El agotamiento extracelular de glucosa como medida indirecta de la absorción de glucosa en células y tejidos ex vivo

Resumen

El agotamiento extracelular de la glucosa marcada fluorescentemente se correlaciona con la absorción de glucosa y podría usarse para la detección de alto rendimiento de la absorción de glucosa en órganos extirpados y cultivos celulares.

Resumen

La epidemia mundial de diabetes en curso aumenta la demanda de identificación de factores ambientales, nutricionales, endocrinos, genéticos y epigenéticos que afectan la absorción de glucosa. La medición de la fluorescencia intracelular es un método ampliamente utilizado para probar la absorción de glucosa marcada fluorescentemente (FD-glucosa) en células in vitro, o para obtener imágenes de tejidos que consumen glucosa in vivo. Este ensayo evalúa la absorción de glucosa en un punto de tiempo elegido. El análisis intracelular asume que el metabolismo de la glucosa DF es más lento que el de la glucosa endógena, que participa en las reacciones catabólicas y anabólicas y en la señalización. Sin embargo, el metabolismo dinámico de la glucosa también altera los mecanismos de absorción, lo que requeriría mediciones cinéticas de la absorción de glucosa en respuesta a diferentes factores. Este artículo describe un método para medir el agotamiento extracelular de la DF-glucosa y valida su correlación con la absorción intracelular de FD-glucosa en células y tejidos ex vivo. El agotamiento extracelular de la glucosa puede ser potencialmente aplicable para estudios cinéticos y dependientes de la dosis de alto rendimiento, así como para identificar compuestos con actividad glucémica y sus efectos específicos del tejido.

Introducción

La demanda para medir la absorción de glucosa aumenta junto con la necesidad crítica de abordar un aumento epidémico en una multitud de enfermedades dependientes del metabolismo de la glucosa. Los mecanismos subyacentes de las enfermedades metabólicas degenerativas, los trastornos neurológicos y cognitivos¹, las enfermedades inflamatorias² e infecciosas³, el cáncer ^4,5, así como el envejecimiento⁶, dependen del metabolismo de la glucosa para obtener energía y su almacenamiento, los procesos anabólicos, la modificación de proteínas y genes, la señalización, la regulación de genes y la síntesis y replicación de ácidos nucleicos ^7,8,9 . La diabetes mellitus (DM) está directamente relacionada con el mal funcionamiento de la regulación de la absorción de glucosa. La DM es un espectro de enfermedades crónicas como la diabetes mellitus tipo 1, -2 y -3, la diabetes gestacional, la diabetes de inicio en la madurez de los jóvenes y otros tipos de esta enfermedad inducida por factores ambientales y / o genéticos. En 2016, el primer informe mundial de la OMS sobre la diabetes demostró que el número de adultos que viven con la DM más extendida casi se ha cuadruplicado desde 1980 a 422 millones de adultos¹⁰, y este número de pacientes con DM ha aumentado exponencialmente durante las últimas décadas. Solo en 2019, una estimación de 1,5 millones de muertes fue causada directamente por DM¹⁰. Este aumento dramático se debe al aumento de la DM tipo 2 y las condiciones que la impulsan, incluido el sobrepeso y la obesidad¹⁰. La pandemia de COVID-19 reveló un aumento de dos veces en la mortalidad en pacientes con DM en comparación con la población general, lo que sugiere el papel profundo pero poco conocido del metabolismo de la glucosa en la defensa inmune³. La prevención, el diagnóstico temprano y el tratamiento de la DM, la obesidad y otras enfermedades requieren la optimización de las mediciones de la absorción de glucosa por diferentes tejidos y la identificación de los factores ambientales¹¹,^{nutricionales 12}, endocrinos 13,^{genéticos 14} y epigenéticos¹⁵ que afectan la absorción de glucosa.

