JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

يصف البروتوكول الحالي نموذجا للفأر لاستئصال التعصيب الأدرينالي من خلال تحديد واستئصال العقدة العنقية العلوية.

Abstract

تشير الأدلة المتزايدة إلى أن الجهاز العصبي السمبثاوي يلعب دورا مهما في تطور السرطان. ينظم التعصيب الأدرينالي إفراز الغدد اللعابية ، وإيقاع الساعة البيولوجية ، والضمور البقعي ، ووظيفة المناعة ، وفسيولوجيا القلب. استئصال الودي الجراحي للفئران هو طريقة لدراسة آثار التعصيب الأدرينالي من خلال السماح بالاستئصال الأدرينالي الكامل من جانب واحد مع تجنب الحاجة إلى التدخل الدوائي المتكرر والآثار الجانبية المرتبطة به. ومع ذلك ، فإن استئصال الودي الجراحي في الفئران يمثل تحديا تقنيا بسبب صغر حجم العقدة العنقية العلوية. تصف هذه الدراسة تقنية جراحية لتحديد واستئصال العقدة العنقية العلوية بشكل موثوق لاستئصال الجهاز العصبي الودي. يتم التحقق من صحة التعرف الناجح على العقدة وإزالتها عن طريق تصوير العقد الودية الفلورية باستخدام فأر معدل وراثيا ، وتحديد متلازمة هورنر بعد الاستئصال ، وتلطيخ العلامات الأدرينالية في العقد المقطوعة ، ومراقبة تناقص التألق المناعي الأدرينالي في الأعضاء المستهدفة بعد استئصال الودي. يتيح هذا النموذج إجراء دراسات مستقبلية لتطور السرطان بالإضافة إلى العمليات الفسيولوجية الأخرى التي ينظمها الجهاز العصبي الودي.

Introduction

أفادت دراسات متعددة أن الأعصاب في البيئة المكروية للورم تلعب دورا نشطا في دعم تطور الورم. ثبت أن استئصال الأعصاب الأدرينالية الودية يضعف تطور الورم وانتشاره في سرطان البروستاتا والمعدة في الجسم الحي1،2،3 ، في حين أن الحصار الدوائي للمستقبلات الأدرينالية يمنع نمو الورم في سرطان الرأس والرقبة4. كما تم وصف المشاركة العصبية الودية في تطور سرطان البنكرياس وعنق الرحم والخلايا القاعدية5،6،7.

داخل الجهاز العصبي السمبثاوي، العقدة العنقية العلوية (SCG) هي العقدة الوحيدة في الجذع السمبثاوي التي تعصب الرأس. ينظم SCG الوظائف الفسيولوجية المختلفة ، مثل إفراز اللعاب وإيقاع الساعة البيولوجية ، ويعصب مباشرة الغدد الليمفاوية العنقية8،9،10. كما تورط SCG في العمليات المرضية مثل التنكس البقعي11 وتطور تسلخ الأبهر12. بالإضافة إلى ذلك ، تم الإبلاغ عن استئصال SCG لتفاقم إصابة الكلى الحادة الناجمة عن نقص التروية13 وكذلك تغيير ميكروبات الأمعاء في الفئران14.

سيمثل الاستئصال الكامل ل SCG في نموذج الفأر تقنية تجريبية قيمة لتمكين أبحاث السرطان والجهاز العصبي اللاإرادي. في حين أن العديد من الدراسات قد استخدمت حصار مستقبلات الأدرينالية الدوائية كاستئصال الأدرينالية15،16،17،18،19،20 ، يسمح الاستئصال الجراحي بالاجتثاث الأدرينالية الكامل من جانب واحد مع تجنب الحاجة إلى التدخل الدوائي المتكرر والآثار الجانبية المرتبطةبه 21،22،23.

تم وصف الاستئصال الجراحي ل SCG في الفئران24 ، واستخدمت معظم التقارير التي تدرس تأثير استئصال العقدة العنقية العلوي (SCGx) نموذج الفئران. بالمقارنة مع نموذج الفئران ، فإن SCGx أكثر تحديا من الناحية الفنية في الفئران بسبب صغر حجم SCG. ومع ذلك ، فإن الفئران أسهل نسبيا في التعامل معها ، وأكثر فعالية من حيث التكلفة ، وأكثر قابلية للتلاعب الجيني. كان غارسيا وآخرون من أوائل الذين أبلغوا عن SCGx في الفئران ، ووجد أنه يؤثر على إطلاق الأنسولين25. في الآونة الأخيرة ، وصف Ziegler et al. SCGx في الفئران بناء على التقنية المنشورة الموصوفة للفئران24،26. تصف هذه المقالة وغيرها طريقة يتم فيها تحديد الشريان السباتي المشترك (CCA) وتشريحه لأول مرة ، ويتم إزالة SCG لاحقا من تشعب CCA21،22،27،28. في هذه المقالة ، يتم وصف تقنية أقل توغلا وأكثر أمانا في الفئران التي تتجنب تشريح CCA ، وبالتالي تقليل المضاعفات الأكثر خطورة لهذا الإجراء - النزيف من إصابة في CCA.

