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Résumé

L’épuisement extracellulaire du glucose marqué par fluorescence est en corrélation avec l’absorption du glucose et pourrait être utilisé pour le dépistage à haut débit de l’absorption du glucose dans les organes excisés et les cultures cellulaires.

Résumé

L’épidémie mondiale de diabète en cours augmente la demande d’identification des facteurs environnementaux, nutritionnels, endocriniens, génétiques et épigénétiques affectant l’absorption du glucose. La mesure de la fluorescence intracellulaire est une méthode largement utilisée pour tester l’absorption du glucose marqué par fluorescence (FD-glucose) dans les cellules in vitro, ou pour l’imagerie des tissus consommateurs de glucose in vivo. Ce test évalue l’absorption du glucose à un moment choisi. L’analyse intracellulaire suppose que le métabolisme du FD-glucose est plus lent que celui du glucose endogène, qui participe aux réactions cataboliques et anabolisantes et à la signalisation. Cependant, le métabolisme dynamique du glucose modifie également les mécanismes d’absorption, ce qui nécessiterait des mesures cinétiques de l’absorption du glucose en réponse à différents facteurs. Cet article décrit une méthode de mesure de l’épuisement extracellulaire du FD-glucose et valide sa corrélation avec l’absorption intracellulaire du FD-glucose dans les cellules et les tissus ex vivo. L’épuisement extracellulaire du glucose peut être potentiellement applicable pour les études cinétiques et dose-dépendantes à haut débit, ainsi que pour l’identification des composés ayant une activité glycémique et leurs effets spécifiques aux tissus.

Introduction

La demande pour mesurer l’absorption du glucose augmente avec le besoin critique de faire face à une augmentation épidémique d’une multitude de maladies dépendantes du métabolisme du glucose. Les mécanismes sous-jacents des maladies métaboliques dégénératives, des troubles neurologiques et cognitifs1, des maladies inflammatoires2 et infectieuses3, du cancer 4,5, ainsi que du vieillissement 6, dépendent du métabolisme du glucose pour l’énergie et son stockage, les processus anabolisants, la modification des protéines et des gènes, la signalisation, la régulation des gènes et la synthèse et la réplication des acides nucléiques 7,8,9 . Le diabète sucré (DM) est directement lié à un dysfonctionnement de la régulation de l’absorption du glucose. Le DM est un spectre de maladies chroniques telles que le diabète sucré de type 1, -2 et -3, le diabète gestationnel, le diabète de maturité des jeunes et d’autres types de cette maladie induite par des facteurs environnementaux et / ou génétiques. En 2016, le premier rapport mondial de l’OMS sur le diabète a démontré que le nombre d’adultes vivant avec le DIABÈTE le plus répandu a presque quadruplé depuis 1980 pour atteindre 422 millions d’adultes10, et ce nombre de patients atteints de diabète a augmenté de façon exponentielle au cours des dernières décennies. Rien qu’en 2019, on estime à 1,5 million le nombre de décès directement causés par10 DM. Cette recrudescence spectaculaire est due à l’augmentation du diabète de type 2 et aux conditions qui l’animent, notamment le surpoids et l’obésité10. La pandémie de COVID-19 a révélé une double augmentation de la mortalité chez les patients atteints de DM par rapport à la population générale, suggérant le rôle profond mais mal compris du métabolisme du glucose dans la défense immunitaire3. La prévention, le diagnostic précoce et le traitement de la DM, de l’obésité et d’autres maladies nécessitent l’optimisation des mesures de l’absorption du glucose par différents tissus et l’identification des facteursenvironnementaux 11,nutritionnels 12, endocriniens13, génétiques 14 et épigénétiques15 affectant l’absorption du glucose.

Dans la recherche, l’absorption intracellulaire et / ou tissulaire du glucose est généralement mesurée par le glucose marqué par fluorescence (FD-glucose) in vitro 16,17,18 et in vivo19. Le FD-glucose est devenu une méthode préférée par rapport aux méthodes plus précises utilisant le glucose20 marqué radioactivement, l’analyse par spectroscopie de masse analytique21, la métabolomique22, les méthodes de résonance magnétique nucléaire23 et la tomographie par émission de positons / tomodensitométrie (TEP / CT) 5,24. Contrairement à l’absorption du glucose FD, les méthodes d’analyse nécessitant plus de matériel biologique peuvent impliquer une préparation d’échantillon en plusieurs étapes, des instruments coûteux et une analyse complexe des données. Des mesures efficaces et peu coûteuses de l’absorption du FD-glucose dans les cultures cellulaires ont été utilisées dans des expériences de preuve de concept et peuvent nécessiter une validation par d’autres méthodes.