En la investigación, la absorción intracelular y/o tisular de glucosa se mide comúnmente mediante glucosa marcada fluorescentemente (FD-glucosa) in vitro 16,17,18 e in vivo¹⁹. La glucosa FD se convirtió en un método preferido en comparación con los métodos más precisos que utilizan glucosa²⁰ marcada radiactivamente, análisis analítico de espectroscopia^{de masas 21}, metabolómica²², métodos de resonancia magnética nuclear²³ y tomografía por emisión de positrones/tomografía computarizada (PET/CT)^5,24. A diferencia de la absorción de glucosa FD, los métodos analíticos que requieren más material biológico pueden implicar una preparación de muestras de varios pasos, instrumentos costosos y análisis de datos complejos. Las mediciones efectivas y económicas de la absorción de glucosa FD en cultivos celulares se han utilizado en experimentos de prueba de concepto y pueden requerir la validación por otros métodos.

La base de la aplicación de DF-glucosa para los estudios de captación de glucosa es la reducción del metabolismo de la glucosa-DF en comparación con la glucosa endógena²⁵. Sin embargo, tanto la glucosa endógena como la glucosa FD se distribuyen dinámicamente entre todos los compartimentos celulares para su uso en procesos anabólicos, catabólicos y de señalización. La compartimentación y el procesamiento dependiente del tiempo²⁵ de la glucosa FD interfieren con las mediciones de fluorescencia y representan los principales factores limitantes para el uso de este ensayo en experimentos de detección de alto rendimiento, análisis cinético, cultivo celular 3D, cocultivos y experimentos de explante de tejidos. Aquí, proporcionamos datos que demuestran una alta correlación entre el agotamiento extracelular de la glucosa FD y su absorción intracelular, lo que sugiere el agotamiento extracelular de la glucosa FD como una medida sustituta para la absorción de glucosa intracelular. La medición del agotamiento extracelular de la glucosa se aplicó para validar las diferencias específicas del tejido en la absorción de glucosa en ratones tratados con insulina y un fármaco experimental¹⁸ para proporcionar una prueba de principio de este método.

El protocolo actual describe mediciones intracelulares y extracelulares (Figura 1) de la absorción de glucosa FD en células 3T3-L1. Las secciones 1-7 del protocolo explican el cultivo y el crecimiento de las células durante 48 h; inanición celular, estimulación y mediciones extracelulares basales; y mediciones posteriores a la estimulación de la FD-glucosa extracelular y mediciones intracelulares de la FD-glucosa y la proteína. La sección 8 del protocolo describe la medición ex vivo de la captación extracelular de FD-glucosa en tejidos diseccionados de ratones ob/ob en presencia y ausencia de insulina y compuesto de aminoácidos 2 (AAC2) descrita en otra parte¹⁸.

Protocolo

Los estudios en animales fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad Estatal de Ohio (OSU, protocolo 2007A0262-R4).

NOTA: Todos los procedimientos deben realizarse en un gabinete de bioseguridad de clase II con el soplador encendido y las luces apagadas.

1. Preparación de materiales

NOTA: Todos los materiales se enumeran en la Tabla de materiales.

1. Preparar el Medio 1, el Medio de centrifugación 2 y las soluciones de almacenamiento y trabajo de 2-desoxi-2-[(7-nitro-2,1,3-benzoxadiazol-4-il) amino]-D-glucosa (2-NBDG o FD-glucosa) según la Tabla 1 en un gabinete de bioseguridad de Clase II. Proteja la FD-glucosa de la luz durante todo el experimento apagando todas las luces debajo del capó.
2. Use reactivos de cultivo celular listos para usar: Tripsina-EDTA, solución salina tamponada con fosfato (PBS) y Medio Águila Modificada de Dulbecco libre de glucosa y fenol sin rojo (en adelante, DMEM sin glucosa).
3. Utilice 20 ml de tampón de lisis de ensayo de radioinmunoprecipitación (RIPA).
   NOTA: En las siguientes secciones, se compara el agotamiento extracelular y la absorción intracelular de diferentes dosis de FD-glucosa en fibroblastos 3T3-L1 con y sin estimulación con insulina (Figura 2).

2. Cultivo y mantenimiento celular 3T3-L1

1. Cultivo de fibroblastos de ratón 3T3-L1 mediante el recubrimiento de 1 x 10⁶ células diluidas en 20 mL de Medio 1 en dos placas de 96 pocillos. Placa 100 μL de suspensión celular por pocillo, asegurando mantener la homogeneidad de esta suspensión mediante mezcla. Cultivar células durante 48 h en una incubadora de 37 °C (5% de CO₂ y 95% de humedad) sin cambiar de medio hasta aproximadamente un 70%-80% de confluencia.
2. Mantener las células confluentes y en ayunas cultivándolas en el mismo medio durante 48 h. Variar el tiempo de incubación de 24-72 h dependiendo del estado catabólico de ayuno deseado.