Protocol

تمت الموافقة على الإجراءات الحيوانية الموصوفة هنا من قبل اللجنة المؤسسية لرعاية واستخدام الحيوان في مركز ميموريال سلون كيترينج للسرطان. تم استخدام ذكور وإناث الفئران NSG البالغة من العمر ثمانية أسابيع هنا. تم الحصول على الحيوانات من مصدر تجاري (انظر جدول المواد). يتم تعقيم الأدوات ، وتطهير سطح العمل الجراحي ، وتطهير سطح جلد الحيوان ، ويرتدي الجراح قفازات معقمة طوال العملية.

1. إعداد الفئران والإعداد قبل الجراحة

  1. في اليوم السابق للجراحة ، قم بتخدير الماوس بنسبة 2٪ إيزوفلوران في غرفة الحث (3.75 في العرض × 9 في العمق × 3.75 في الارتفاع ، انظر جدول المواد).
    ملاحظة: عادة ما يتم تحقيق مستوى التخدير الجراحي في 3-5 دقائق ، اعتمادا على الحيوان الفردي. تقييم مدى كفاية التخدير عن طريق قرصة إصبع القدم ، وزيادة نسبة الأيزوفلوران حسب الاقتضاء.
    1. حلق الجانب البطني من الرقبة أو استخدم عامل كيميائي لإزالة الشعر وفقا لتعليمات الشركة المصنعة (انظر جدول المواد).
  2. في يوم الجراحة ، قم بتخدير الماوس بنسبة 2٪ إيزوفلوران في غرفة الحث. تقييم مدى كفاية التخدير عن طريق قرصة إصبع القدم ، وزيادة نسبة الأيزوفلوران حسب الاقتضاء.
  3. يتم تطبيق 2 ملغ/ كغ من ميلوكسيكام تحت الجلد من أجل التسكين الجهازي الوقائي. تطبيق مرهم العيون الموضعي (انظر جدول المواد) لمنع إصابات العين والجفاف تحت التخدير.
  4. ضع الماوس تحت مجهر تشريح على جانبه الظهري وقدم الدعم الحراري. الحفاظ على التخدير الاستنشاقي مع 2٪ -2.5٪ إيزوفلوران باستخدام مبخر دقيق ومخروط الأنف. ثبت كلا الطرفين الأماميين برفق بشريط مضاد للحساسية (انظر جدول المواد).
  5. قم بتنظيف الجانب البطني المحلوق من الرقبة باستخدام بوفيدون اليود ، ثم امسحه بنسبة 70٪ كحول. كرر هذه العملية مرتين أخريين. تأكد من خلو موقع الجراحة من أي شعر مترسدل.
    ملاحظة: يمكن أيضا استخدام زوج من الملقط المنحني القصير. تأكد من استخدام زوج من الملقط الدقيق أو العيني للعمل بشكل مناسب في هذه المساحة الضيقة. يمكن تضمين إعداد إضافي قبل الجراحة وفقا للإرشادات المؤسسية.

2. تشريح

  1. قم بعمل شق جلدي في خط الوسط بطول 1.5 سم على الجانب البطني من الرقبة باستخدام مقص صغير من حوالي 2 مم تحت الذقن إلى 2 مم فوق الشق القصي.
  2. اسحب حواف الجلد بشكل جانبي بالملقط لفضح اللفافة الكامنة والغدد اللعابية تحت الفك السفلي. افصل الجلد عن اللفافة الأساسية عن طريق إدخال مقص مدبب تحت الجلد على كل جانب ونشره. اسحب الغدد تحت الفك السفلي ذيليا بالملقط للكشف عن العضلات الكامنة.
  3. حدد موقع تقاطع البطن الخلفي للعضلة ثنائية المعدة والعضلة اللامية (الشكل 1 أ ، الدائرة السوداء). يظهر الوريد الوداجي الأمامي يمتد طوليا وجانبيا إلى العضلة اللامية اللامية.
    ملاحظة: تغطي العضلة اللامية القصبة الهوائية طوليا ، بينما تقع العضلة ثنائية المعدة بشكل عرضي في الجانب القحفي من القصبة الهوائية (الشكل 1C).
    1. أدخل طرف ملقط بزاوية 45 درجة عند هذا التقاطع ، الجانبي للوريد الوداجي الأمامي ، لاختراق ونشر فتحة في اللفافة العنقية العميقة التي تعلوها.
  4. احتفظ بهذه النافذة التي تم إنشاؤها في الخطوة 2.3.1 مفتوحة باستخدام ملقط بزاوية 45 درجة. قم بتوسيع هذه الفتحة على نطاق أوسع من خلال إجراء مناورات الانتشار باستخدام زوج من الملقط المنحني في اليد الأخرى.

