Deplezione extracellulare di glucosio come misura indiretta dell'assorbimento di glucosio nelle cellule e nei tessuti Ex Vivo

Riepilogo

L'esaurimento extracellulare del glucosio marcato fluorescentemente è correlato all'assorbimento del glucosio e potrebbe essere utilizzato per lo screening ad alto rendimento dell'assorbimento del glucosio negli organi asportati e nelle colture cellulari.

Abstract

L'epidemia mondiale in corso di diabete aumenta la domanda per l'identificazione di fattori ambientali, nutrizionali, endocrini, genetici ed epigenetici che influenzano l'assorbimento del glucosio. La misurazione della fluorescenza intracellulare è un metodo ampiamente utilizzato per testare l'assorbimento di glucosio marcato fluorescentemente (FD-glucosio) nelle cellule in vitro o per l'imaging di tessuti che consumano glucosio in vivo. Questo test valuta l'assorbimento del glucosio in un punto temporale scelto. L'analisi intracellulare presuppone che il metabolismo del glucosio FD sia più lento di quello del glucosio endogeno, che partecipa alle reazioni cataboliche e anaboliche e alla segnalazione. Tuttavia, il metabolismo dinamico del glucosio altera anche i meccanismi di assorbimento, che richiederebbero misurazioni cinetiche dell'assorbimento del glucosio in risposta a diversi fattori. Questo articolo descrive un metodo per misurare l'esaurimento extracellulare di FD-glucosio e convalida la sua correlazione con l'assorbimento intracellulare di FD-glucosio in cellule e tessuti ex vivo. La deplezione extracellulare del glucosio può essere potenzialmente applicabile per studi cinetici e dose-dipendenti ad alto rendimento, nonché per l'identificazione di composti con attività glicemica e dei loro effetti specifici per i tessuti.

Introduzione

La domanda di misurazione dell'assorbimento di glucosio aumenta insieme alla necessità critica di affrontare un aumento epidemico di una moltitudine di malattie dipendenti dal metabolismo del glucosio. I meccanismi alla base delle malattie metaboliche degenerative, dei disturbi neurologici e cognitivi¹, delle malattie infiammatorie² e infettive³, del cancro ^4,5, così come dell'invecchiamento⁶, dipendono dal metabolismo del glucosio per l'energia e il suo stoccaggio, i processi anabolici, le proteine e la modificazione genica, la segnalazione, la regolazione dei geni e la sintesi e la replicazione degli acidi nucleici ^7,8,9 . Il diabete mellito (DM) è direttamente correlato al malfunzionamento della regolazione dell'assorbimento del glucosio. La DM è uno spettro di malattie croniche come il diabete mellito di tipo 1, -2 e -3, il diabete gestazionale, il diabete ad esordio maturo dei giovani e altri tipi di questa malattia indotti da fattori ambientali e / o genetici. Nel 2016, il primo rapporto globale dell'OMS sul diabete ha dimostrato che il numero di adulti che vivono con il DM più diffuso è quasi quadruplicato dal 1980 a 422 milioni di adulti¹⁰, e questo numero di pazienti DM è aumentato esponenzialmente negli ultimi decenni. Solo nel 2019, una stima di 1,5 milioni di morti è stata causata direttamente da¹⁰ DM. Questo drammatico aumento è dovuto all'aumento del DM di tipo 2 e alle condizioni che lo guidano, tra cui sovrappeso e obesità¹⁰. La pandemia di COVID-19 ha rivelato un aumento di due volte della mortalità nei pazienti con DM rispetto alla popolazione generale, suggerendo il ruolo profondo ma poco compreso del metabolismo del glucosio nella difesa immunitaria³. La prevenzione, la diagnosi precoce e il trattamento del DM, dell'obesità e di altre malattie richiedono l'ottimizzazione delle misurazioni dell'assorbimento del glucosio da parte di diversi tessuti e l'identificazione dei fattori ambientali¹¹, nutrizionali¹², endocrini¹³,^{genetici 14} ed epigenetici¹⁵ che influenzano l'assorbimento del glucosio.

