세포 외 포도당 고갈은 세포 및 조직 Ex vivo 에서 포도당 흡수의 간접적 인 척도로서

요약

형광 표지된 글루코스의 세포외 고갈은 글루코스 흡수와 상관관계가 있으며, 적출된 기관 및 세포 배양물에서 글루코스 흡수의 고처리량 스크리닝에 사용될 수 있다.

초록

전 세계적으로 진행중인 당뇨병 유행은 포도당 섭취에 영향을 미치는 환경, 영양, 내분비, 유전 및 후성 유전 적 요인의 확인에 대한 수요를 증가시킵니다. 세포내 형광의 측정은 시험관 내에서 세포에서 형광 표지된 글루코스(FD-glucose)의 흡수를 시험하거나 생체내에서 글루코스 소비 조직을 영상화하기 위해 널리 사용되는 방법이다. 이 분석은 선택된 시점에서 글루코스 흡수를 평가합니다. 세포 내 분석은 FD-글루코스의 신진 대사가 이화 작용 및 단백 동화 반응 및 신호 전달에 참여하는 내인성 포도당의 신진 대사보다 느리다고 가정합니다. 그러나 동적 포도당 대사는 또한 흡수 메커니즘을 변경하며, 이는 다양한 요인에 대한 반응으로 포도당 섭취의 운동 학적 측정이 필요합니다. 이 글에서는 세포외 FD-글루코스 고갈을 측정하는 방법을 설명하고, 세포 및 조직 ex 생체내에서 세포내 FD-글루코스 흡수와의 상관관계를 검증한다. 세포외 글루코스 고갈은 고처리량 동역학 및 용량-의존적 연구뿐만 아니라 혈당 활성 및 그들의 조직-특이적 효과를 갖는 화합물을 확인하는 데 잠재적으로 적용될 수 있다.

서문

포도당 섭취량 측정에 대한 요구는 포도당 대사에 의존하는 수많은 질병의 전염병 증가를 해결해야 할 중요한 필요성과 함께 증가합니다. 퇴행성 대사성 질환, 신경 및인지 장애¹, 염증성² 및 전염병³, 암^4,5 및 노화⁶의 기본 메커니즘은 에너지 및 그 저장, 단백 동화 과정, 단백질 및 유전자 변형, 신호 전달, 유전자의 조절, 핵산 합성 및 복제에 대한 포도당 대사에 의존합니다 7,8,9 . 당뇨병 (DM)은 포도당 흡수 조절의 오작동과 직접 관련이 있습니다. DM은 제1형, -2형, -3형 진성 당뇨병, 임신성 당뇨병, 젊은 성숙 발병 당뇨병 및 환경 및/또는 유전적 요인에 의해 유발되는 다른 유형의 질환과 같은 만성 질환의 스펙트럼이다. 2016 년 당뇨병에 관한 최초의 WHO 글로벌 보고서에 따르면 가장 널리 퍼진 DM을 앓고있는 성인의 수는 1980 년 이후 422 백만 명의 성인¹⁰ 명으로 거의 4 배로 증가했으며이 DM 환자 수는 지난 수십 년 동안 기하 급수적으로 증가하고 있습니다. 2019 년에만 DM¹⁰에 의해 1.5 백만 명의 사망자가 직접 발생한 것으로 추정됩니다. 이러한 극적인 상승은 유형 2 DM의 증가와 과체중 및 비만¹⁰을 포함하여 그것을 유발하는 조건 때문입니다. COVID-19 전염병은 일반 인구에 비해 DM 환자의 사망률이 두 배 증가한 것으로 나타 났으며, 이는 면역 방어에서 포도당 대사의 심오하지만 잘 이해되지 않은 역할을 시사합니다³. DM, 비만 및 기타 질병의 예방, 조기 진단 및 치료에는 다양한 조직에 의한 포도당 흡수 측정의 최적화와 포도당 섭취에 영향을 미치는 환경 11, 영양 12, 내분비¹³, 유전 적¹⁴ 및 후성 유전 학적 ¹⁵ 요인의 확인이 필요합니다.