3. تحديد واستئصال العقدة

  1. حدد موقع العقدة العنقية العلوية (SCG) على الجدار الجانبي للمساحة المكشوفة. يظهر كنسيج دائري لؤلؤي.
    ملاحظة: إذا لم يتم تحديد SCG ، فيجب فحص الأنسجة الموجودة في هذا الفضاء بشكل جانبي ومتفوق. يمكن الخلط بسهولة بين SCG والدهون ، والتي غالبا ما تكون موجودة في هذه المنطقة. الدهون لها مسحة صفراء قليلا ، بينما في المقابل ، يظهر SCG أبيض لؤلؤي.
  2. مع الحفاظ على الفتحة بالملقط باليد الأخرى ، أمسك SCG برفق بالملقط ، واسحبه من الفتحة لجعله في رؤية أفضل.
  3. بمجرد رؤية SCG ، أمسك بالقاعدة الجانبية ل SCG ، حيث لا تزال متصلة بالأنسجة المحيطة. باستخدام اليد الأخرى ، اسحب SCG ببطء ورفق في الاتجاه البطني والذيلي.
    1. اسحب SCG عدة مرات لإزالة العقدة تدريجيا شيئا فشيئا. حافظ على العقدة سليمة أثناء هذه المناورة لضمان عدم ترك بقايا العقدة المتبقية وراءها.
      ملاحظة: اسحب العقدة برفق ، حيث قد يحدث نزيف أثناء هذه الخطوة. في حالة حدوث نزيف بسيط ، استخدم السليلوز المؤكسد المتجدد أو شريط صغير من الشاش المعقم للحفاظ على الضغط على الفتحة لمدة 30 ثانية إلى 1 دقيقة. ثم ارفع الشاش ببطء وأعد التقييم. كرر عملية الضغط على الفتحة حسب الضرورة حتى يتوقف النزيف.
  4. حرر ببطء الملقط الآخر الذي يحمل قاعدة العقدة. تحقق من النزيف من خلال البحث عن تجمع الدم.
    ملاحظة: النز الطفيف في هذا الوقت أمر طبيعي. راقب وتأكد من عدم وجود نزيف مستمر أو كبير قبل إغلاق الإجراء وإنهائه. في حالة حدوث ذلك ، اضغط مع الاستمرار على الفتحة ، كما هو موضح في الخطوة 3.3.1.
  5. حرك الغدد اللعابية مرة أخرى إلى مواقعها التشريحية الطبيعية. قم بتقريب وإغلاق الجلد باستخدام خيوط نايلون بسيطة متقطعة 5-0 (انظر جدول المواد).
  6. ضع الماوس في قفص نظيف بمفرده للسماح بالشفاء التام من التخدير.
    ملاحظة: قد يستغرق الأمر من 5 إلى 15 دقيقة حتى يستيقظ الماوس تماما من التخدير. لا تترك الفأر دون مراقبة حتى يستعيد وعيه الكافي للحفاظ على الاستلقاء القصي. لا تضع الماوس في قفص مع الفئران الأخرى حتى يتعافى تماما. تقييم الماوس للتعافي بعد الجراحة مرة واحدة على الأقل كل 24 ساعة لمدة 72 ساعة.

النتائج

يصف هذا البروتوكول الاستئصال الجراحي ل SCG في نموذج الماوس. يوضح الشكل 2 المعالم التشريحية ، بما في ذلك CCA والوريد الوداجي الأمامي و SCG. مع التشريح (الشكل 2 أ) ، يمكن رؤية الوريد الوداجي الأمامي الأيمن وهو يتأرجح على طول الحدود الجانبية للقصبة الهوائية. نظرا لأن...

Discussion

يصف هذا البروتوكول نموذج الماوس للاستئصال الجراحي من جانب واحد لمدخلات SCG. تسمح هذه التقنية بدراسة آثار التعصيب الأدرينالي في بيئات مختلفة. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن أيضا زراعة العقدة المتعاطفة المقطوعة في ثقافة 3D matrigel للتجارب في المختبر 30.

تم إجراء الدراسا?...

