细胞外葡萄糖消耗作为细胞和组织离体葡萄糖摄取的间接测量

摘要

荧光标记的葡萄糖的细胞外消耗与葡萄糖摄取相关，可用于切除器官和细胞培养物中葡萄糖摄取的高通量筛选。

摘要

糖尿病的持续全球流行增加了对识别影响葡萄糖摄取的环境，营养，内分泌，遗传和表观遗传因素的需求。细胞内荧光的测量是一种广泛使用的方法，用于在 体外测试细胞中荧光标记的葡萄糖（FD-葡萄糖）的摄取，或用于 在体内对消耗葡萄糖的组织进行成像。该测定在选定的时间点评估葡萄糖摄取。细胞内分析假设FD-葡萄糖的代谢慢于内源性葡萄糖的代谢，内源性葡萄糖参与分解代谢和合成代谢反应和信号传导。然而，动态葡萄糖代谢也会改变摄取机制，这需要对不同因素的葡萄糖摄取进行动力学测量。本文介绍了一种测量细胞外FD-葡萄糖消耗的方法，并验证了其与细胞和组织 离体细胞中细胞内FD-葡萄糖摄取的相关性。细胞外葡萄糖消耗可能潜在地适用于高通量动力学和剂量依赖性研究，以及鉴定具有血糖活性的化合物及其组织特异性作用。

引言

对测量葡萄糖摄取的需求随着解决依赖葡萄糖代谢的多种疾病的流行病增加的迫切需要而增加。退行性代谢性疾病、神经和认知障碍¹、炎症² 和传染病³、癌症^4、5 以及衰老⁶ 的潜在机制取决于葡萄糖代谢的能量及其储存、合成代谢过程、蛋白质和基因修饰、信号传导、基因调节以及核酸的合成和复制^7，8，9.糖尿病（DM）与葡萄糖摄取调节功能障碍直接相关。糖尿病是一系列慢性疾病，如1型，-2型和-3型糖尿病，妊娠期糖尿病，年轻人的成熟期发病型糖尿病，以及由环境和/或遗传因素诱导的其他类型的这种疾病。2016年，世卫组织第一份关于糖尿病的全球报告显示，自1980年以来，患有最广泛糖尿病的成年人数量几乎翻了两番，达到4.22亿成年人¹⁰人，而这一糖尿病患者人数在过去几十年中呈指数级增长。仅在2019年，估计就有150万例死亡是由¹⁰地中海米直接造成的。这种戏剧性的激增是由于2型糖尿病的增加和驱动它的条件，包括超重和肥胖¹⁰。COVID-19大流行显示，与普通人群相比，糖尿病患者的死亡率增加了两倍，这表明葡萄糖代谢在^{免疫防御中的作用}深刻但知之甚少3。糖尿病、肥胖症和其他疾病的预防、早期诊断和治疗需要优化不同组织对葡萄糖摄取的测量，并确定影响葡萄糖摄取的环境¹¹、营养¹²、内分泌¹³、遗传¹⁴ 和表观遗传¹⁵ 个因素。

在研究中，细胞内和/或组织对葡萄糖的摄取通常通过体外^16，17，18和体内¹⁹中的荧光标记葡萄糖（FD-葡萄糖）来测量。与使用放射性标记葡萄糖²⁰，分析质谱分析21，代谢组学²²，核磁共振方法²³和正电子发射断层扫描/计算机断层扫描（PET / CT）^5，24的更精确方法相比，FD-葡萄糖成为首选方法。与FD-葡萄糖摄取不同，需要更多生物材料的分析方法可能涉及多步骤样品制备，昂贵的仪器和复杂的数据分析。细胞培养物中FD-葡萄糖摄取的有效且廉价的测量已被用于概念验证实验，并且可能需要通过其他方法进行验证。

FD-葡萄糖应用于葡萄糖摄取研究的基础是与内源性葡萄糖²⁵相比，FD-葡萄糖的代谢减少。尽管如此，内源性葡萄糖和FD-葡萄糖都动态分布在所有细胞区室中，用于合成代谢，分解代谢和信号传导过程。FD-葡萄糖的区室化和时间依赖性处理²⁵ 干扰荧光测量，并且是在高通量筛选实验，动力学分析，3D细胞培养，共培养和组织外植体实验中使用该测定的主要限制因素。在这里，我们提供的数据证明了FD-葡萄糖的细胞外消耗与其细胞内摄取之间存在高度相关性，这表明FD-葡萄糖的细胞外消耗作为细胞内葡萄糖摄取的替代测量。应用葡萄糖细胞外消耗的测量来验证用胰岛素治疗的小鼠和实验药物¹⁸ 中葡萄糖摄取的组织特异性差异，以提供该方法的原理证明。