연구에서, 글루코스의 세포내 및/또는 조직 흡수는 일반적으로 시험관내 ^16,17,18 및 생체내¹⁹에서 형광 표지된 글루코스(FD-glucose)에 의해 측정된다. FD-글루코오스는 방사성 표지된 글루코스 20, 분석 질량 분광법 분석 21, 대사체학 22, 핵 자기 공명 방법(²³), 양전자 방출 단층촬영/컴퓨터 단층촬영(PET/CT)^5,24를 사용하는 보다 정밀한 방법에 비해 선호되는 방법이 되었다. FD-글루코스 섭취와는 달리, 더 많은 생물학적 물질을 필요로 하는 분석 방법에는 다단계 샘플 준비, 고가의 장비 및 복잡한 데이터 분석이 포함될 수 있습니다. 세포 배양물에서 FD-글루코스 흡수의 효과적이고 저렴한 측정은 개념 증명 실험에 활용되었으며 다른 방법에 의한 검증이 필요할 수 있습니다.

포도당 흡수 연구를위한 FD-글루코스 적용의 기초는 내인성 포도당²⁵에 비해 FD-포도당의 신진 대사 감소입니다. 그럼에도 불구하고, 내인성 글루코스와 FD-글루코오스 둘 모두는 동화작용, 이화작용 및 신호전달 과정에 사용하기 위해 모든 세포 구획들 사이에 동적으로 분포된다. FD-글루코오스의 구획화 및 시간 의존적 처리(²⁵ )는 형광 측정을 방해하고, 고처리량 스크리닝 실험, 동역학 분석, 3D 세포 배양, 공동 배양, 및 조직 외래 실험에서 이러한 분석의 사용에 대한 주요 제한 인자를 나타낸다. 여기에서, 우리는 FD-글루코스의 세포외 고갈과 그 세포내 흡수 사이의 높은 상관관계를 보여주는 데이터를 제공하여, 세포내 글루코스 흡수를 위한 대리 측정으로서 FD-글루코오스의 세포외 고갈을 시사한다. 글루코스의 세포외 고갈의 측정은 이 방법의 원리 증명을 제공하기 위해 인슐린 및 실험 약물¹⁸ 로 처리된 마우스에서 글루코스 흡수의 조직 특이적 차이를 검증하기 위해 적용되었다.

현재 프로토콜은 3T3-L1 세포에서 FD-글루코스 흡수의 세포내 및 세포외(그림 1) 측정을 기술한다. 프로토콜 섹션 1-7은 48 h 동안 세포의 배양 및 성장을 설명합니다. 세포 기아, 자극, 및 기준선 세포외 측정; 및 세포외 FD-글루코오스의 자극 후 측정 및 FD-글루코스 및 단백질의 세포내 측정. 프로토콜 섹션 8은 다른 곳(¹⁸)에 기술된 인슐린 및 아미노산 화합물 2(AAC2)의 존재 및 부재 하에 ob/ob 마우스로부터 해부된 조직에서 FD-글루코스의 세포외 흡수의 생체외 측정을 기술한다.

프로토콜

동물 연구는 오하이오 주립 대학의 기관 동물 관리 및 사용위원회 (OSU, 프로토콜 2007A0262-R4)에 의해 승인되었습니다.

참고 : 모든 절차는 송풍기를 켜고 표시등이 꺼진 클래스 II 생물 안전 캐비닛에서 수행되어야합니다.

1. 재료의 제조

참고: 모든 재료는 재료 표에 나열되어 있습니다.

1. 클래스 II 생물안전 캐비닛에서 표 1에 따른 배지 1, 원심분리 배지 2, 및 형광 2-데옥시-2-[(7-니트로-2,1,3-벤즈옥사디아졸-4-일)아미노]-D-글루코오스(2-NBDG 또는 FD-글루코스)의 저장 및 작업 용액을 준비한다. 후드 아래의 모든 조명을 꺼서 실험 전반에 걸쳐 빛으로부터 FD-포도당을 보호하십시오.
2. 즉시 사용 가능한 세포 배양 시약을 사용하십시오: 트립신-EDTA, 인산염 완충 식염수(PBS), 무글루코스 및 페놀 무함유 둘베코의 변형 이글 배지(이하, 무당 DMEM).
3. 20 mL의 방사선면역침전 분석법(RIPA) 용해 완충액을 사용하십시오.
   참고: 다음 섹션에서는 인슐린 자극이 있거나없는 3T3-L1 섬유아세포에서 다른 FD-글루코스 용량의 세포외 고갈 및 세포 내 흡수를 비교합니다 (그림 2).

2. 3T3-L1 세포 배양 및 유지

1. 배지 1 20 mL에 희석된 1 x 10 6 세포를 두 개의⁹⁶ -웰 플레이트에 플레이팅하여 3T3-L1 마우스 섬유아세포를 배양하였다. 웰 당 100 μL의 세포 현탁액을 플레이트하고, 혼합함으로써 이 현탁액의 균질성을 유지하도록 보장한다. 세포를 약 70%-80% 컨플루언시가 될 때까지 배지를 변화시키지 않고 37°C 인큐베이터(5%_CO2 및 95% 습도)에서 48시간 동안 성장시킨다.
2. 세포를 합류시키고 48 h 동안 동일한 배지에서 배양하여 금식시킨다. 원하는 공복 이화 상태에 따라 24-72 h에서 배양 시간을 변화시킨다.

