細胞および組織におけるグルコース取り込みの間接的尺度としての細胞外グルコース枯渇 Ex vivo

要約

蛍光標識されたグルコースの細胞外枯渇は、グルコース取り込みと相関し、摘出した臓器および細胞培養物におけるグルコース取り込みのハイスループットスクリーニングに使用することができる。

要約

糖尿病の世界的な流行が続いているため、グルコースの取り込みに影響を与える環境的、栄養的、内分泌的、遺伝的、およびエピジェネティックな要因の同定に対する需要が高まっています。細胞内蛍光の測定は、インビトロで細胞内の蛍光標識グルコース(FD-グルコース)の取り込みをテストするため、または インビボでグルコースを消費する組織をイメージングするために広く使用されている 方法です。このアッセイは、選択された時点におけるグルコース取り込みを評価する。細胞内分析は、FD-グルコースの代謝が内因性グルコースの代謝よりも遅いと仮定し、これは異化および同化反応およびシグナル伝達に関与する。しかし、動的グルコース代謝はまた、取り込み機構を変化させ、これは異なる因子に応答してグルコース取り込みの速度論的測定を必要とするであろう。本稿では、細胞外FD-グルコース枯渇を測定する方法について説明し、 エキソビボの細胞および組織における細胞内FD-グルコース取り込みとの相関を検証します。細胞外グルコース枯渇は、ハイスループットの動態学的および用量依存的研究、ならびに血糖活性およびそれらの組織特異的効果を有する化合物の同定に潜在的に適用され得る。

概要

グルコース取り込みを測定するための需要は、グルコース代謝に依存する多数の疾患の流行の増加に対処するための重要な必要性とともに上昇する。変性代謝疾患の根底にあるメカニズムは、神経学的および認知障害¹、炎症性²および感染症³、癌⁴、⁵、ならびに加齢⁶について、エネルギーおよびその貯蔵、同化プロセス、タンパク質、および遺伝子修飾、シグナル伝達、遺伝子の調節^、ならびに核酸合成および複製のためのグルコース代謝に依存する^7,8,9.真性糖尿病(DM)は、グルコース取り込み調節の機能不全に直接関係している。DMは、1型、-2型、および-3型真性糖尿病、妊娠糖尿病、若年者の成熟発症糖尿病、および環境的および/または遺伝的要因によって誘発される他のタイプのこの疾患などの慢性疾患のスペクトルである。2016年、糖尿病に関する最初のWHOグローバルレポートは、最も広範なDMとともに生きる成人の数が1980年以来ほぼ4倍に増加し、成人¹⁰人の4億2,200万人に増加し、このDM患者の数は過去数十年間指数関数的に増加していることを実証しました。2019年だけでも、推定150万人の死亡がDM¹⁰によって直接引き起こされました。この劇的な上昇は、タイプ2 DMの増加と、太りすぎや肥満を含むそれを駆動する状態によるものです¹⁰。COVID-19のパンデミックは、一般集団と比較してDM患者の死亡率が2倍に増加することを明らかにし、免疫防御におけるグルコース代謝の深遠でありながらあまり理解されていない役割を示唆しています³。DM、肥満、およびその他の疾患の予防、早期診断、および治療には、異なる組織によるグルコース取り込みの測定の最適化、およびグルコース取り込みに影響を及ぼす環境11、栄養12、内分泌13、遺伝的14、およびエピジェネティック¹⁵因子の同定が必要である。

研究において、グルコースの細胞内および/または組織内取り込みは、一般に、インビトロ^16、17、18およびインビボ¹⁹で蛍光標識されたグルコース(FD-グルコース)によって測定される。FD-グルコースは、放射性標識グルコース20、分析質量分析21、メタボロミクス22、核磁気共鳴法²³、陽電子放射断層撮影/コンピュータ断層撮影法(PET/CT)^5,24を用いたより正確な方法と比較して好ましい方法となった。FD-グルコース取り込みとは異なり、より多くの生物学的材料を必要とする分析方法は、多段階のサンプル調製、高価な機器、および複雑なデータ分析を含む可能性がある。細胞培養におけるFD-グルコース取り込みの効果的かつ安価な測定は、概念実証実験で利用されており、他の方法による検証が必要な場合がある。