Nella ricerca, l'assorbimento intracellulare e/o tissutale di glucosio è comunemente misurato da glucosio marcato fluorescentemente (FD-glucosio) in vitro 16,17,18 e in vivo¹⁹. Fd-glucosio è diventato un metodo preferito rispetto a metodi più precisi che utilizzano glucosio²⁰ marcato radioattivamente, analisi analitica di spettroscopia^{di massa 21}, metabolomica²², metodi di risonanza magnetica nucleare²³ e tomografia ad emissione di positroni / tomografia computerizzata (PET / CT) ^5,24. A differenza dell'assorbimento di FD-glucosio, i metodi analitici che richiedono più materiale biologico possono comportare una preparazione del campione in più fasi, strumenti costosi e analisi di dati complessi. Misurazioni efficaci e poco costose dell'assorbimento di glucosio FD in colture cellulari sono state utilizzate in esperimenti proof-of-concept e potrebbero richiedere la convalida con altri metodi.

La base dell'applicazione di FD-glucosio per gli studi sull'assorbimento del glucosio è il ridotto metabolismo del glucosio FD rispetto al glucosio endogeno²⁵. Tuttavia, sia il glucosio endogeno che il glucosio FD sono distribuiti dinamicamente tra tutti i compartimenti cellulari per l'uso nei processi anabolici, catabolici e di segnalazione. La compartimentazione e l'elaborazione dipendente dal tempo²⁵ del glucosio FD interferiscono con le misurazioni di fluorescenza e rappresentano i principali fattori limitanti per l'uso di questo test in esperimenti di screening ad alto rendimento, analisi cinetica, coltura cellulare 3D, co-colture ed esperimenti di espianto tissutale. Qui, forniamo dati che dimostrano un'alta correlazione tra l'esaurimento extracellulare di FD-glucosio e il suo assorbimento intracellulare, suggerendo l'esaurimento extracellulare di FD-glucosio come misura surrogata per l'assorbimento intracellulare di glucosio. La misurazione della deplezione extracellulare del glucosio è stata applicata per convalidare le differenze tessuto-specifiche nell'assorbimento del glucosio nei topi trattati con insulina e un farmaco sperimentale¹⁸ per fornire una prova di principio di questo metodo.

L'attuale protocollo descrive le misurazioni intracellulari ed extracellulari (Figura 1) dell'assorbimento di FD-glucosio nelle cellule 3T3-L1. Le sezioni del protocollo 1-7 spiegano la coltura e la crescita delle cellule per 48 ore; fame cellulare, stimolazione e misurazioni extracellulari di base; e misure post-stimolazione di FD-glucosio extracellulare e misurazioni intracellulari di FD-glucosio e proteine. La sezione 8 del protocollo descrive la misurazione ex vivo dell'assorbimento extracellulare di FD-glucosio in tessuti sezionati da topi ob/ob in presenza e assenza di insulina e composto di aminoacidi 2 (AAC2) descritti altrove¹⁸.

Protocollo

Gli studi sugli animali sono stati approvati dall'Institutional Animal Care and Use Committee della Ohio State University (OSU, protocollo 2007A0262-R4).

NOTA: Tutte le procedure devono essere eseguite in un armadio di biosicurezza di classe II con il ventilatore acceso e le luci spente.

1. Preparazione dei materiali

NOTA: Tutti i materiali sono elencati nella Tabella dei materiali.

1. Preparare il mezzo 1, il mezzo di centrifugazione 2 e le soluzioni di stoccaggio e di lavoro fluorescenti 2-deossi-2-[(7-nitro-2,1,3-benzossadiazol-4-il) ammino]-D-glucosio (2-NBDG o FD-glucosio) secondo la Tabella 1 in un armadio di biosicurezza di Classe II. Proteggi fd-glucosio dalla luce durante l'esperimento spegnendo tutte le luci sotto il cofano.
2. Utilizzare reagenti di coltura cellulare pronti all'uso: Tripsina-EDTA, soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) e Dulbecco's Modified Eagle Medium senza glucosio e fenolo rosso (di seguito, DMEM senza glucosio).
3. Utilizzare 20 mL di tampone di lisi del saggio di radioimmunoprecipitazione (RIPA).
   NOTA: Nelle sezioni seguenti, la deplezione extracellulare e l'assorbimento intracellulare di diverse dosi di FD-glucosio sono confrontati nei fibroblasti 3T3-L1 con e senza stimolazione insulinica (Figura 2).

2. Coltura cellulare 3T3-L1 e mantenimento

1. Coltura 3T3-L1 fibroblasti di topo placcando 1 x 10⁶ cellule diluite in 20 ml di Medium 1 in due piastre a 96 pozzetti. Piastra 100 μL di sospensione cellulare per pozzetto, assicurando di mantenere l'omogeneità di questa sospensione mediante miscelazione. Coltiva le cellule per 48 ore in un incubatore a 37 °C (5% CO₂ e 95% di umidità) senza cambiare i mezzi fino a circa il 70% -80% di confluenza.
2. Mantenere le cellule confluenti e a digiuno coltivandole nello stesso mezzo per 48 ore. Variare il tempo di incubazione da 24-72 h a seconda dello stato catabolico di digiuno desiderato.