La base de l’application de FD-glucose pour les études d’absorption du glucose est le métabolisme réduit du FD-glucose par rapport au glucose endogène25. Néanmoins, le glucose endogène et le FD-glucose sont répartis dynamiquement entre tous les compartiments cellulaires pour une utilisation dans les processus anabolisants, cataboliques et de signalisation. Le compartimentage et le traitement dépendant du temps25 du FD-glucose interfèrent avec les mesures de fluorescence et représentent les principaux facteurs limitant l’utilisation de ce test dans les expériences de criblage à haut débit, l’analyse cinétique, la culture cellulaire 3D, les co-cultures et les expériences d’explantation tissulaire. Ici, nous fournissons des données démontrant une forte corrélation entre l’épuisement extracellulaire du FD-glucose et son absorption intracellulaire, suggérant l’épuisement extracellulaire du FD-glucose comme mesure de substitution de l’absorption intracellulaire du glucose. La mesure de l’épuisement extracellulaire du glucose a été appliquée pour valider les différences tissulaires dans l’absorption du glucose chez les souris traitées avec de l’insuline et un médicament expérimental18 pour fournir une preuve de principe de cette méthode.

Le protocole actuel décrit les mesures intracellulaires et extracellulaires (Figure 1) de l’absorption du FD-glucose dans les cellules 3T3-L1. Les sections 1 à 7 du protocole expliquent la culture et la croissance des cellules pendant 48 h; la famine cellulaire, la stimulation et les mesures extracellulaires de base; et les mesures post-stimulation du FD-glucose extracellulaire et les mesures intracellulaires du FD-glucose et des protéines. La section 8 du protocole décrit la mesure ex vivo de l’absorption extracellulaire du FD-glucose dans les tissus disséqués de souris ob/ob en présence et en l’absence d’insuline et de composé d’acides aminés 2 (CAA2) décrite ailleurs18.

Protocole

Les études sur les animaux ont été approuvées par l’Institutional Animal Care and Use Committee de l’Ohio State University (OSU, protocole 2007A0262-R4).

REMARQUE: Toutes les procédures doivent être effectuées dans une armoire de biosécurité de classe II avec le ventilateur allumé et les lumières éteintes.

1. Préparation des matériaux

REMARQUE : Tous les matériaux sont répertoriés dans le tableau des matériaux.

  1. Préparer le milieu 1, le milieu de centrifugation 2 et les solutions de stockage et de travail du 2-désoxy-2-[(7-nitro-2,1,3-benzoxadiazol-4-yl)amino]-D-glucose fluorescent (2-NBDG ou FD-glucose) conformément au tableau 1 dans une armoire de biosécurité de classe II. Protégez le FD-glucose de la lumière tout au long de l’expérience en éteignant toutes les lumières sous le capot.
  2. Utilisez des réactifs de culture cellulaire prêts à l’emploi : Trypsine-EDTA, solution saline tamponnée au phosphate (PBS) et milieu Eagle modifié de Dulbecco sans glucose et sans phénol rouge (ci-après, DMEM sans glucose).
  3. Utilisez 20 mL de tampon de lyse par dosage radioimmunoprécipitation (RIPA).
    REMARQUE: Dans les sections suivantes, l’épuisement extracellulaire et l’absorption intracellulaire de différentes doses de FD-glucose sont comparés dans les fibroblastes 3T3-L1 avec et sans stimulation par insuline (Figure 2).

2. Culture cellulaire et entretien 3T3-L1

  1. Culture de fibroblastes de souris 3T3-L1 par placage de 1 x 106 cellules diluées dans 20 mL de Milieu 1 dans deux plaques de 96 puits. Plaque 100 μL de suspension cellulaire par puits, assurant le maintien de l’homogénéité de cette suspension par mélange. Cultiver des cellules pendant 48 h dans un incubateur à 37 °C (5 % deCO2 et 95 % d’humidité) sans changer de milieu jusqu’à environ 70 % à 80 % de confluence.
  2. Maintenir les cellules confluentes et à jeun en les cultivant dans le même milieu pendant 48 h. Variez le temps d’incubation de 24 à 72 h en fonction de l’état catabolique à jeun souhaité.