グルコース取り込み研究のためのFD-グルコース適用の基礎は、内因性グルコースと比較してFD-グルコースの代謝の低下である²⁵。それにもかかわらず、内因性グルコースおよびFDグルコースの両方が、同化、異化、およびシグナル伝達プロセスで使用するために、すべての細胞コンパートメント間で動的に分布する。FD-グルコースの区画化および時間依存性処理²⁵ は、蛍光測定を妨害し、ハイスループットスクリーニング実験、速度論的分析、3D細胞培養、共培養、および組織外植実験におけるこのアッセイの使用のための主要な制限因子を表す。ここでは、FD-グルコースの細胞外枯渇とその細胞内取り込みとの間に高い相関関係を示すデータを提供し、細胞内グルコース取り込みの代理測定としてのFD-グルコースの細胞外枯渇を示唆する。グルコースの細胞外枯渇の測定を、インスリンおよび実験薬物¹⁸ で処置したマウスにおけるグルコース取り込みの組織特異的差異を検証するために適用し、この方法の原理証明を提供する。

現在のプロトコールは、3T3-L1細胞におけるFDグルコース取り込みの細胞内および細胞外(図1)測定値を記載している。プロトコルセクション1〜7は、48時間の細胞の培養および増殖を説明する。細胞飢餓、刺激、およびベースライン細胞外測定;細胞外FD-グルコースの刺激後測定およびFD-グルコースおよびタンパク質の細胞内測定。プロトコールセクション8は、他の箇所に記載されるインスリンおよびアミノ酸化合物2(AAC2)の存在下および非存在下でob/obマウスから解剖された組織におけるFDグルコースの細胞外取り込みのエクスビボ測定を記載している¹⁸。

プロトコル

動物実験は、オハイオ州立大学の施設動物ケアおよび使用委員会(OSU、プロトコル2007A0262-R4)によって承認された。

メモ:すべての手順は、送風機がオンでライトが消灯したクラスIIバイオセーフティキャビネットで行う必要があります。

1. 資料作成

メモ: すべての材料は、 材料の表にリストされています。

1. 培地1、遠心分離培地2、およびクラスIIバイオセーフティキャビネット内で表1に従って蛍光2−デオキシ−2−[(7−ニトロ−2,1,3−ベンゾオキサジアゾール−4−イル)アミノ]−D−グルコース(2−NBDGまたは FD グルコース)の貯蔵および作業溶液を調製する。フードの下のすべてのライトをオフにして、実験を通してFD-グルコースを光から保護します。
2. すぐに使用できる細胞培養試薬を使用する:トリプシン-EDTA、リン酸緩衝生理食塩水(PBS)、およびグルコースフリーおよびフェノールレッドを含まないダルベッコ改変イーグル培地(以下、グルコースフリーDMEM)。
3. 20 mL のラジオイムノ沈降アッセイ (RIPA) 溶解バッファーを使用します。
   注:以下のセクションでは、インスリン刺激の有無にかかわらず、3T3-L1線維芽細胞において、異なるFD-グルコース用量の細胞外枯渇および細胞内取り込みを比較します(図2)。

2. 3T3-L1細胞の培養と維持

1. 20 mLの培地1で希釈した1 x 106細胞を2つの⁹⁶ ウェルプレートにプレーティングして3T3−L1マウス線維芽細胞を培養する。1ウェルあたり100 μLの細胞懸濁液をプレートに、混合することによってこの懸濁液の均質性を維持するようにする。約70%〜80%のコンフルエントになるまで培地を交換せずに、37°Cのインキュベーター(5%_CO2 および湿度95%)中で48時間細胞を増殖させる。
2. 細胞をコンフルエントに保ち、同じ培地で48時間培養して絶食させる。所望の空腹時異化状態に応じて、インキュベーション時間を24〜72時間から変化させる。