3. Fame di cellule 3T3-L1

1. Decantare i mezzi dalle cellule nelle piastre a 96 pozzetti. Assorbire il fluido rimanente utilizzando asciugamani di carta sterili.
2. Risciacquare la piastra da 96 pozzetti con 100 μL di PBS per pozzetto e assorbire il fluido rimanente con carta assorbente sterile.
3. Aggiungere 100 μL di DMEM senza glucosio per pozzetto e incubare per 40 minuti. Regola il tempo di incubazione in base al tipo di cellula, agli stimoli e al livello di digiuno desiderato.
   NOTA: Il tempo di incubazione può richiedere un'ottimizzazione a seconda della stagione.

4. Preparazione di soluzioni fd-glucosio con diverse concentrazioni

NOTA: L'esperimento in Figura 2 esamina i mezzi extracellulari e intercellulari con e senza stimolazione con insulina.

1. Utilizzare otto repliche (una riga in una piastra a 96 pozzetti) per ogni condizione di stimolazione. Pertanto, preparare 1 mL per ogni condizione di stimolazione (specificata nella Tabella 2 e sotto).
2. Utilizzare otto condizioni di stimolazione senza insulina: FD-glucosio di 2,5 μg / mL, 1 μg / mL, 0,5 μg / mL, 0,2 μg / mL, 0,1 μg / mL, 0,05 μg / mL e 0 μg / mL (controllo senza FD-glucosio) in una piastra a 96 pozzetti.
3. Utilizzare otto condizioni di stimolazione con insulina (10 μg / mL, concentrazione finale): FD-glucosio di 2,5 μg / mL, 1 μg / mL, 0,5 μg / mL, 0,2 μg / mL, 0,1 μg / mL, 0,05 μg / mL e 0 μg / mL (controllo senza FD-glucosio) in un'altra piastra a 96 pozzetti.
4. Per preparare le condizioni di stimolazione, diluire 1 μL di soluzione di lavoro FD-glucosio da 5 mg/mL (Tabella 1) in 999 μL di DMEM senza glucosio per ottenere 1 mL di soluzione madre di lavoro (diluizione 1:1000 o 5 μg/mL).
   1. Utilizzando questa soluzione madre di lavoro, preparare 1:2000, 1:5000, 1:10.000, 1:25.000, 1:50.000 e 1:100.000 diluizioni di FD-glucosio per ottenere 2,5 μg/mL, 1 μg/mL, 0,5 μg/mL, 0,2 μg/mL, 0,1 μg/mL e 0,05 μg/mL (Tabella 2) in tubi da 2 mL immediatamente prima degli esperimenti in un armadio di biosicurezza senza luci.
5. Ripetere il passaggio 4.4 e aggiungere 1 μL di insulina (10 mg/mL, concentrazione finale) a ciascuna delle condizioni sopra specificate.
   NOTA: La concentrazione finale di insulina in questi campioni è di 10 μg/mL = 1,7 nmol/mL. Per ottenere l'omogeneizzazione, aggiungere insulina ai tubi prima di aggiungere altre soluzioni.

5. Trattamento delle cellule 3T3-L1 affamate

1. Dopo 40 minuti di incubazione, decantare il DMEM senza glucosio da ciascun pozzetto in piastre da 96 pozzetti e assorbire il fluido rimanente con asciugamani di carta sterili.
2. Aggiungere 100 μL (per pozzetto) ciascuno dalle varie condizioni di trattamento sopra descritte ai pozzetti lungo una colonna e 100 μL (per pozzetto) dalla stessa condizione di trattamento ai pozzetti lungo la fila (otto repliche) in entrambe le piastre a 96 pozzetti. Etichettare le piastre che hanno utilizzato le condizioni con e senza insulina. Aggiungere DMEM senza glucosio da solo ai pozzetti di controllo (n = 8).
3. Incubare la piastra per 40 minuti in un incubatore di colture cellulari (37 °C, 5% CO₂ e 95% di umidità) al buio.

