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O esgotamento extracelular da glicose fluorescente se correlaciona com a absorção de glicose e pode ser usado para triagem de alto rendimento da absorção de glicose em órgãos excisados e culturas celulares.
A epidemia mundial de diabetes aumenta a demanda pela identificação de fatores ambientais, nutricionais, endócrinos, genéticos e epigenéticos que afetam a absorção de glicose. A medição da fluorescência intracelular é um método amplamente utilizado para testar a absorção de glicose fluorescente (FD-glicose) em células in vitro, ou para tecidos que consomem glicose em imagens in vivo. Este ensaio avalia a absorção de glicose em um ponto de tempo escolhido. A análise intracelular pressupõe que o metabolismo da fd-glicose é mais lento do que o da glicose endógena, que participa de reações catabólicas e anabólicos e sinalização. No entanto, o metabolismo dinâmico da glicose também altera os mecanismos de absorção, o que exigiria medidas cinéticas de absorção de glicose em resposta a diferentes fatores. Este artigo descreve um método para medir o esgotamento extracelular da glicose FD e valida sua correlação com a absorção intracelular de FD-glicose em células e tecidos ex vivo. O esgotamento extracelular da glicose pode ser potencialmente aplicável para estudos cinéticos e dependentes de doses de alta produtividade, bem como identificar compostos com atividade glicêmica e seus efeitos específicos do tecido.
A demanda por medição da absorção de glicose aumenta juntamente com a necessidade crítica de enfrentar um aumento epidêmico em uma infinidade de doenças dependentes do metabolismo da glicose. Os mecanismos subjacentes de doenças metabólicas degenerativas, distúrbios neurológicos e cognitivos1, inflamatório2 e doenças infecciosas3, câncer 4,5, bem como envelhecimento6, dependem do metabolismo de glicose para energia e seu armazenamento, processos anabólicos, inflamação de proteínas e genes, sinalização, regulação de ....
Os estudos em animais foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Universidade Estadual de Ohio (OSU, protocolo 2007A0262-R4).
NOTA: Todos os procedimentos devem ser feitos em um armário de biossegurança classe II com o soprador ligado e as luzes apagadas.
1. Preparação de materiais
NOTA: Todos os materiais estão listados na Tabela de Materiais.
A ingestão intracelular e o esgotamento extracelular da glicose foram medidos em pré-adipócitos 3T3-L1, em resposta a diferentes concentrações de FD-glicose (Figura 2) com e sem estimulação de insulina. A Figura 2A demonstra um aumento dependente de dose na absorção intracelular da fd-glicose, que foi significativamente aumentada na presença de insulina. A diminuição concomitante da glicemia de FD extracelular nas mesmas células é mostrada na
A comparação direta do esgotamento extracelular da glicose FD com a absorção normalizada de glicose intracelular na cultura celular mostrou uma alta correlação, sugerindo que o esgotamento extracelular da glicose poderia ser uma medida substituta para a avaliação da absorção de glicose. A medição da glicemia de FD extracelular pode usar uma ampla gama de concentrações de glicose FD, também 0,5-2,5 μg FD-glicose/mL parecem fornecer a faixa ideal. A glicemia de FD extracelular não requer normalização par.......
Os autores não têm problemas para divulgar e não têm conflito de interesses.
O projeto foi apoiado por Ralph e Marian Falk Medical Research Catalyst Award e Kathleen Kelly Award. Outros suportes incluíram o Centro Nacional de Recursos de Pesquisa UL1RR025755 e NCI P30CA16058 (OSUCCC), o Roteiro do NIH para Pesquisa Médica. O conteúdo é de responsabilidade exclusiva dos autores e não representa as opiniões oficiais do Centro Nacional de Recursos de Pesquisa ou do NIH.
....Name | Company | Catalog Number | Comments |
3T3-L1 mouse fibroblasts | ATCC | CL-173 | Cell line |
96-well plates | Falcon | 353227 | Plastic ware |
B6.V-Lepob/J male mice | Jackson Laboratory | stock number 000632 | Mice |
BioTek Synergy H1 modular multimode microplate reader (Fisher Scientific, US) | Fisher Scientific, US | B-SHT | Device |
Bovine serum | Gibco/ThermoFisher | 161790-060 | Cell culture |
Calf serum | Gibco/ThermoFisher | 26010-066 | Cell culture |
Cell incubator | Forma | Series II Water Jacket | Device |
Diet (mouse/rat diet, irradiated) | Envigo | Teklad LM-485 | Diet |
Dimethylsulfoxide (DMSO) | Sigma LifeScience | D2650-100mL | Reagent |
Dulbecco's Modified Eagle Medium | Gibco/ThermoFisher | 11965-092 | Cell culture |
Ethanol | Sigma Aldrich | E7023-500mL | Reagent |
Fluorescent 2-deoxy-2-[(7-nitro-2,1,3-benzoxadiazol-4-yl) amino]-D-glucose) | Sigma | 72987-1MG | Assay |
Glucose-free and phenol red-free DMEM | Gibco/ThermoFisher | A14430-01 | Cell culture |
Human insulin 10 mg/mL | MilliporeSigma, Cat N 91077C | Cat N 91077C | Reagent |
Isoflurane, 5% | Henry Schein | NDC 11695-6776-2 | Anestaetic |
Penicillin/streptomycin (P/S) | Gibco/ThermoFisher | 15140-122 | Cell culture |
Phosphate buffered solution | Sigma-Aldrich | DA537-500 mL | Cell culture |
Pierce bicinchoninic acid (BCA) protein assay | ThermoFisher | Cat N23225 | Assay |
Radioimmunoprecipitation assay lysis buffer | Santa Cruz Biotechnology | sc-24948 | Assay |
Trypsin-EDTA (0.05%) | Gibco/ThermoFisher | 25300-054 | Cell culture |
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