3. 3T3-L1細胞の飢餓

1. 96ウェルプレート内の細胞からの培地をデカントする。滅菌ペーパータオルを使用して残りの液体を吸収します。
2. 96ウェルプレートを1ウェルあたり100μLのPBSですすぎ、残りの液体を滅菌ペーパータオルで吸収します。
3. 1ウェルあたり100μLのグルコースフリーDMEMを加え、40分間インキュベートする。細胞の種類、刺激、および所望の空腹時レベルに応じてインキュベーションの時間を調整します。
   注:インキュベーションの時間は、季節によっては最適化が必要な場合があります。

4. 異なる濃度のFD-グルコース溶液の調製

注: 図2 の実験は、インスリンによる刺激の有無にかかわらず、細胞外および細胞間培地を調べます。

1. 各刺激条件に対して8回の反復(96ウェルプレートで1列)を使用します。そこで、各刺激条件( 下記表2 に規定)ごとに1mLを用意する。
2. インスリンを含まない8つの刺激条件を使用します:1つの96ウェルプレートで、2.5 μg/mL、1 μg/mL、0.5 μg/mL、0.2 μg/mL、0.1 μg/mL、0.05 μg/mL、および0 μg/mL(FD-グルコースを含まない対照)のFDグルコース。
3. インスリン(10 μg/mL、最終濃度)で8つの刺激条件を使用します:FD-グルコース 2.5 μg/mL、1 μg/mL、0.5 μg/mL、0.2 μg/mL、0.1 μg/mL、0.05 μg/mL、および0 μg/mL(FD-グルコースを含まない対照)を別の96ウェルプレートで使用してください。
4. 刺激条件を調製するには、1 μL の 5 mg/mL FD-グルコース作動溶液 (表 1) を 999 μL のグルコース非含有 DMEM に希釈し、1 mL の作業原液 (1:1000 希釈または 5 μg/mL) を得ます。
   1. この作業ストック溶液を用いて、FD-グルコースの希釈液を1:2000、1:5000、1:10,000、1:25,000、1:50,000、および1:100,000希釈して、照明のないバイオセーフティキャビネットでの実験の直前に、2.5 μg/mL、1 μg/mL、0.5 μg/mL、0.2 μg/mL、0.1 μg/mL、および0.05 μg/mL(表2)の希釈液を2 mLチューブに調製します。
5. ステップ4.4を繰り返し、上記の各条件に1 μLのインスリン(10 mg/mL、最終濃度)を追加します。
   注:これらのサンプル中のインスリンの最終濃度は、10 μg/mL = 1.7 nmol/mLです。均質化を達成するために、他の溶液を加える前にチューブにインスリンを加える。

5. 飢餓状態の3T3-L1細胞の治療

1. 40分間のインキュベーション後、各ウェルからグルコースフリーDMEMを96ウェルプレートにデカントし、残りの流体を滅菌ペーパータオルで吸収する。
2. 上記のさまざまな処理条件からそれぞれ 100 μL (ウェルあたり) を 1 カラムに沿ったウェルに、同じ処理条件から 100 μL (ウェルあたり) を行に沿ってウェルに 100 μL (1 ウェルあたり) ずつ追加します (8 回の反復) 両方の 96 ウェルプレートで。インスリンの有無にかかわらず条件を利用したプレートにラベルを付けます。グルコースフリーDMEMのみをコントロールウェルに加える(n=8)。
3. プレートを暗所で細胞培養インキュベーター(37°C、5%_CO2、および湿度95%)で40分間インキュベートする。

