Esgotamento da glicose extracelular como medida indireta de captação de glicose em células e tecidos Ex Vivo

Resumo

O esgotamento extracelular da glicose fluorescente se correlaciona com a absorção de glicose e pode ser usado para triagem de alto rendimento da absorção de glicose em órgãos excisados e culturas celulares.

Resumo

A epidemia mundial de diabetes aumenta a demanda pela identificação de fatores ambientais, nutricionais, endócrinos, genéticos e epigenéticos que afetam a absorção de glicose. A medição da fluorescência intracelular é um método amplamente utilizado para testar a absorção de glicose fluorescente (FD-glicose) em células in vitro, ou para tecidos que consomem glicose em imagens in vivo. Este ensaio avalia a absorção de glicose em um ponto de tempo escolhido. A análise intracelular pressupõe que o metabolismo da fd-glicose é mais lento do que o da glicose endógena, que participa de reações catabólicas e anabólicos e sinalização. No entanto, o metabolismo dinâmico da glicose também altera os mecanismos de absorção, o que exigiria medidas cinéticas de absorção de glicose em resposta a diferentes fatores. Este artigo descreve um método para medir o esgotamento extracelular da glicose FD e valida sua correlação com a absorção intracelular de FD-glicose em células e tecidos ex vivo. O esgotamento extracelular da glicose pode ser potencialmente aplicável para estudos cinéticos e dependentes de doses de alta produtividade, bem como identificar compostos com atividade glicêmica e seus efeitos específicos do tecido.

Introdução

A demanda por medição da absorção de glicose aumenta juntamente com a necessidade crítica de enfrentar um aumento epidêmico em uma infinidade de doenças dependentes do metabolismo da glicose. Os mecanismos subjacentes de doenças metabólicas degenerativas, distúrbios neurológicos e cognitivos¹, inflamatório² e doenças infecciosas³, câncer ^4,5, bem como envelhecimento⁶, dependem do metabolismo de glicose para energia e seu armazenamento, processos anabólicos, inflamação de proteínas e genes, sinalização, regulação de genes e síntese de ácidos nucleicos e replicação ^7,8,9 . Diabetes mellitus (DM) está diretamente relacionada ao mau funcionamento da regulação da absorção de glicose. DM é um espectro de doenças crônicas como tipo-1, -2 e -3 diabetes mellitus, diabetes gestacional, diabetes de início de maturidade dos jovens e outros tipos dessa doença induzidas por fatores ambientais e/ou genéticos. Em 2016, o primeiro relatório global da OMS sobre diabetes demonstrou que o número de adultos vivendo com o DM mais difundido quase quadruplicou desde 1980 para 422 milhões de adultos¹⁰, e esse número de pacientes com DM tem aumentado exponencialmente nas últimas décadas. Só em 2019, a estimativa de 1,5 milhão de mortes foi diretamente causada pelo DM¹⁰. Esse aumento dramático deve-se ao aumento do DM tipo 2 e às condições que o conduzem, incluindo sobrepeso e obesidade¹⁰. A pandemia COVID-19 revelou um aumento de duas vezes na mortalidade em pacientes com DM em comparação com a população geral, sugerindo o papel profundo, mas mal compreendido, do metabolismo da glicose na defesa imunológica³. Prevenção, diagnóstico precoce e tratamento de DM, obesidade e outras doenças requerem otimização das medidas de captação de glicose por diferentes tecidos, e identificação de fatores ambientais¹¹, nutricionais¹², endócrinos¹³,^{genéticos 14} e¹⁵ fatores epigenéticos que afetam a captação de glicose.