3. Inanición de células 3T3-L1

1. Medios de decantación de las células en las placas de 96 pocillos. Absorba el líquido restante con toallas de papel estériles.
2. Enjuague la placa de 96 pocillos con 100 μL de PBS por pozo y absorba el líquido restante con toallas de papel estériles.
3. Añadir 100 μL de DMEM libre de glucosa por pocillo e incubar durante 40 min. Ajuste el tiempo de incubación según el tipo de célula, los estímulos y el nivel deseado de ayuno.
   NOTA: El tiempo de incubación puede requerir optimización dependiendo de la temporada.

4. Preparación de soluciones de FD-glucosa con diferentes concentraciones

NOTA: El experimento de la Figura 2 examina los medios extracelulares e intercelulares con y sin estimulación con insulina.

1. Use ocho réplicas (una fila en una placa de 96 pocillos) para cada condición de estimulación. Por lo tanto, prepare 1 ml para cada condición de estimulación (especificada en la Tabla 2 y más abajo).
2. Use ocho condiciones de estimulación sin insulina: FD-glucosa de 2.5 μg/mL, 1 μg/mL, 0.5 μg/mL, 0.2 μg/mL, 0.1 μg/mL, 0.05 μg/mL y 0 μg/mL (control sin FD-glucosa) en una placa de 96 pocillos.
3. Utilice ocho condiciones de estimulación con insulina (10 μg/mL, concentración final): FD-glucosa de 2,5 μg/mL, 1 μg/mL, 0,5 μg/mL, 0,2 μg/mL, 0,1 μg/mL, 0,05 μg/mL y 0 μg/mL (control sin FD-glucosa) en otra placa de 96 pocillos.
4. Para preparar las condiciones de estimulación, diluya 1 μL de solución de trabajo de 5 mg/ml de FD-glucosa (Tabla 1) en 999 μL de DMEM libre de glucosa para obtener 1 ml de solución de material de trabajo (dilución de 1:1000 o 5 μg/ml).
   1. Con esta solución de material de trabajo, prepare diluciones de FD-glucosa 1:2000, 1:5000, 1:10.000, 1:25.000, 1:50.000 y 1:100.000 para obtener 2,5 μg/mL, 1 μg/mL, 0,5 μg/mL, 0,2 μg/mL, 0,1 μg/mL y 0,05 μg/mL (Tabla 2) en tubos de 2 mL inmediatamente antes de los experimentos en un gabinete de bioseguridad sin luces.
5. Repita el paso 4.4 y agregue 1 μL de insulina (10 mg/ml, concentración final) a cada una de las condiciones especificadas anteriormente.
   NOTA: La concentración final de insulina en estas muestras es de 10 μg/mL = 1,7 nmol/mL. Para lograr la homogeneización, agregue insulina a los tubos antes de agregar otras soluciones.

5. Tratamiento de células 3T3-L1 hambrientas

1. Después de 40 min de incubación, decantar el DMEM libre de glucosa de cada pozo en placas de 96 pocillos y absorber el líquido restante con toallas de papel estériles.
2. Agregue 100 μL (por pozo) cada uno de las diversas condiciones de tratamiento descritas anteriormente a los pozos a lo largo de una columna, y 100 μL (por pozo) de la misma condición de tratamiento a los pozos a lo largo de la fila (ocho réplicas) en ambas placas de 96 pocillos. Etiquete las placas que utilizaron las condiciones con y sin insulina. Agregue DMEM libre de glucosa solo a los pocillos de control (n = 8).
3. Incubar la placa durante 40 min en una incubadora de cultivo celular (37 °C, 5% de CO₂ y 95% de humedad) en la oscuridad.