3. Famine des cellules 3T3-L1

  1. Milieux décantants des cellules dans les plaques de 96 puits. Absorbez le liquide restant à l’aide d’essuie-tout stériles.
  2. Rincez la plaque de 96 puits avec 100 μL de PBS par puits et absorbez le liquide restant avec des serviettes en papier stériles.
  3. Ajouter 100 μL de DMEM sans glucose par puits et incuber pendant 40 min. Ajustez le temps d’incubation en fonction du type de cellule, des stimuli et du niveau de jeûne souhaité.
    REMARQUE: Le temps d’incubation peut nécessiter une optimisation en fonction de la saison.

4. Préparation de solutions de FD-glucose avec différentes concentrations

REMARQUE: L’expérience de la figure 2 examine les milieux extracellulaires et intercellulaires avec et sans stimulation avec l’insuline.

  1. Utilisez huit répliques (une rangée dans une plaque de 96 puits) pour chaque condition de stimulation. Par conséquent, préparez 1 mL pour chaque condition de stimulation (spécifiée dans le tableau 2 et ci-dessous).
  2. Utilisez huit conditions de stimulation sans insuline : FD-glucose de 2,5 μg/mL, 1 μg/mL, 0,5 μg/mL, 0,2 μg/mL, 0,1 μg/mL, 0,05 μg/mL et 0 μg/mL (témoin sans FD-glucose) dans une plaque de 96 puits.
  3. Utilisez huit conditions de stimulation avec de l’insuline (10 μg/mL, concentration finale) : FD-glucose de 2,5 μg/mL, 1 μg/mL, 0,5 μg/mL, 0,2 μg/mL, 0,1 μg/mL, 0,05 μg/mL et 0 μg/mL (contrôle sans FD-glucose) dans une autre plaque de 96 puits.
  4. Pour préparer les conditions de stimulation, diluer 1 μL de solution de travail FD-glucose de 5 mg/mL (tableau 1) dans 999 μL de DMEM sans glucose pour obtenir 1 mL de solution mère (dilution 1:1000 ou 5 μg/mL).
    1. À l’aide de cette solution mère de travail, préparer des dilutions de 1:2000, 1:5000, 1:10 000, 1:25 000, 1:50 000 et 1:100 000 de FD-glucose pour obtenir 2,5 μg/mL, 1 μg/mL, 0,5 μg/mL, 0,2 μg/mL, 0,1 μg/mL et 0,05 μg/mL (tableau 2) dans des tubes de 2 mL immédiatement avant les expériences dans une armoire de biosécurité sans lumières.
  5. Répétez l’étape 4.4 et ajoutez 1 μL d’insuline (10 mg/mL, concentration finale) à chacune des conditions spécifiées ci-dessus.
    REMARQUE : La concentration finale d’insuline dans ces échantillons est de 10 μg/mL = 1,7 nmol/mL. Pour obtenir l’homogénéisation, ajoutez de l’insuline aux tubes avant d’ajouter d’autres solutions.

5. Traiter les cellules 3T3-L1 affamées

  1. Après 40 min d’incubation, décanter le DMEM sans glucose de chaque puits dans des plaques de 96 puits et absorber le liquide restant avec des serviettes en papier stériles.
  2. Ajouter 100 μL (par puits) chacun des différentes conditions de traitement décrites ci-dessus aux puits le long d’une colonne, et 100 μL (par puits) de la même condition de traitement aux puits le long de la rangée (huit répliques) dans les deux plaques de 96 puits. Étiquetez les plaques qui ont utilisé les conditions avec et sans insuline. Ajouter le DMEM sans glucose seul aux puits témoins (n = 8).
  3. Incuber la plaque pendant 40 min dans un incubateur de culture cellulaire (37 °C, 5 % de CO2 et 95 % d’humidité) dans l’obscurité.