目前的方案描述了3T3-L1细胞中FD-葡萄糖摄取的细胞内和细胞外（图1）测量。方案1-7解释了细胞的培养和生长48小时;细胞饥饿，刺激和基线细胞外测量;和细胞外FD-葡萄糖的刺激后测量和FD-葡萄糖和蛋白质的细胞内测量。协议第8部分描述了在存在和不存在胰岛素和氨基酸化合物2（AAC2）的情况下从ob / ob小鼠解剖的组织中FD-葡萄糖的细胞外摄取的体外测量，该方法在其他地方描述¹⁸。

研究方案

动物研究由俄亥俄州立大学机构动物护理和使用委员会批准（OSU，协议2007A0262-R4）。

注意:所有程序必须在鼓风机打开和熄灯的II类生物安全柜中完成。

1. 材料准备

注:所有材料均列在 材料表中。

1. 根据 表 1，在II类生物安全柜中制备培养基1，离心培养基2，并将荧光2-脱氧-2-[（7-硝基-2，1，3-苯并恶二唑-4-基）氨基]-D-葡萄糖（2-NBDG或FD-葡萄糖）储存和工作溶液。通过关闭引擎盖下的所有灯，在整个实验过程中保护FD-葡萄糖免受光照。
2. 使用即用型细胞培养试剂:胰蛋白酶-EDTA、磷酸盐缓冲盐水 （PBS） 以及无葡萄糖和无酚红杜贝科的改性 Eagle 培养基（以下简称无葡萄糖 DMEM）。
3. 使用20 mL放射免疫沉淀测定（RIPA）裂解缓冲液。
   注意:在以下部分中，比较了有和没有胰岛素刺激的3T3-L1成纤维细胞中不同FD-葡萄糖剂量的细胞外消耗和细胞内摄取（图2）。

2. 3T3-L1细胞培养与维护

1. 通过在两个⁹⁶ 孔板中将稀释在20mL培养基1中的1×10 6个细胞来培养3T3-L1小鼠成纤维细胞。每孔板100μL细胞悬浮液，确保通过混合保持该悬浮液的均匀性。在37°C培养箱（5%CO₂ 和95%湿度）中培养细胞48小时，而不改变培养基，直到约70%-80%汇合。
2. 通过将细胞在同一培养基中培养48小时来维持细胞汇合和禁食。根据所需的空腹分解代谢状态，将孵育时间从24-72小时改变。

3. 3T3-L1细胞饥饿

1. 从96孔板中的细胞中滗出培养基。使用无菌纸巾吸收剩余的液体。
2. 用每孔100μLPBS冲洗96孔板，并用无菌纸巾吸收剩余的液体。
3. 每孔加入100μL无葡萄糖DMEM并孵育40分钟。根据细胞类型，刺激和所需的禁食水平调整孵育时间。
   注意:根据季节的不同，孵化时间可能需要优化。

4. 不同浓度FD-葡萄糖溶液的制备

注意: 图2 中的实验检查了有和没有胰岛素刺激的细胞外和细胞间培养基。

1. 对每种刺激条件使用八个重复（96孔板中的一行）。因此，为每种刺激条件准备1 mL（在 表2 和下表中指定）。
2. 在一个 96 孔板中使用 8 种无胰岛素的刺激条件:2.5 微克/毫升、1 微克/毫升、0.5 微克/毫升、0.2 微克/毫升、0.1 微克/毫升、0.05 微克/毫升和 0 微克/毫升（不含 FD 葡萄糖的对照）。
3. 使用八种刺激条件与胰岛素（10微克/毫升，终浓度）:在另一个96孔板中，FD-葡萄糖为2.5微克/毫升，1微克/毫升，0.5微克/毫升，0.2微克/毫升，0.1微克/毫升，0.05微克/毫升和0微克/毫升（不含FD-葡萄糖的对照）。
4. 为了制备刺激条件，在999μL无葡萄糖DMEM中稀释1μL5mg / mL FD-葡萄糖工作溶液（表1），以获得1mL工作储备溶液（1:1000稀释或5μg/ mL）。
   1. 使用该工作储备溶液，在2 mL管中制备1:2000，1:5000，1:10，000，1:25，000，1:50，000和1:100，000稀释的FD-葡萄糖，以获得2.5μg/ mL，1μg/ mL，0.5μg/ mL，0.2μg/ mL，0.1μg/ mL和0.05μg/ mL（表2）在实验前立即在没有灯的生物安全柜中。
5. 重复步骤4.4，并向上述每种条件下加入1μL胰岛素（10mg / mL，终浓度）。
   注意:这些样品中胰岛素的最终浓度为10微克/毫升= 1.7纳摩尔/毫升。为了实现均质化，在添加其他溶液之前将胰岛素添加到管中。