3. 3T3-L1 세포의 굶주림

1. 96-웰 플레이트에 있는 세포로부터의 데칸트 배지. 멸균 종이 타월을 사용하여 나머지 액체를 흡수하십시오.
2. 96-웰 플레이트를 웰 당 100 μL의 PBS로 헹구고 남은 유체를 멸균 종이 타월로 흡수한다.
3. 웰 당 100 μL의 글루코스가 없는 DMEM을 첨가하고, 40분 동안 인큐베이션한다. 세포 유형, 자극 및 원하는 금식 수준에 따라 배양 시간을 조정하십시오.
   참고 : 인큐베이션 시간은 계절에 따라 최적화가 필요할 수 있습니다.

4. 다양한 농도의 FD-글루코스 용액의 제조

참고: 그림 2 의 실험은 인슐린 자극 유무에 관계없이 세포외 및 세포간 배지를 검사합니다.

1. 각 자극 조건에 대해 여덟 번의 반복실험(96웰 플레이트에서 한 줄)을 사용합니다. 따라서, 각 자극 조건에 대해 1 mL를 준비한다( 표 2 및 하기에 특정됨).
2. 인슐린이 없는 여덟 가지 자극 조건을 사용하십시오: 하나의 96웰 플레이트에서 2.5 μg/mL, 1 μg/mL, 0.5 μg/mL, 0.2 μg/mL, 0.1 μg/mL, 0.05 μg/mL 및 0 μg/mL(FD-글루코스 없이 대조군)의 FD-글루코스.
3. 인슐린 (10 μg/mL, 최종 농도)과 함께 여덟 가지 자극 조건을 사용하십시오 : 2.5 μg / mL의 FD 포도당, 1 μg / mL, 0.5 μg / mL, 0.2 μg / mL, 0.1 μg / mL, 0.05 μg / mL 및 0 μg / mL (FD 포도당이없는 대조군)를 다른 96 웰 플레이트에서 사용하십시오.
4. 자극 조건을 준비하기 위해, 999 μL의 글루코스가 없는 DMEM에 5 mg/mL FD-글루코스 작동 용액 1 μL를 희석하여 1 mL의 작업 원액(1:1000 희석 또는 5 μg/mL)을 얻었다.
   1. 이 작업 원액을 사용하여 1:2000, 1:5000, 1:10,000, 1:25,000, 1:50,000 및 1:100,000 희석액의 FD-글루코스를 준비하여 2.5 μg/mL, 1 μg/mL, 0.5 μg/mL, 0.2 μg/mL, 0.1 μg/mL 및 0.05 μg/mL(표 2)를 조명이 없는 생물 안전 캐비닛에서 실험 직전에 2 mL 튜브에 넣습니다.
5. 4.4단계를 반복하고 위에 명시된 각 조건에 인슐린 1μL(10mg/mL, 최종 농도)를 추가합니다.
   참고: 이 샘플에서 인슐린의 최종 농도는 10 μg/mL = 1.7 nmol/mL입니다. 균질화를 달성하려면 다른 용액을 추가하기 전에 튜브에 인슐린을 첨가하십시오.

5. 굶주린 3T3-L1 세포 치료

1. 40분 인큐베이션 후, 96-웰 플레이트에서 각 웰로부터 글루코스가 없는 DMEM을 데칸트하고 나머지 유체를 멸균 종이 타월로 흡수한다.
2. 상기에 기술된 다양한 처리 조건으로부터 각각 100 μL(웰 당)를 하나의 컬럼을 따라 웰에 첨가하고, 동일한 처리 조건으로부터 100 μL(웰 당)를 두 96-웰 플레이트 모두에서 행(8회 반복실험)을 따라 웰에 첨가한다. 인슐린 유무에 관계없이 조건을 활용한 플레이트에 라벨을 붙입니다. 무글루코스 DMEM 단독을 대조군 웰에 첨가한다(n=8).
3. 플레이트를 어둠 속에서 세포 배양 인큐베이터(37°C, 5%_CO2, 및 95% 습도)에서 40분 동안 인큐베이션한다.