Em pesquisa, a absorção intracelular e/ou tecidual de glicose é comumente medida por glicose fluorescente (FD-glicose) in vitro 16,17,18 e in vivo¹⁹. A fD-glicose tornou-se um método preferido em comparação com métodos mais precisos usando glicose radioativamente rotulada²⁰, análise de espectroscopia de massa analítica²¹, metabolômica²², métodos de ressonância magnética nuclear²³ e tomografia/tomografia computadorizada de emissão de pósitrons (PET/CT)^5,24. Ao contrário da absorção de glicose FD, métodos analíticos que requerem mais material biológico podem envolver uma preparação de amostras em várias etapas, instrumentos caros e análise de dados complexos. Medições eficazes e baratas da absorção de FD-glicose nas culturas celulares têm sido utilizadas em experimentos de prova de conceito e podem exigir validação por outros métodos.

A base da aplicação de FD-glicose para estudos de absorção de glicose é o metabolismo reduzido de FD-glicose em comparação com a glicose endógena²⁵. No entanto, tanto a glicose endógena quanto a fd-glicose são distribuídas dinamicamente entre todos os compartimentos celulares para uso em processos anabólicos, catabólicos e de sinalização. A compartimentação e o processamento dependente do tempo²⁵ de FD-glicose interferem nas medidas de fluorescência, e representam os principais fatores limitadores para o uso deste ensaio em experimentos de triagem de alto rendimento, análise cinética, cultura celular 3D, co-culturas e experimentos de explant tecidual. Aqui, fornecemos dados demonstrando uma alta correlação entre o esgotamento extracelular da glicemia FD e sua absorção intracelular, sugerindo o esgotamento extracelular da fd-glicose como uma medida substituta para absorção intracelular de glicose. A medição do esgotamento extracelular da glicose foi aplicada para validar diferenças específicas de tecido na absorção de glicose em camundongos tratados com insulina e uma droga experimental¹⁸ para fornecer uma prova de princípio deste método.

O protocolo atual descreve medições intracelulares e extracelulares (Figura 1) da absorção de fd-glicose em células 3T3-L1. As seções de protocolo 1-7 explicam a cultura e o crescimento das células por 48 h; fome celular, estimulação e medidas extracelulares de linha de base; e medidas pós-estimulação de medidas extracelulares de FD-glicose e medidas intracelulares de FD-glicose e proteína. A seção 8 do protocolo descreve a medição ex vivo da absorção extracelular de fd-glicose em tecidos dissecados de camundongos ob/ob na presença e ausência de insulina e composto de aminoácidos 2 (AAC2) descritos em outros lugares¹⁸.

Protocolo

Os estudos em animais foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Universidade Estadual de Ohio (OSU, protocolo 2007A0262-R4).

NOTA: Todos os procedimentos devem ser feitos em um armário de biossegurança classe II com o soprador ligado e as luzes apagadas.

1. Preparação de materiais

NOTA: Todos os materiais estão listados na Tabela de Materiais.

1. Prepare o Medium 1, centrifugação Média 2, e soluções de armazenamento e trabalho fluorescentes de fluorescente 2-desoxi-2-[(7-nitro-2,1,3-benzoxadiazol-4-yl) amino]-D-glicose (2-NBDG ou FD-glicose) de acordo com a Tabela 1 em um armário de biossegurança classe II. Proteja a glicose FD da luz durante todo o experimento, desligando todas as luzes sob o capô.
2. Use reagentes prontos para a cultura celular: Trypsin-EDTA, soro fisiológico tamponado com fosfato (PBS) e sem glicose e sem fenol Dulbecco's Modified Eagle Medium (doravante, DMEM sem glicose).
3. Use 20 mL de teste de radioimunoprecipitação (RIPA) tampão de lise.
   NOTA: Nas seções a seguir, o esgotamento extracelular e a absorção intracelular de diferentes doses de FD-glicose são comparados em fibroblastos 3T3-L1 com e sem estimulação de insulina (Figura 2).

2. Cultura e manutenção celular 3T3-L1

1. Fibroblastos de camundongos 3T3-L1 por revestimento de 1 x 10⁶ células diluídas em 20 mL de Medium 1 em duas placas de 96 poços. Placa 100 μL de suspensão celular por poço, garantindo manter a homogeneidade desta suspensão misturando. Cultivar células por 48 h em uma incubadora de 37 °C (5% de CO₂ e 95% de umidade) sem alterar a mídia até cerca de 70%-80% de confluência.
2. Mantenha as células confluentes e jejuadas, culminando-as no mesmo meio por 48 h. Varie o tempo de incubação de 24-72 h, dependendo do estado catabólico de jejum desejado.

