mL	Reagent
Dulbecco's Modified Eagle Medium	Gibco/ThermoFisher	11965-092	Cell culture
Ethanol	Sigma Aldrich	E7023-500mL	Reagent
Fluorescent 2-deoxy-2-[(7-nitro-2,1,3-benzoxadiazol-4-yl) amino]-D-glucose)	Sigma	72987-1MG	Assay
Glucose-free and phenol red-free DMEM	Gibco/ThermoFisher	A14430-01	Cell culture
Human insulin 10 mg/mL	MilliporeSigma, Cat N 91077C	Cat N 91077C	Reagent
Isoflurane, 5%	Henry Schein	NDC 11695-6776-2	Anestaetic
Penicillin/streptomycin (P/S)	Gibco/ThermoFisher	15140-122	Cell culture
Phosphate buffered solution	Sigma-Aldrich	DA537-500 mL	Cell culture
Pierce bicinchoninic acid (BCA) protein assay	ThermoFisher	Cat N23225	Assay
Radioimmunoprecipitation assay lysis buffer	Santa Cruz Biotechnology	sc-24948	Assay
Trypsin-EDTA (0.05%)	Gibco/ThermoFisher	25300-054	Cell culture