6. 刺激型3T3-L1細胞の細胞外および細胞間測定

1. 細胞を40分間刺激した後、刺激培地を両方のプレートから同じ実験レイアウトを維持した新しい96ウェルプレートに移す。
2. 元の刺激された96ウェルプレートからの残りの溶液を滅菌ペーパータオル上の細胞でデカントする。
3. 任意選択で、PBSで細胞を洗浄する。PBSを取り出し、滅菌ペーパータオルに残っている溶液をデカントします。
4. 各ウェルに100 μLのRIPA溶解バッファーを追加します。任意選択で、タンパク質を保護するためにRIPA緩衝液にプロテアーゼ阻害剤を加える。RIPAを含むプレートをシェーカーに30分間入れます。
5. マイクロプレートリーダー(材料表)を用いて、まず細胞外FDグルコースを含む培地中で、それぞれ485nmおよび535nmの励起(Ex)および発光(Em)波長での蛍光を測定し、次いで、プレートを30分間インキュベーションの終了時にRIPA溶解細胞と共に測定する(ステップ6.4参照)。

7. 細胞内グルコース取り込みのタンパク質ベースの正常化

注:細胞内FD-グルコース取り込みは細胞数に依存する。細胞溶解物中のタンパク質レベルは、細胞内FD-グルコースレベルを各ウェルの細胞数に正規化することを可能にする細胞数に比例する。

1. 製造業者の指示に従ってBCAタンパク質アッセイを行う( 材料表を参照)。RIPA溶解細胞を含む各ウェル中のタンパク質濃度を定量する。
2. 10 μL の RIPA ホモジネートを使用し、タンパク質濃度を 3 連で測定して、96 ウェルプレートでの測定精度を高めます。
3. 分析したタンパク質標準物質(0、10、20、30、40、50、および60 μg/mLタンパク質)と各96ウェルプレート上のサンプルに基づいてタンパク質を定量します。
4. 562nmの吸光度を測定し、タンパク質標準品について得られた線形回帰式に基づいて各サンプル中のタンパク質濃度を定量する。
5. 各ウェルの蛍光値/タンパク質濃度を使用して、細胞内FD-グルコースのレベルを正常化する。細胞外FD-グルコース枯渇は正常化を必要としない。
6. 必要に応じて、追加の正規化(100%)のために対照サンプルの平均ベースライン値を使用します。

8. 臓器における細胞外FDグルコース枯渇の Ex vivo 測定

1. 以下のように、臓器郭清の前に糖代謝を刺激する化合物でマウスを前処理する。
2. 9週齢の Lep^ob 雄マウス(n=11)を使用する。実験の前に、すべてのマウスに通常のチャウ食を与えてください。
3. マウスを腹腔内(i.p.)注射のために3つのグループにランダムに割り当てる。
   1. 対照 Lep^ob 群のマウスに0.1mLの滅菌PBS(n = 4)を注射する。
   2. インスリンLep ob群のマウスに、体重1グラムあたり^12IUのヒトインスリン(BW)を含む0.1mLの滅菌PBSを注射する(n = 3)。
   3. AAC2 Lep^ob 群のマウスに、体重1グラム当たり0.1nmolのAAC2(BW)を含む0.1mLの滅菌PBSを注射する(n = 4)。
4. 15分後、対象マウスを5%イソフルランの吸入にかけ、麻酔した動物²⁶から心臓穿刺により血液を除血した。
5. 各動物の内臓上体白脂肪組織(200mg)、肝臓(200mg)、および全脳を解剖する。組織処理にはクラスIIバイオセーフティフードを使用してください。
6. FD-グルコース(0.29 mM)作業溶液をグルコースフリーDMEM中で、光のないクラスIIバイオセーフティキャビネットで調製します。
7. マイクロプレートリーダーを使用して、励起波長と発光波長がそれぞれ485 nmおよび535 nmのFD-グルコース作動溶液(0.29 mM)の蛍光を測定します。
8. 採取した組織/臓器をPBSを含む6ウェルプレートで1分間インキュベートします。各組織または器官を別々の井戸で処理します。
9. 1分後、各ティッシュを滅菌ペーパータオルの上に置き、PBSを吸収します。組織/臓器を4,000 μLのグルコースフリーDMEMを含む別の6ウェルプレートに移し、2分間インキュベートします。
10. 2分後、組織を除去し、0.29 mM FD-グルコース作業溶液(1 mL/ウェル)を含む6ウェルプレートのウェルに移します。組織を含む6ウェルプレートをFD-グルコース作業溶液中で37°C(5%_CO2 および湿度95%)でインキュベートする。
11. 0、10、20、30、40、60、90、および120分のインキュベーション後に各ウェルから100μLのFDグルコース作動溶液を採取し、細胞外FDグルコース枯渇の動態を分析した。収集前後に振る。
12. 100 μLのFD-グルコース作動溶液を96ウェルプレートに移し、マイクロプレートリーダーを使用して、励起波長と発光波長がそれぞれ485nmおよび535nmの蛍光を測定しました。
13. 各動物の各臓器について蛍光を0分値(100%)に正規化します(図3)。