6. Mesures extracellulaires et intercellulaires pour les cellules 3T3-L1 stimulées

  1. Une fois que les cellules ont été stimulées pendant 40 minutes, transférez le milieu de stimulation des deux plaques dans de nouvelles plaques de 96 puits en conservant la même disposition expérimentale.
  2. Décantez toute solution restante des plaques de 96 puits stimulées d’origine avec des cellules sur des serviettes en papier stériles.
  3. En option, lavez les cellules avec PBS. Retirez le PBS et décantez toute solution restante sur des serviettes en papier stériles.
  4. Ajouter 100 μL du tampon de lyse RIPA à chaque puits. Éventuellement, ajoutez un inhibiteur de protéase au tampon RIPA pour protéger les protéines. Placer les plaques contenant DU RIPA dans un agitateur pendant 30 min.
  5. À l’aide d’un lecteur de microplaques (Table des matériaux), mesurez la fluorescence aux longueurs d’onde d’excitation (Ex) et d’émission (Em) de 485 et 535 nm, respectivement, d’abord dans le milieu contenant du FD-glucose extracellulaire, puis dans la plaque avec des cellules lysées RIPA à la fin de 30 min d’incubation (voir étape 6.4).

7. Normalisation à base de protéines de l’absorption intracellulaire du glucose

REMARQUE: L’absorption intracellulaire de FD-glucose dépend du nombre de cellules. Les niveaux de protéines dans les lysats cellulaires sont proportionnels au nombre de cellules qui permettent de normaliser les niveaux intracellulaires de GLUCOSE FD au nombre de cellules dans chaque puits.

  1. Effectuer un dosage des protéines BCA conformément aux instructions du fabricant (voir tableau des matériaux). Quantifier les concentrations de protéines dans chaque puits contenant des cellules lysées RIPA.
  2. Utilisez 10 μL de l’homogénat RIPA et mesurez les concentrations de protéines en triple exemplaire pour augmenter la précision des mesures dans des plaques de 96 puits.
  3. Quantifier les protéines en fonction des étalons protéiques (protéines 0, 10, 20, 30, 40, 50 et 60 μg/mL) analysées avec des échantillons sur chaque plaque de 96 puits.
  4. Mesurer l’absorbance à 562 nm et quantifier les concentrations de protéines dans chaque échantillon en fonction de la formule de régression linéaire obtenue pour l’étalon protéique.
  5. Normaliser les niveaux de FD-glucose intracellulaire en utilisant la valeur fluorescente / concentration de protéines dans chaque puits. L’épuisement extracellulaire du FD-glucose ne nécessite pas de normalisation.
  6. Si vous le souhaitez, utilisez les valeurs de référence moyennes dans les échantillons de contrôle pour une normalisation supplémentaire (100 %).

8. Mesure ex vivo de l’épuisement extracellulaire du glucose FD dans les organes

  1. Prétraitez les souris avec des composés stimulant le métabolisme du glucose avant la dissection d’organe, comme suit.
  2. Utilisez des souris mâles Lepob âgées de neuf semaines (n = 11). Nourrissez toutes les souris avec un régime chow régulier avant l’expérience.
  3. Assignez des souris au hasard en trois groupes pour des injections intrapéritonéales (i.p.).
    1. Injecter des souris du groupe témoin Lepob avec 0,1 mL de PBS stérile (n = 4).
    2. Injecter à des souris du groupe insuline Lepob 0,1 mL de PBS stérile, contenant 12 UI d’insuline humaine par gramme de poids corporel (BW) (n = 3).
    3. Injecter des souris du groupe AAC2 Lepob avec 0,1 mL de PBS stérile, contenant 0,1 nmol AAC2 par gramme de poids corporel (BW) (n = 4).
  4. Après 15 min, soumettre les souris à l’inhalation de 5% d’isoflurane et d’exsanguinate de sang par ponction cardiaque des animaux anesthésiés26.
  5. Disséquer le tissu adipeux blanc épidydimal viscéral (200 mg), le foie (200 mg) et le cerveau entier de chaque animal. Utilisez une hotte de biosécurité de classe II pour la manipulation des tissus.
  6. Préparer la solution de travail FD-glucose (0,29 mM) dans du DMEM sans glucose dans une armoire de biosécurité de classe II sans lumière.
  7. Mesurer la fluorescence de la solution de travail FD-glucose (0,29 mM) à des longueurs d’onde d’excitation et d’émission de 485 et 535 nm, respectivement, à l’aide d’un lecteur de microplaques.
  8. Incuber les tissus/organes prélevés dans une plaque de 6 puits contenant du PBS pendant 1 min. Manipulez chaque tissu ou organe dans un puits séparé.
  9. Après 1 min, placez chaque mouchoir sur une serviette en papier stérile pour absorber le PBS. Transférer les tissus/organes dans une plaque séparée de 6 puits contenant 4 000 μL de DMEM sans glucose et incuber pendant 2 min.
  10. Après 2 min, prélever et transférer les tissus dans les puits d’une plaque de 6 puits contenant 0,29 mM de solution de travail FD-glucose (1 mL/puits). Incuber les plaques de 6 puits contenant des tissus dans une solution de travail FD-glucose à 37 °C (5% de CO2 et 95% d’humidité).
  11. Recueillir 100 μL de solution de travail FD-glucose de chaque puits après 0, 10, 20, 30, 40, 60, 90 et 120 min d’incubation, pour analyser la cinétique de l’épuisement extracellulaire du glucose FD. Agiter avant et après la collecte.
  12. Transférer 100 μL de solution de travail FD-glucose dans des plaques de 96 puits pour mesurer la fluorescence à des longueurs d’onde d’excitation et d’émission de 485 et 535 nm, respectivement, à l’aide d’un lecteur de microplaques.
  13. Normaliser la fluorescence à la valeur de 0 min (100 %) pour chaque organe de chaque animal (Figure 3).