5. 治疗饥饿的3T3-L1细胞

1. 孵育40分钟后，将每个孔中的无葡萄糖DMEM倾倒在96孔板中，并用无菌纸巾吸收剩余的液体。
2. 从上述各种处理条件中各向沿一列的孔中加入100μL（每孔），并从相同的处理条件向沿两个96孔板的行孔（8个重复）加入100μL（每孔）。标记利用胰岛素和不含胰岛素的条件的板。将无葡萄糖DMEM单独添加到对照孔中（n = 8）。
3. 在黑暗中的细胞培养箱（37°C，5%CO₂和95%湿度）中孵育板40分钟。

6. 受激3T3-L1细胞的细胞外和细胞间测量

1. 在细胞被刺激40分钟后，将刺激培养基从两个板转移到新的96孔板中，保持相同的实验布局。
2. 从原始的受刺激的96孔板中倾析任何剩余的溶液，并在无菌纸巾上加入细胞。
3. 或者，用PBS清洗电池。取出PBS并将任何剩余的溶液倒在无菌纸巾上。
4. 向每个孔中加入100μL RIPA裂解缓冲液。任选地，将蛋白酶抑制剂添加到RIPA缓冲液中以保护蛋白质。将含有RIPA的板放入振荡器中30分钟。
5. 使用酶标仪（材料表），首先在含有细胞外FD-葡萄糖的培养基中分别测量激发（Ex）和发射（Em）波长为485和535nm的荧光，然后在30分钟孵育结束时用RIPA裂解的细胞平板（参见步骤6.4）。

7. 基于蛋白质的细胞内葡萄糖摄取正常化

注意:细胞内FD-葡萄糖摄取取决于细胞数量。细胞裂解物中的蛋白质水平与细胞数量成正比，细胞数量允许将细胞内FD-葡萄糖水平与每个孔中的细胞数量归一化。

1. 根据制造商的说明进行BCA蛋白测定（参见 材料表）。量化含有RIPA裂解细胞的每个孔中的蛋白质浓度。
2. 使用10μL RIPA匀浆物，一式三份测量蛋白质浓度，以提高96孔板测量的准确性。
3. 根据蛋白质标准品（0、10、20、30、40、50 和 60 μg/mL 蛋白质）与每个 96 孔板上的样品一起分析蛋白质定量。
4. 测量562nm处的吸光度，并根据为蛋白质标准品获得的线性回归公式量化每个样品中的蛋白质浓度。
5. 通过使用每个孔中的荧光值/蛋白质浓度来使细胞内FD-葡萄糖的水平正常化。细胞外 FD-葡萄糖耗竭不需要正常化。
6. （可选）使用对照样本中的平均基线值进行额外的归一化 （100%）。