3. Fome de células 3T3-L1

1. Mídia decantada de células nas placas de 96 poços. Absorva o fluido restante usando toalhas de papel estéreis.
2. Enxágüe a placa de 96 poços com 100 μL de PBS por poço e absorva o fluido restante com toalhas de papel estéreis.
3. Adicione 100 μL de DMEM sem glicose por poço e incubar por 40 minutos. Ajuste o tempo de incubação dependendo do tipo celular, estímulos e nível de jejum desejado.
   NOTA: O tempo de incubação pode exigir otimização dependendo da estação.

4. Preparação de soluções de FD-glicose com diferentes concentrações

NOTA: O experimento na Figura 2 examina mídias extracelulares e intercelulares com e sem estimulação com insulina.

1. Use oito réplicas (uma linha em uma placa de 96 poços) para cada condição de estimulação. Portanto, prepare 1 mL para cada condição de estimulação (especificada na Tabela 2 e abaixo).
2. Use oito condições de estimulação sem insulina: FD-glicose de 2,5 μg/mL, 1 μg/mL, 0,5 μg/mL, 0,2 μg/mL, 0,1 μg/mL, 0,05 μg/mL e 0 μg /mL (controle sem FD-glicose) em uma placa de 96 poços.
3. Use oito condições de estimulação com insulina (10 μg/mL, concentração final): FD-glicose de 2,5 μg/mL, 1 μg/mL, 0,5 μg/mL, 0,2 μg/mL, 0,1 μg/mL, 0,05 μg/mL e 0 μg/mL (controle sem FD-glicose) em outra placa de 96 poços.
4. Para preparar as condições de estimulação, diluir 1 μL de solução de trabalho de 5 mg/mL FD-glicose (Tabela 1) em 999 μL de DMEM sem glicose para obter 1 mL de solução de estoque de trabalho (1:1000 diluição ou 5 μg/mL).
   1. Usando esta solução de estoque de trabalho, prepare 1:2000, 1:5000, 1:10.000, 1:25.000, 1:50.000, e 1:100.000 diluições de FD-glicose para obter 2,5 μg/mL, 1 μg/mL, 0,5 μg/mL, 0,2 μg/mL, 0,1 μg/mL e 0,05 μg/mL (Tabela 2) em tubos de 2 mL imediatamente antes de experimentos em um armário de biossegurança sem luzes.
5. Repita o passo 4.4 e adicione 1 μL de insulina (10 mg/mL, concentração final) a cada uma das condições especificadas acima.
   NOTA: A concentração final de insulina nestas amostras é de 10 μg/mL = 1,7 nmol/mL. Para alcançar a homogeneização, adicione insulina aos tubos antes de adicionar outras soluções.

5. Tratar células 3T3-L1 famintas

1. Após 40 minutos de incubação, decante o DMEM livre de glicose de cada poço em placas de 96 poços e absorva o fluido restante com toalhas de papel estéreis.
2. Adicione 100 μL (por poço) cada um das várias condições de tratamento descritas acima a poços ao longo de uma coluna, e 100 μL (por poço) da mesma condição de tratamento aos poços ao longo da linha (oito réplicas) em ambas as placas de 96 poços. Rotule as placas que utilizaram as condições com e sem insulina. Adicione DMEM sem glicose sozinho aos poços de controle (n = 8).
3. Incubar a placa por 40 minutos em uma incubadora de cultura celular (37 °C, 5% DE CO₂ e 95% de umidade) no escuro.