6. 자극된 3T3-L1 세포에 대한 세포외 및 세포간 측정

1. 세포를 40분 동안 자극한 후, 두 플레이트로부터 자극 배지를 동일한 실험 레이아웃을 유지하는 새로운 96-웰 플레이트로 옮긴다.
2. 멸균 종이 타월에 세포가있는 원래의 자극 된 96 웰 플레이트에서 남아있는 용액을 데칸트하십시오.
3. 임의로, 세포를 PBS로 세척한다. PBS를 제거하고 멸균 종이 타월에 남아있는 용액을 데칸트하십시오.
4. 100 μL의 RIPA 용해 완충액을 각 웰에 첨가한다. 임의로, 단백질을 보호하기 위해 프로테아제 억제제를 RIPA 완충액에 첨가한다. RIPA가 들어있는 플레이트를 셰이커에 30분 동안 놓습니다.
5. 마이크로플레이트 리더 (표 of Materials)를 사용하여, 각각 485 및 535 nm의 여기(Ex) 및 방출(Em) 파장에서 형광을 측정하고, 먼저 세포외 FD-글루코스를 함유하는 배지에서, 이어서, 플레이트를 RIPA-용해된 세포와 함께 30분 인큐베이션의 끝에서 (단계 6.4 참조).

7. 세포 내 포도당 흡수의 단백질 기반 정상화

참고: 세포내 FD-글루코스 흡수는 세포 수에 따라 다릅니다. 세포 용해물의 단백질 수준은 각 웰의 세포 수에 대한 세포 내 FD-글루코스 수준을 정상화할 수 있는 세포 수에 비례합니다.

1. 제조업체의 지침에 따라 BCA 단백질 분석을 수행하십시오 ( 물질 표 참조). RIPA-용해된 세포를 함유하는 각 웰에서의 단백질 농도를 정량화한다.
2. 10μL의 RIPA 균질액을 사용하고 삼중으로 단백질 농도를 측정하여 96웰 플레이트에서 측정의 정확도를 높입니다.
3. 각 96웰 플레이트의 샘플과 함께 분석한 단백질 표준물질(0, 10, 20, 30, 40, 50 및 60 μg/mL 단백질)을 기반으로 단백질을 정량화합니다.
4. 562nm에서 흡광도를 측정하고 단백질 표준에 대해 얻은 선형 회귀 공식을 기반으로 각 샘플의 단백질 농도를 정량화합니다.
5. 각 웰에서 형광 값 / 단백질 농도를 사용하여 세포 내 FD-포도당 수준을 정상화하십시오. 세포외 FD-글루코스 고갈은 정상화를 필요로 하지 않는다.
6. 선택적으로, 추가 정규화를 위해 대조군 샘플의 평균 기준선 값을 사용하십시오(100%).

8. 장기의 세포외 FD 포도당 고갈의 생체외 측정

1. 마우스를 장기 해부 전에 포도당 대사를 자극하는 화합물로 전처리하면 다음과 같다.
2. 아홉 주 된 Lep^ob 수컷 마우스(n=11)를 사용한다. 실험 전에 모든 마우스에게 정기적 인 차우 식단을 먹이십시오.
3. 마우스를 복강내(i.p.) 주사를 위해 무작위로 세 그룹으로 할당한다.
   1. 대조군 Lep^ob 그룹으로부터의 마우스를 0.1 mL의 멸균 PBS (n=4)와 함께 주입한다.
   2. 인슐린 Lep^ob 그룹으로부터의 마우스를 체중 (BW) 그램 당 12 IU의 인간 인슐린을 함유하는 멸균 PBS 0.1 mL와 함께 주사한다 (n=3).
   3. AAC2 Lep^ob 그룹으로부터의 마우스를 체중 (BW) 그램 당 0.1 nmol AAC2를 함유하는 멸균 PBS 0.1 mL와 함께 주입한다 (n=4).
4. 15분 후, 피험자 마우스는 5% 이소플루란을 흡입하고 마취된 동물²⁶으로부터 심장 천자에 의해 혈액을 exsanguinate한다.
5. 각 동물로부터 내장 epidydimal 백색 지방 조직 (200 mg), 간 (200 mg) 및 전뇌를 해부하십시오. 조직 취급을 위해 Class II 생물 안전 후드를 사용하십시오.
6. 빛이 없는 클래스 II 생물안전 캐비닛에서 글루코스가 없는 DMEM에 FD-글루코스(0.29mM) 작업 용액을 준비합니다.
7. 마이크로플레이트 판독기를 사용하여 각각 485 및 535 nm의 여기 및 방출 파장에서 FD-글루코스 작동 용액 (0.29 mM)의 형광을 측정하였다.
8. 수확된 조직/기관을 PBS를 함유하는 6-웰 플레이트에서 1분 동안 인큐베이션한다. 각 조직이나 기관을 별도의 우물에서 다루십시오.
9. 1분 후, 각 조직을 멸균된 종이 타월 위에 올려놓고 PBS를 흡수한다. 조직/장기를 4,000μL의 글루코스가 없는 DMEM을 함유하는 별도의 6-웰 플레이트에 옮기고 2분 동안 배양한다.
10. 2분 후, 조직을 제거하고 0.29mM FD-글루코스 작동 용액(1mL/웰)이 들어있는 6-웰 플레이트의 웰로 옮깁니다. 조직을 함유하는 6-웰 플레이트를 FD-글루코스 작동 용액에서 37°C(5%_CO2 및 95% 습도)에서 인큐베이션한다.
11. 0, 10, 20, 30, 40, 60, 90, 및 120분 배양 후 각 웰로부터 FD-글루코스 작동 용액 100 μL를 수집하여, 세포외 FD 글루코스 고갈의 동역학을 분석하였다. 수집 전후에 흔들어 주십시오.
12. 100 μL의 FD-글루코오스 작동 용액을 96-웰 플레이트로 옮기고, 마이크로플레이트 판독기를 사용하여 각각 485 및 535 nm의 여기 및 방출 파장에서 형광을 측정하였다.
13. 형광을 각 동물의 각 장기에 대해 0분 값(100%)으로 정규화합니다(그림 3).

