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Neste Artigo

  • Resumo
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  • Materiais
  • Referências
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Resumo

O esgotamento extracelular da glicose fluorescente se correlaciona com a absorção de glicose e pode ser usado para triagem de alto rendimento da absorção de glicose em órgãos excisados e culturas celulares.

Resumo

A epidemia mundial de diabetes aumenta a demanda pela identificação de fatores ambientais, nutricionais, endócrinos, genéticos e epigenéticos que afetam a absorção de glicose. A medição da fluorescência intracelular é um método amplamente utilizado para testar a absorção de glicose fluorescente (FD-glicose) em células in vitro, ou para tecidos que consomem glicose em imagens in vivo. Este ensaio avalia a absorção de glicose em um ponto de tempo escolhido. A análise intracelular pressupõe que o metabolismo da fd-glicose é mais lento do que o da glicose endógena, que participa de reações catabólicas e anabólicos e sinalização. No entanto, o metabolismo dinâmico da glicose também altera os mecanismos de absorção, o que exigiria medidas cinéticas de absorção de glicose em resposta a diferentes fatores. Este artigo descreve um método para medir o esgotamento extracelular da glicose FD e valida sua correlação com a absorção intracelular de FD-glicose em células e tecidos ex vivo. O esgotamento extracelular da glicose pode ser potencialmente aplicável para estudos cinéticos e dependentes de doses de alta produtividade, bem como identificar compostos com atividade glicêmica e seus efeitos específicos do tecido.

Introdução

A demanda por medição da absorção de glicose aumenta juntamente com a necessidade crítica de enfrentar um aumento epidêmico em uma infinidade de doenças dependentes do metabolismo da glicose. Os mecanismos subjacentes de doenças metabólicas degenerativas, distúrbios neurológicos e cognitivos1, inflamatório2 e doenças infecciosas3, câncer 4,5, bem como envelhecimento6, dependem do metabolismo de glicose para energia e seu armazenamento, processos anabólicos, inflamação de proteínas e genes, sinalização, regulação de ....

Protocolo

Os estudos em animais foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Universidade Estadual de Ohio (OSU, protocolo 2007A0262-R4).

NOTA: Todos os procedimentos devem ser feitos em um armário de biossegurança classe II com o soprador ligado e as luzes apagadas.

1. Preparação de materiais

NOTA: Todos os materiais estão listados na Tabela de Materiais.

  1. Prepare o Medium 1, centrifugação Média 2, e soluções de armazenamento e trabalho fluorescentes de fluorescente 2-desoxi-2-[(7-nitro-2,1,3-benzoxadiazol-4-yl) amino]-D-gl....

Resultados

A ingestão intracelular e o esgotamento extracelular da glicose foram medidos em pré-adipócitos 3T3-L1, em resposta a diferentes concentrações de FD-glicose (Figura 2) com e sem estimulação de insulina. A Figura 2A demonstra um aumento dependente de dose na absorção intracelular da fd-glicose, que foi significativamente aumentada na presença de insulina. A diminuição concomitante da glicemia de FD extracelular nas mesmas células é mostrada na

Discussão

A comparação direta do esgotamento extracelular da glicose FD com a absorção normalizada de glicose intracelular na cultura celular mostrou uma alta correlação, sugerindo que o esgotamento extracelular da glicose poderia ser uma medida substituta para a avaliação da absorção de glicose. A medição da glicemia de FD extracelular pode usar uma ampla gama de concentrações de glicose FD, também 0,5-2,5 μg FD-glicose/mL parecem fornecer a faixa ideal. A glicemia de FD extracelular não requer normalização par.......

Divulgações

Os autores não têm problemas para divulgar e não têm conflito de interesses.

Agradecimentos

O projeto foi apoiado por Ralph e Marian Falk Medical Research Catalyst Award e Kathleen Kelly Award. Outros suportes incluíram o Centro Nacional de Recursos de Pesquisa UL1RR025755 e NCI P30CA16058 (OSUCCC), o Roteiro do NIH para Pesquisa Médica. O conteúdo é de responsabilidade exclusiva dos autores e não representa as opiniões oficiais do Centro Nacional de Recursos de Pesquisa ou do NIH.

....

Materiais

NameCompanyCatalog NumberComments
3T3-L1 mouse fibroblastsATCCCL-173Cell line
96-well platesFalcon353227Plastic ware
B6.V-Lepob/J male miceJackson Laboratorystock number 000632Mice
BioTek Synergy H1 modular multimode microplate reader (Fisher Scientific, US)Fisher Scientific, US B-SHTDevice
Bovine serumGibco/ThermoFisher161790-060Cell culture
Calf serumGibco/ThermoFisher26010-066Cell culture
Cell incubatorFormaSeries II Water JacketDevice
Diet (mouse/rat diet, irradiated)EnvigoTeklad LM-485Diet
Dimethylsulfoxide (DMSO)Sigma LifeScienceD2650-100mLReagent
Dulbecco's Modified Eagle MediumGibco/ThermoFisher 11965-092Cell culture
EthanolSigma AldrichE7023-500mLReagent
Fluorescent 2-deoxy-2-[(7-nitro-2,1,3-benzoxadiazol-4-yl) amino]-D-glucose)Sigma72987-1MGAssay
Glucose-free and phenol red-free DMEMGibco/ThermoFisherA14430-01Cell culture
Human insulin 10 mg/mLMilliporeSigma, Cat N 91077CCat N 91077CReagent
Isoflurane, 5%Henry ScheinNDC 11695-6776-2Anestaetic
Penicillin/streptomycin (P/S)Gibco/ThermoFisher15140-122Cell culture
Phosphate buffered solutionSigma-AldrichDA537-500 mLCell culture
Pierce bicinchoninic acid (BCA) protein assayThermoFisherCat N23225Assay
Radioimmunoprecipitation assay lysis bufferSanta Cruz Biotechnologysc-24948Assay
Trypsin-EDTA (0.05%)Gibco/ThermoFisher 25300-054Cell culture

Referências

  1. Kyrtata, N., Emsley, H. C. A., Sparasci, O., Parkes, L. M., Dickie, B. R. A systematic review of glucose transport alterations in Alzheimer's disease. Frontiers in Neuroscience. 15, 568 (2021).
  2. Garcia-Carbonell, R., et al.

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