6. Misure extracellulari e intercellulari per cellule stimolate 3T3-L1

1. Dopo che le cellule sono state stimolate per 40 minuti, trasferire i mezzi di stimolazione da entrambe le piastre in nuove piastre a 96 pozzetti mantenendo lo stesso layout sperimentale.
2. Decantare qualsiasi soluzione rimanente dalle piastre a 96 pozzetti stimolate originali con cellule su asciugamani di carta sterili.
3. Opzionalmente, lavare le celle con PBS. Rimuovere PBS e decantare qualsiasi soluzione rimanente su carta assorbente sterile.
4. Aggiungere 100 μL del tampone di lisi RIPA a ciascun pozzetto. Facoltativamente, aggiungere l'inibitore della proteasi al tampone RIPA per proteggere le proteine. Posizionare le piastre contenenti RIPA in uno shaker per 30 minuti.
5. Utilizzando un lettore di micropiastre (Table of Materials), misurare la fluorescenza a lunghezze d'onda di eccitazione (Ex) ed emissione (Em) di 485 e 535 nm, rispettivamente, prima nel mezzo contenente FD-glucosio extracellulare e poi, la piastra con cellule RIA-lisate alla fine dell'incubazione di 30 minuti (vedere il passaggio 6.4).

7. Normalizzazione basata sulle proteine dell'assorbimento intracellulare del glucosio

NOTA: l'assorbimento intracellulare di FD-glucosio dipende dal numero di cellule. I livelli di proteine nei lisati cellulari sono proporzionali ai numeri cellulari che consentono di normalizzare i livelli intracellulari di FD-glucosio al numero di cellule in ciascun pozzetto.

1. Eseguire il test delle proteine BCA secondo le istruzioni del produttore (vedere Tabella dei materiali). Quantificare le concentrazioni proteiche in ciascun pozzo contenente cellule RIPA-lisate.
2. Utilizzare 10 μL di omogeneizzato RIPA e misurare le concentrazioni proteiche in triplice copia per aumentare l'accuratezza delle misurazioni in piastre a 96 pozzetti.
3. Quantificare le proteine in base agli standard proteici (0, 10, 20, 30, 40, 50 e 60 μg/mL di proteine) analizzate insieme ai campioni su ogni piastra a 96 pozzetti.
4. Misurare l'assorbanza a 562 nm e quantificare le concentrazioni proteiche in ciascun campione in base alla formula di regressione lineare ottenuta per lo standard proteico.
5. Normalizzare i livelli di FD-glucosio intracellulare utilizzando il valore fluorescente / concentrazione proteica in ciascun pozzetto. L'esaurimento extracellulare fd-glucosio non richiede normalizzazione.
6. Facoltativamente, utilizzare i valori basali medi nei campioni di controllo per un'ulteriore normalizzazione (100%).

8. Misurazione ex vivo della deplezione extracellulare di glucosio FD negli organi

1. Pretrattare i topi con composti che stimolano il metabolismo del glucosio prima della dissezione dell'organo, come segue.
2. Utilizzare topi maschi Lep^ob di nove settimane (n = 11). Dai da mangiare a tutti i topi con una dieta regolare di chow prima dell'esperimento.
3. Assegnare i topi in modo casuale in tre gruppi per iniezioni intraperitoneali (i.p.).
   1. Iniettare topi dal gruppo lep^ob di controllo con 0,1 ml di PBS sterile (n = 4).
   2. Iniettare topi del gruppo insulina Lep^ob con 0,1 mL di PBS sterile, contenenti 12 UI di insulina umana per grammo di peso corporeo (BW) (n = 3).
   3. Iniettare topi del gruppo AAC2 Lep^ob con 0,1 mL di PBS sterile, contenenti 0,1 nmol AAC2 per grammo di peso corporeo (BW) (n = 4).
4. Dopo 15 minuti, sottoporre i topi all'inalazione del 5% di isoflurano ed essanguare il sangue mediante puntura cardiaca dagli animali anestetizzati²⁶.
5. Sezionare il tessuto adiposo bianco epididico viscerale (200 mg), il fegato (200 mg) e l'intero cervello di ciascun animale. Utilizzare una cappa di biosicurezza di Classe II per la manipolazione dei tessuti.
6. Preparare la soluzione di lavoro FD-glucosio (0,29 mM) in DMEM senza glucosio in un armadio di biosicurezza di Classe II senza luce.
7. Misurare la fluorescenza della soluzione di lavoro FD-glucosio (0,29 mM) a lunghezze d'onda di eccitazione ed emissione di 485 e 535 nm, rispettivamente, utilizzando un lettore di micropiastre.
8. Incubare i tessuti/organi prelevati in una piastra a 6 pozzetti contenente PBS per 1 minuto. Maneggiare ogni tessuto o organo in un pozzo separato.
9. Dopo 1 minuto, posizionare ogni fazzoletto su un tovagliolo di carta sterile per assorbire PBS. Trasferire tessuti/organi in una piastra separata a 6 pozzetti contenente 4.000 μL di DMEM senza glucosio e incubare per 2 minuti.
10. Dopo 2 minuti, rimuovere e trasferire i tessuti in pozzetti di una piastra a 6 pozzetti contenente 0,29 mM di soluzione di lavoro FD-glucosio (1 mL / pozzetto). Incubare le piastre a 6 pozzetti contenenti tessuti in soluzione di lavoro FD-glucosio a 37 °C (5% CO₂ e 95% di umidità).
11. Raccogliere 100 μL di soluzione di lavoro FD-glucosio da ciascun pozzetto dopo 0, 10, 20, 30, 40, 60, 90 e 120 minuti di incubazione, per analizzare la cinetica della deplezione extracellulare di glucosio FD. Agitare prima e dopo la raccolta.
12. Trasferire 100 μL di soluzione di lavoro FD-glucosio in piastre a 96 pozzetti per misurare la fluorescenza a lunghezze d'onda di eccitazione ed emissione di 485 e 535 nm, rispettivamente, utilizzando un lettore di micropiastre.
13. Normalizzare la fluorescenza al valore di 0 min (100%) per ogni organo in ogni animale (Figura 3).