Résultats

L’apport intracellulaire et l’épuisement extracellulaire du glucose ont été mesurés dans les préadipocytes 3T3-L1, en réponse à différentes concentrations de GLUCOSE FD (Figure 2) avec et sans stimulation par l’insuline. La figure 2A montre une augmentation dose-dépendante de l’absorption intracellulaire du GLUCOSE FD, qui a été significativement augmentée en présence d’insuline. La diminution concomitante du FD-glucose extracellulaire dan...

Discussion

La comparaison directe de l’épuisement extracellulaire du FD-glucose avec l’absorption intracellulaire normalisée du glucose dans la culture cellulaire a montré une corrélation élevée, suggérant que l’épuisement extracellulaire du glucose pourrait être une mesure de substitution pour l’évaluation de l’absorption du glucose. La mesure du GLUCOSE FD extracellulaire peut utiliser une large gamme de concentrations de glucose FD, également 0,5-2,5 μg FD-glucose / mL semblent fournir la plage optimale. Le...

Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont aucun problème à divulguer et n’ont aucun conflit d’intérêts.

Remerciements

Le projet a été soutenu par le prix Ralph et Marian Falk Medical Research Catalyst et le prix Kathleen Kelly. Parmi les autres soutiens, citons le National Center for Research Resources UL1RR025755 et le NCI P30CA16058 (OSUCCC), la feuille de route des NIH pour la recherche médicale. Le contenu relève de la seule responsabilité des auteurs et ne représente pas les points de vue officiels du National Center for Research Resources ou du NIH.

matériels

NameCompanyCatalog NumberComments
3T3-L1 mouse fibroblastsATCCCL-173Cell line
96-well platesFalcon353227Plastic ware
B6.V-Lepob/J male miceJackson Laboratorystock number 000632Mice
BioTek Synergy H1 modular multimode microplate reader (Fisher Scientific, US)Fisher Scientific, US B-SHTDevice
Bovine serumGibco/ThermoFisher161790-060Cell culture
Calf serumGibco/ThermoFisher26010-066Cell culture
Cell incubatorFormaSeries II Water JacketDevice
Diet (mouse/rat diet, irradiated)EnvigoTeklad LM-485Diet
Dimethylsulfoxide (DMSO)Sigma LifeScienceD2650-100mLReagent
Dulbecco's Modified Eagle MediumGibco/ThermoFisher 11965-092Cell culture
EthanolSigma AldrichE7023-500mLReagent
Fluorescent 2-deoxy-2-[(7-nitro-2,1,3-benzoxadiazol-4-yl) amino]-D-glucose)Sigma72987-1MGAssay
Glucose-free and phenol red-free DMEMGibco/ThermoFisherA14430-01Cell culture
Human insulin 10 mg/mLMilliporeSigma, Cat N 91077CCat N 91077CReagent
Isoflurane, 5%Henry ScheinNDC 11695-6776-2Anestaetic
Penicillin/streptomycin (P/S)Gibco/ThermoFisher15140-122Cell culture
Phosphate buffered solutionSigma-AldrichDA537-500 mLCell culture
Pierce bicinchoninic acid (BCA) protein assayThermoFisherCat N23225Assay
Radioimmunoprecipitation assay lysis bufferSanta Cruz Biotechnologysc-24948Assay
Trypsin-EDTA (0.05%)Gibco/ThermoFisher 25300-054Cell culture

Références

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