6. Mediciones extracelulares e intercelulares para células 3T3-L1 estimuladas

1. Después de que las células hayan sido estimuladas durante 40 minutos, transfiera los medios de estimulación de ambas placas a nuevas placas de 96 pocillos manteniendo el mismo diseño experimental.
2. Decantar cualquier solución restante de las placas originales estimuladas de 96 pocillos con células en toallas de papel estériles.
3. Opcionalmente, lave las células con PBS. Retire el PBS y decante cualquier solución restante en toallas de papel estériles.
4. Añadir 100 μL del tampón de lisis RIPA a cada pocillo. Opcionalmente, agregue el inhibidor de la proteasa al tampón RIPA para proteger las proteínas. Coloque las placas que contienen RIPA en un agitador durante 30 min.
5. Utilizando un lector de microplacas (Tabla de Materiales), mida la fluorescencia en longitudes de onda de excitación (Ex) y emisión (Em) de 485 y 535 nm, respectivamente, primero en el medio que contiene FD-glucosa extracelular, y luego, la placa con células lisadas con RIPA al final de la incubación de 30 minutos (ver paso 6.4).

7. Normalización basada en proteínas de la absorción intracelular de glucosa

NOTA: La absorción intracelular de FD-glucosa depende del número de células. Los niveles de proteínas en los lisados celulares son proporcionales a los números celulares que permiten normalizar los niveles intracelulares de FD-glucosa al número de células en cada pozo.

1. Realice el ensayo de proteína BCA de acuerdo con las instrucciones del fabricante (consulte la Tabla de materiales). Cuantificar las concentraciones de proteínas en cada pocillo que contenga células lisadas con RIPA.
2. Utilice 10 μL del homogeneizado RIPA y mida las concentraciones de proteínas por triplicado para aumentar la precisión de las mediciones en placas de 96 pocillos.
3. Cuantificar la proteína en función de los estándares de proteínas (proteína 0, 10, 20, 30, 40, 50 y 60 μg/ml) analizadas junto con muestras en cada placa de 96 pocillos.
4. Medir la absorbancia a 562 nm y cuantificar las concentraciones de proteínas en cada muestra en función de la fórmula de regresión lineal obtenida para el estándar de proteínas.
5. Normalizar los niveles de FD-glucosa intracelular mediante el uso de valor fluorescente/concentración de proteínas en cada pocillo. El agotamiento extracelular de la DF-glucosa no requiere normalización.
6. Opcionalmente, utilice los valores basales medios en muestras de control para una normalización adicional (100%).

8. Medición ex vivo del agotamiento extracelular de la glucosa FD en órganos

1. Pretratar ratones con compuestos que estimulen el metabolismo de la glucosa antes de la disección de órganos, de la siguiente manera.
2. Use ratones machos Lep^ob de nueve semanas de edad (n = 11). Alimente a todos los ratones con una dieta regular de chow antes del experimento.
3. Asigne ratones al azar en tres grupos para inyecciones intraperitoneales (i.p.).
   1. Inyectar ratones del grupo control Lep^ob con 0,1 ml de PBS estéril (n = 4).
   2. Inyectar ratones del grupo de insulina Lep^ob con 0,1 ml de PBS estéril, que contiene 12 UI de insulina humana por gramo de peso corporal (BW) (n = 3).
   3. Inyectar ratones del grupo AAC2 Lep^ob con 0,1 ml de PBS estéril, que contenga 0,1 nmol AAC2 por gramo de peso corporal (BW) (n = 4).
4. Después de 15 min, someter a los ratones a la inhalación de isoflurano al 5% y sangre exsanguinada por punción cardíaca de los animales anestesiados²⁶.
5. Diseccionar el tejido adiposo blanco epididemal visceral (200 mg), el hígado (200 mg) y todo el cerebro de cada animal. Utilice una campana de bioseguridad de Clase II para el manejo de tejidos.
6. Preparar la solución de trabajo de FD-glucosa (0,29 mM) en DMEM libre de glucosa en un gabinete de Bioseguridad Clase II sin luz.
7. Mida la fluorescencia de la solución de trabajo de FD-glucosa (0,29 mM) a longitudes de onda de excitación y emisión de 485 y 535 nm, respectivamente, utilizando un lector de microplacas.
8. Incubar los tejidos/órganos cosechados en una placa de 6 pocillos que contenga PBS durante 1 min. Maneje cada tejido u órgano en un pozo separado.
9. Después de 1 min, coloque cada pañuelo en una toalla de papel estéril para absorber PBS. Transfiera tejidos/órganos a una placa separada de 6 pocillos que contenga 4.000 μL de DMEM libre de glucosa e incube durante 2 min.
10. Después de 2 min, retire y transfiera los tejidos a los pocillos de una placa de 6 pocillos que contenga 0,29 mM de solución de trabajo de FD-glucosa (1 ml/pomo). Incubar las placas de 6 pocillos que contienen tejidos en solución de trabajo de glucosa FD a 37 °C (5% de CO₂ y 95% de humedad).
11. Recolectar 100 μL de solución de trabajo de glucosa FD de cada pozo después de 0, 10, 20, 30, 40, 60, 90 y 120 min de incubación, para analizar la cinética del agotamiento extracelular de la glucosa FD. Agitar antes y después de la recolección.
12. Transfiera 100 μL de solución de trabajo de glucosa FD a placas de 96 pocillos para medir la fluorescencia en longitudes de onda de excitación y emisión de 485 y 535 nm, respectivamente, utilizando un lector de microplacas.
13. Normalizar la fluorescencia al valor de 0 min (100%) para cada órgano en cada animal (Figura 3).