Risultati

L'assunzione intracellulare e la deplezione extracellulare di glucosio sono state misurate nei preadipociti 3T3-L1, in risposta a diverse concentrazioni di FD-glucosio (Figura 2) con e senza stimolazione insulinica. La Figura 2A mostra un aumento dose-dipendente dell'assorbimento intracellulare di FD-glucosio, che è stato significativamente aumentato in presenza di insulina. La concomitante diminuzione del fd-glucosio extracellulare nelle stesse cellule è most...

Discussione

Il confronto diretto della deplezione extracellulare di FD-glucosio con l'assorbimento di glucosio intracellulare normalizzato nella coltura cellulare ha mostrato un'alta correlazione, suggerendo che l'esaurimento extracellulare del glucosio potrebbe essere una misura surrogata per la valutazione dell'assorbimento del glucosio. La misurazione del glucosio FD extracellulare può utilizzare una vasta gamma di concentrazioni di glucosio FD, anche 0,5-2,5 μg FD-glucosio / mL sembrano fornire l'intervallo ottimale. Il glucos...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
3T3-L1 mouse fibroblasts	ATCC	CL-173	Cell line
96-well plates	Falcon	353227	Plastic ware
B6.V-Lepob/J male mice	Jackson Laboratory	stock number 000632	Mice
BioTek Synergy H1 modular multimode microplate reader (Fisher Scientific, US)	Fisher Scientific, US	B-SHT	Device
Bovine serum	Gibco/ThermoFisher	161790-060	Cell culture
Calf serum	Gibco/ThermoFisher	26010-066	Cell culture
Cell incubator	Forma	Series II Water Jacket	Device
Diet (mouse/rat diet, irradiated)	Envigo	Teklad LM-485	Diet
Dimethylsulfoxide (DMSO)	Sigma LifeScience	D2650-100mL	Reagent
Dulbecco's Modified Eagle Medium	Gibco/ThermoFisher	11965-092	Cell culture
Ethanol	Sigma Aldrich	E7023-500mL	Reagent
Fluorescent 2-deoxy-2-[(7-nitro-2,1,3-benzoxadiazol-4-yl) amino]-D-glucose)	Sigma	72987-1MG	Assay
Glucose-free and phenol red-free DMEM	Gibco/ThermoFisher	A14430-01	Cell culture
Human insulin 10 mg/mL	MilliporeSigma, Cat N 91077C	Cat N 91077C	Reagent
Isoflurane, 5%	Henry Schein	NDC 11695-6776-2	Anestaetic
Penicillin/streptomycin (P/S)	Gibco/ThermoFisher	15140-122	Cell culture
Phosphate buffered solution	Sigma-Aldrich	DA537-500 mL	Cell culture
Pierce bicinchoninic acid (BCA) protein assay	ThermoFisher	Cat N23225	Assay
Radioimmunoprecipitation assay lysis buffer	Santa Cruz Biotechnology	sc-24948	Assay
Trypsin-EDTA (0.05%)	Gibco/ThermoFisher	25300-054	Cell culture