結果

細胞内摂取および細胞外グルコース枯渇は、インスリン刺激の有無にかかわらず、異なる濃度のFDグルコース(図2)に応答して、3T3−L1前駆脂肪細胞において測定された。 図2Aは 、FD−グルコースの細胞内取り込みの用量依存的増加を示し、これはインスリンの存在下で有意に増加した。同じ細胞における細胞外FD-グルコースの付随する減少を

ディスカッション

細胞外FD-グルコース枯渇と細胞培養における正規化された細胞内グルコース取り込みとの直接比較は高い相関関係を示し、細胞外グルコース枯渇がグルコース取り込み評価のための代理測定である可能性があることを示唆した。細胞外FD-グルコースの測定には、広範囲のFDグルコース濃度を使用することができ、また、0.5-2.5μgのFD-グルコース/mLが最適な範囲を提供するようである。細胞外FD-?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
3T3-L1 mouse fibroblasts	ATCC	CL-173	Cell line
96-well plates	Falcon	353227	Plastic ware
B6.V-Lepob/J male mice	Jackson Laboratory	stock number 000632	Mice
BioTek Synergy H1 modular multimode microplate reader (Fisher Scientific, US)	Fisher Scientific, US	B-SHT	Device
Bovine serum	Gibco/ThermoFisher	161790-060	Cell culture
Calf serum	Gibco/ThermoFisher	26010-066	Cell culture
Cell incubator	Forma	Series II Water Jacket	Device
Diet (mouse/rat diet, irradiated)	Envigo	Teklad LM-485	Diet
Dimethylsulfoxide (DMSO)	Sigma LifeScience	D2650-100mL	Reagent
Dulbecco's Modified Eagle Medium	Gibco/ThermoFisher	11965-092	Cell culture
Ethanol	Sigma Aldrich	E7023-500mL	Reagent
Fluorescent 2-deoxy-2-[(7-nitro-2,1,3-benzoxadiazol-4-yl) amino]-D-glucose)	Sigma	72987-1MG	Assay
Glucose-free and phenol red-free DMEM	Gibco/ThermoFisher	A14430-01	Cell culture
Human insulin 10 mg/mL	MilliporeSigma, Cat N 91077C	Cat N 91077C	Reagent
Isoflurane, 5%	Henry Schein	NDC 11695-6776-2	Anestaetic
Penicillin/streptomycin (P/S)	Gibco/ThermoFisher	15140-122	Cell culture
Phosphate buffered solution	Sigma-Aldrich	DA537-500 mL	Cell culture
Pierce bicinchoninic acid (BCA) protein assay	ThermoFisher	Cat N23225	Assay
Radioimmunoprecipitation assay lysis buffer	Santa Cruz Biotechnology	sc-24948	Assay
Trypsin-EDTA (0.05%)	Gibco/ThermoFisher	25300-054	Cell culture