Resultados

La ingesta intracelular y el agotamiento extracelular de glucosa se midieron en preadipocitos 3T3-L1, en respuesta a diferentes concentraciones de DF-glucosa (Figura 2) con y sin estimulación con insulina. La Figura 2A demuestra un aumento dependiente de la dosis en la absorción intracelular de FD-glucosa, que aumentó significativamente en presencia de insulina. La disminución concomitante de la glucosa FD extracelular en las mismas células se muestra en la...

Discusión

La comparación directa del agotamiento extracelular de la glucosa FD con la absorción normalizada de glucosa intracelular en el cultivo celular mostró una alta correlación, lo que sugiere que el agotamiento extracelular de la glucosa podría ser una medida sustituta para la evaluación de la absorción de glucosa. La medición de la glucosa FD extracelular puede utilizar una amplia gama de concentraciones de glucosa FD, también 0.5-2.5 μg FD-glucosa / ml parecen proporcionar el rango óptimo. La FD-glucosa extracel...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
3T3-L1 mouse fibroblasts	ATCC	CL-173	Cell line
96-well plates	Falcon	353227	Plastic ware
B6.V-Lepob/J male mice	Jackson Laboratory	stock number 000632	Mice
BioTek Synergy H1 modular multimode microplate reader (Fisher Scientific, US)	Fisher Scientific, US	B-SHT	Device
Bovine serum	Gibco/ThermoFisher	161790-060	Cell culture
Calf serum	Gibco/ThermoFisher	26010-066	Cell culture
Cell incubator	Forma	Series II Water Jacket	Device
Diet (mouse/rat diet, irradiated)	Envigo	Teklad LM-485	Diet
Dimethylsulfoxide (DMSO)	Sigma LifeScience	D2650-100mL	Reagent
Dulbecco's Modified Eagle Medium	Gibco/ThermoFisher	11965-092	Cell culture
Ethanol	Sigma Aldrich	E7023-500mL	Reagent
Fluorescent 2-deoxy-2-[(7-nitro-2,1,3-benzoxadiazol-4-yl) amino]-D-glucose)	Sigma	72987-1MG	Assay
Glucose-free and phenol red-free DMEM	Gibco/ThermoFisher	A14430-01	Cell culture
Human insulin 10 mg/mL	MilliporeSigma, Cat N 91077C	Cat N 91077C	Reagent
Isoflurane, 5%	Henry Schein	NDC 11695-6776-2	Anestaetic
Penicillin/streptomycin (P/S)	Gibco/ThermoFisher	15140-122	Cell culture
Phosphate buffered solution	Sigma-Aldrich	DA537-500 mL	Cell culture
Pierce bicinchoninic acid (BCA) protein assay	ThermoFisher	Cat N23225	Assay
Radioimmunoprecipitation assay lysis buffer	Santa Cruz Biotechnology	sc-24948	Assay
Trypsin-EDTA (0.05%)	Gibco/ThermoFisher	25300-054	Cell culture