8. 器官细胞外FD葡萄糖消耗的 离体 测量

1. 在器官解剖前用刺激葡萄糖代谢的化合物预处理小鼠，如下所示。
2. 使用9周大 的Lep^ob 雄性小鼠（n = 11）。在实验前用常规的chow饮食喂养所有小鼠。
3. 将小鼠随机分成三组进行腹膜内（IP）注射。
   1. 向来自对照 Lep^ob 组的小鼠注射0.1mL无菌PBS（n = 4）。
   2. 向来自胰岛素 Lep^ob 组的小鼠注射0.1mL无菌PBS，每克体重（BW）含有12 IU人胰岛素（n = 3）。
   3. 向来自AAC2 Lep^ob 组的小鼠注射0.1mL无菌PBS，每克体重（BW）含有0.1 nmol AAC2（n = 4）。
4. 15分钟后，通过心脏穿刺从麻醉动物²⁶中吸入5%异氟醚和血外血。
5. 夹层内脏表皮白色脂肪组织（200毫克），肝脏（200毫克）和每只动物的全脑。使用II类生物安全罩进行组织处理。
6. 在没有光的II类生物安全柜中制备无葡萄糖DMEM中的FD-葡萄糖（0.29 mM）工作溶液。
7. 使用酶标仪分别在485和535nm的激发和发射波长下测量FD-葡萄糖工作溶液（0.29 mM）的荧光。
8. 将收获的组织/器官在含有PBS的6孔板中孵育1分钟。在单独的孔中处理每个组织或器官。
9. 1分钟后，将每张纸巾放在无菌纸巾上以吸收PBS。将组织/器官转移到含有4，000μL无葡萄糖DMEM的单独6孔板中，并孵育2分钟。
10. 2分钟后，取出组织并将其转移到含有0.29mM FD-葡萄糖工作溶液（1mL /孔）的6孔板的孔中。将含有组织的6孔板在37°C（5%CO₂ 和95%湿度）下孵育在FD-葡萄糖工作溶液中。
11. 在孵育0，10，20，30，40，60，90和120分钟后从每个孔中收集100μLFD-葡萄糖工作溶液，以分析细胞外FD葡萄糖消耗的动力学。收集前后摇晃。
12. 使用酶标仪将100μLFD-葡萄糖工作溶液转移到96孔板中，以分别测量485和535nm的激发和发射波长下的荧光。
13. 将荧光归一化为每只动物中每个器官的0分钟值（100%）（图3）。

结果

在3T3-L1前脂肪细胞中测量细胞内摄入和细胞外葡萄糖消耗，以响应不同浓度的FD-葡萄糖（图2），有和没有胰岛素刺激。 图2A 显示FD-葡萄糖细胞内摄取的剂量依赖性增加，在胰岛素存在下显着增加。 图2B显示了相同细胞中细胞外FD-葡萄糖的伴随降低，其中胰岛素刺激导致细胞外FD-葡萄糖水平显着降低，与没有胰岛素刺激的样品相?...

讨论

细胞外FD-葡萄糖消耗与细胞培养中归一化的细胞内葡萄糖摄取的直接比较显示出高度相关性，这表明细胞外葡萄糖消耗可能是葡萄糖摄取评估的替代测量。细胞外FD-葡萄糖的测量可以使用广泛的FD葡萄糖浓度，并且0.5-2.5μg FD-葡萄糖/mL似乎提供了最佳范围。细胞外FD-葡萄糖不需要归一化为细胞内FD-葡萄糖摄取所需的细胞数量或蛋白质浓度。细胞外FD-葡萄糖测量的预期局限性是研究活性氧诱导剂和外...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
3T3-L1 mouse fibroblasts	ATCC	CL-173	Cell line
96-well plates	Falcon	353227	Plastic ware
B6.V-Lepob/J male mice	Jackson Laboratory	stock number 000632	Mice
BioTek Synergy H1 modular multimode microplate reader (Fisher Scientific, US)	Fisher Scientific, US	B-SHT	Device
Bovine serum	Gibco/ThermoFisher	161790-060	Cell culture
Calf serum	Gibco/ThermoFisher	26010-066	Cell culture
Cell incubator	Forma	Series II Water Jacket	Device
Diet (mouse/rat diet, irradiated)	Envigo	Teklad LM-485	Diet
Dimethylsulfoxide (DMSO)	Sigma LifeScience	D2650-100mL	Reagent
Dulbecco's Modified Eagle Medium	Gibco/ThermoFisher	11965-092	Cell culture
Ethanol	Sigma Aldrich	E7023-500mL	Reagent
Fluorescent 2-deoxy-2-[(7-nitro-2,1,3-benzoxadiazol-4-yl) amino]-D-glucose)	Sigma	72987-1MG	Assay
Glucose-free and phenol red-free DMEM	Gibco/ThermoFisher	A14430-01	Cell culture
Human insulin 10 mg/mL	MilliporeSigma, Cat N 91077C	Cat N 91077C	Reagent
Isoflurane, 5%	Henry Schein	NDC 11695-6776-2	Anestaetic
Penicillin/streptomycin (P/S)	Gibco/ThermoFisher	15140-122	Cell culture
Phosphate buffered solution	Sigma-Aldrich	DA537-500 mL	Cell culture
Pierce bicinchoninic acid (BCA) protein assay	ThermoFisher	Cat N23225	Assay
Radioimmunoprecipitation assay lysis buffer	Santa Cruz Biotechnology	sc-24948	Assay
Trypsin-EDTA (0.05%)	Gibco/ThermoFisher	25300-054	Cell culture