6. Medidas extracelulares e intercelulares para células 3T3-L1 estimuladas

1. Depois que as células tiverem sido estimuladas por 40 minutos, transfira a mídia de estimulação de ambas as placas para novas placas de 96 poços mantendo o mesmo layout experimental.
2. Decante qualquer solução remanescente das placas originais estimuladas de 96 poços com células em toalhas de papel estéreis.
3. Opcionalmente, lave as células com PBS. Remova o PBS e decante qualquer solução restante em toalhas de papel estéreis.
4. Adicione 100 μL do tampão de lise RIPA a cada poço. Opcionalmente, adicione o inibidor de protease ao tampão RIPA para proteger as proteínas. Coloque placas contendo RIPA em um shaker por 30 minutos.
5. Utilizando um leitor de microplaca (Tabela de Materiais), meça fluorescência na excitação (Ex) e comprimentos de onda (Em) de 485 e 535 nm, respectivamente, primeiro no meio contendo fd-glicose extracelular, e depois, a placa com células ripa-lysed no final de 30 min de incubação (ver passo 6.4).

7. Normalização à base de proteínas da absorção de glicose intracelular

NOTA: A absorção intracelular de glicose FD depende do número da célula. Os níveis de proteína nos lises celulares são proporcionais aos números de células que permitem a normalização dos níveis intracelulares de glicose FD ao número de células em cada poço.

1. Realize o ensaio de proteína BCA de acordo com as instruções do fabricante (ver Tabela de Materiais). Quantifique as concentrações proteicas em cada poço contendo células com tinta RIPA.
2. Use 10 μL do HOMOGENate RIPA e meça concentrações proteicas em triplicado para aumentar a precisão das medições em placas de 96 poços.
3. Quantifique a proteína com base nos padrões proteicos (0, 10, 20, 30, 40, 50 e 60 μg/mL de proteína) analisadas juntamente com amostras em cada placa de 96 poços.
4. Meça a absorvância em 562 nm e quantifique concentrações proteicas em cada amostra com base na fórmula de regressão linear obtida para o padrão proteico.
5. Normalize os níveis de glicemia intracelular usando valor/concentração de proteína fluorescente em cada poço. O esgotamento extracelular da glicose FD não requer normalização.
6. Opcionalmente, use os valores médios da linha de base nas amostras de controle para normalização adicional (100%).

8. Medição ex vivo do esgotamento extracelular da glicose FD em órgãos

1. Pré-trar camundongos com compostos estimulando o metabolismo da glicose antes da dissecção do órgão, da seguinte forma.
2. Use camundongos machos Lep^ob de nove semanas de idade (n = 11). Alimente todos os ratos com uma dieta regular de comida antes do experimento.
3. Atribua camundongos aleatoriamente em três grupos para injeções intraperitoneais (i.p.).
   1. Injete camundongos do grupo lep^ob controle com 0,1 mL de PBS estéril (n = 4).
   2. Injete camundongos do grupo insulina Lep^ob com 0,1 mL de PBS estéril, contendo 12 UI insulina humana por grama de peso corporal (BW) (n= 3).
   3. Injete camundongos do grupo AAC2 Lep^ob com 0,1 mL de PBS estéril, contendo 0,1 nmol AAC2 por grama de peso corporal (BW) (n = 4).
4. Após 15 min, submeter camundongos à inalação de 5% de isoflurane e sangue exsanguinado por punção cardíaca dos animais anestesiados²⁶.
5. Disseque tecido adiposo branco epidídmico visceral (200 mgs), fígado (200 mgs) e cérebro inteiro de cada animal. Use uma capa de biossegurança classe II para manuseio de tecidos.
6. Prepare a solução de trabalho FD-glicose (0,29 mM) em DMEM sem glicose em um gabinete de biossegurança classe II sem luz.
7. Meça a fluorescência da solução de trabalho fd-glicose (0,29 mM) em comprimentos de onda de excitação e emissão de 485 e 535 nm, respectivamente, utilizando um leitor de microplaca.
8. Incubar os tecidos/órgãos colhidos em uma placa de 6 poços contendo PBS por 1 min. Manuseie cada tecido ou órgão em um poço separado.
9. Após 1 min, coloque cada tecido em uma toalha de papel estéril para absorver PBS. Transfira tecidos/órgãos para uma placa separada de 6 poços contendo 4.000 μL de DMEM sem glicose e incubar por 2 min.
10. Após 2 min, remova e transfira os tecidos para poços de uma placa de 6 poços contendo solução de trabalho de 0,29 mM FD-glicose (1 mL/well). Incubar as placas de 6 poços contendo tecidos na solução de trabalho fd-glicose a 37 °C (5% DE CO₂ e 95% de umidade).
11. Colete 100 μL de solução de trabalho fd-glicose de cada poço após 0, 10, 20, 30, 40, 60, 90 e 120 min de incubação, para analisar a cinética do esgotamento de glicose FD extracelular. Agite antes e depois da coleta.
12. Transfira 100 μL de solução de trabalho fd-glicose em placas de 96 poços para medir a fluorescência em comprimentos de onda de excitação e emissão de 485 e 535 nm, respectivamente, usando um leitor de microplaca.
13. Normalizar a fluorescência ao valor de 0 min (100%) para cada órgão em cada animal (Figura 3).