결과

세포내 섭취 및 세포외 글루코스 고갈은 인슐린 자극 유무에 관계없이 FD-글루코오스의 상이한 농도(도 2)에 반응하여 3T3-L1 지방전구세포에서 측정되었다. 도 2A는 FD-글루코스의 세포내 흡수의 용량-의존적 증가를 보여주며, 이는 인슐린의 존재하에서 유의하게 증가되었다. 동일한 세포에서 세포외 FD-글루코오스의 수반되는 감소는 도 2B...

토론

세포외 FD-글루코스 고갈과 세포 배양에서의 정상화된 세포내 글루코스 흡수의 직접적인 비교는 높은 상관관계를 나타냈으며, 이는 세포외 글루코스 고갈이 글루코스 흡수 평가를 위한 대리 측정이 될 수 있음을 시사한다. 세포외 FD-글루코스의 측정은 광범위한 FD 글루코스 농도를 사용할 수 있으며, 또한 0.5-2.5 μg FD-글루코스 / mL가 최적의 범위를 제공하는 것으로 보입니다. 세포외 FD-글루코오스?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
3T3-L1 mouse fibroblasts	ATCC	CL-173	Cell line
96-well plates	Falcon	353227	Plastic ware
B6.V-Lepob/J male mice	Jackson Laboratory	stock number 000632	Mice
BioTek Synergy H1 modular multimode microplate reader (Fisher Scientific, US)	Fisher Scientific, US	B-SHT	Device
Bovine serum	Gibco/ThermoFisher	161790-060	Cell culture
Calf serum	Gibco/ThermoFisher	26010-066	Cell culture
Cell incubator	Forma	Series II Water Jacket	Device
Diet (mouse/rat diet, irradiated)	Envigo	Teklad LM-485	Diet
Dimethylsulfoxide (DMSO)	Sigma LifeScience	D2650-100mL	Reagent
Dulbecco's Modified Eagle Medium	Gibco/ThermoFisher	11965-092	Cell culture
Ethanol	Sigma Aldrich	E7023-500mL	Reagent
Fluorescent 2-deoxy-2-[(7-nitro-2,1,3-benzoxadiazol-4-yl) amino]-D-glucose)	Sigma	72987-1MG	Assay
Glucose-free and phenol red-free DMEM	Gibco/ThermoFisher	A14430-01	Cell culture
Human insulin 10 mg/mL	MilliporeSigma, Cat N 91077C	Cat N 91077C	Reagent
Isoflurane, 5%	Henry Schein	NDC 11695-6776-2	Anestaetic
Penicillin/streptomycin (P/S)	Gibco/ThermoFisher	15140-122	Cell culture
Phosphate buffered solution	Sigma-Aldrich	DA537-500 mL	Cell culture
Pierce bicinchoninic acid (BCA) protein assay	ThermoFisher	Cat N23225	Assay
Radioimmunoprecipitation assay lysis buffer	Santa Cruz Biotechnology	sc-24948	Assay
Trypsin-EDTA (0.05%)	Gibco/ThermoFisher	25300-054	Cell culture