Resultados

A ingestão intracelular e o esgotamento extracelular da glicose foram medidos em pré-adipócitos 3T3-L1, em resposta a diferentes concentrações de FD-glicose (Figura 2) com e sem estimulação de insulina. A Figura 2A demonstra um aumento dependente de dose na absorção intracelular da fd-glicose, que foi significativamente aumentada na presença de insulina. A diminuição concomitante da glicemia de FD extracelular nas mesmas células é mostrada na

Discussão

A comparação direta do esgotamento extracelular da glicose FD com a absorção normalizada de glicose intracelular na cultura celular mostrou uma alta correlação, sugerindo que o esgotamento extracelular da glicose poderia ser uma medida substituta para a avaliação da absorção de glicose. A medição da glicemia de FD extracelular pode usar uma ampla gama de concentrações de glicose FD, também 0,5-2,5 μg FD-glicose/mL parecem fornecer a faixa ideal. A glicemia de FD extracelular não requer normalização par...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
3T3-L1 mouse fibroblasts	ATCC	CL-173	Cell line
96-well plates	Falcon	353227	Plastic ware
B6.V-Lepob/J male mice	Jackson Laboratory	stock number 000632	Mice
BioTek Synergy H1 modular multimode microplate reader (Fisher Scientific, US)	Fisher Scientific, US	B-SHT	Device
Bovine serum	Gibco/ThermoFisher	161790-060	Cell culture
Calf serum	Gibco/ThermoFisher	26010-066	Cell culture
Cell incubator	Forma	Series II Water Jacket	Device
Diet (mouse/rat diet, irradiated)	Envigo	Teklad LM-485	Diet
Dimethylsulfoxide (DMSO)	Sigma LifeScience	D2650-100mL	Reagent
Dulbecco's Modified Eagle Medium	Gibco/ThermoFisher	11965-092	Cell culture
Ethanol	Sigma Aldrich	E7023-500mL	Reagent
Fluorescent 2-deoxy-2-[(7-nitro-2,1,3-benzoxadiazol-4-yl) amino]-D-glucose)	Sigma	72987-1MG	Assay
Glucose-free and phenol red-free DMEM	Gibco/ThermoFisher	A14430-01	Cell culture
Human insulin 10 mg/mL	MilliporeSigma, Cat N 91077C	Cat N 91077C	Reagent
Isoflurane, 5%	Henry Schein	NDC 11695-6776-2	Anestaetic
Penicillin/streptomycin (P/S)	Gibco/ThermoFisher	15140-122	Cell culture
Phosphate buffered solution	Sigma-Aldrich	DA537-500 mL	Cell culture
Pierce bicinchoninic acid (BCA) protein assay	ThermoFisher	Cat N23225	Assay
Radioimmunoprecipitation assay lysis buffer	Santa Cruz Biotechnology	sc-24948	Assay
Trypsin-EDTA (0.05%)	Gibco/ThermoFisher	25300-054	Cell culture