Disclosures

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

Acknowledgements

تم دعم Q. W. من قبل المعاهد الوطنية للصحة T32CA009685. تم دعم RJ W. من قبل المعاهد الوطنية للصحة R01CA219534. تم دعم المرافق الأساسية لمركز ميموريال سلون كيترينج للسرطان من قبل المعاهد الوطنية للصحة P30CA008748.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Anti-Tyrosine Hydroxylase AntibodyEMD MilliporeAB152
Artificial Tears Lubricant Ophthalmic OintmentAkorn59399-162-35
Curity 2 x 2 Inch Gauze Sponge 8 Ply, SterileCovidien1806
Derf Needle HolderThomas Scientific1177K00
Dissecting Microscope
Dumont #5/45 ForcepsFine Science Tools11251-35
Dumont #7b ForcepsFine Science Tools11270-20
ETHILON Nylon SutureEthicon698H
Fine Scissors - ToughCutFine Science Tools14058-09
Hypoallergenic Surgical Tape3M Blenderm70200419342
Induction Chamber, 2 LiterVetEquip941444
IsofluraneBaxter1001936060
NairChurch & Dwight Co., Inc40002957chemical hair removing agent
NORADRENALINE RESEARCH ELISALabor Diagnostika Nord (Rocky Mountain Diagnostics)BA E-5200
NSG MouseJackson LaboratoryJAX:005557
Povidone-Iodine SwabstickPDIS41350
Webcol Alcohol PrepsCovidien5110

References

  1. Magnon, C., et al. Autonomic nerve development contributes to prostate cancer progression. Science. 341 (6142), 1236361 (2013).
  2. Zhao, C. M., et al. Denervation suppresses gastric tumorigenesis. Science Translational Medicine. 6 (250), 115 (2014).
  3. Zahalka, A. H., et al. Adrenergic nerves activate an angio-metabolic switch in prostate cancer. Science. 358 (6361), 321-326 (2017).
  4. Amit, M., et al. Loss of p53 drives neuron reprogramming in head and neck cancer. Nature. 578 (7795), 449-454 (2020).
  5. Renz, B. W., et al. Cholinergic signaling via muscarinic receptors directly and indirectly suppresses pancreatic tumorigenesis and cancer stemness. Cancer Discovery. 8 (11), 1458-1473 (2018).
  6. Lucido, C. T., et al. Innervation of cervical carcinoma is mediated by cancer-derived exosomes. Gynecologic Oncology. 154 (1), 228-235 (2019).
  7. Peterson, S. C., et al. Basal cell carcinoma preferentially arises from stem cells within hair follicle and mechanosensory niches. Cell Stem Cell. 16 (4), 400-412 (2015).
  8. Maronde, E., Stehle, J. H. The mammalian pineal gland: Known facts, unknown facets. Trends in Endocrinology & Metabolism. 18 (4), 142-149 (2007).
  9. Yamazaki, S., et al. Ontogeny of circadian organization in the rat. Journal of Biological Rhythms. 24 (1), 55-63 (2009).
  10. Huang, J., et al. S100+ cells: A new neuro-immune cross-talkers in lymph organs. Scientific Reports. 3 (1), 1114 (2013).
  11. Dieguez, H. H., et al. Melatonin protects the retina from experimental nonexudative age-related macular degeneration in mice. Journal of Pineal Research. 68 (4), 12643 (2020).
  12. Liu, H., et al. Bilateral superior cervical ganglionectomy attenuates the progression of β-aminopropionitrile-induced aortic dissection in rats. Life Sciences. 193, 200-206 (2018).
  13. Zhang, W., et al. The role of the superior cervical sympathetic ganglion in ischemia reperfusion-induced acute kidney injury in rats. Frontiers in Medicine. 9, 792000 (2022).
  14. Zhang, W., et al. Superior cervical ganglionectomy alters gut microbiota in rats. American Journal of Translational Research. 14 (3), 2037-2050 (2022).
  15. Wang, X., et al. β-Adrenergic signaling induces Notch-mediated salivary gland progenitor cell control. Stem Cell Reports. 16 (11), 2813-2824 (2021).
  16. Boyd, A., Aragon, I. V., Abou Saleh, L., Southers, D., Richter, W. The cAMP-phosphodiesterase 4 (PDE4) controls β-adrenoceptor- and CFTR-dependent saliva secretion in mice. Biochemical Journal. 478 (10), 1891-1906 (2021).
  17. Smith, B., Butler, M. The effects of long-term propranolol on the salivary glands and intestinal serosa of the mouse. The Journal of Pathology. 124 (4), 185-187 (1978).
  18. Sucharov, C. C., et al. β-Adrenergic receptor antagonism in mice: A model for pediatric heart disease. Journal of Applied Physiology. 115 (7), 979-987 (2013).
  19. Ding, C., Walcott, B., Keyser, K. T. The alpha1- and beta1-adrenergic modulation of lacrimal gland function in the mouse. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 48 (4), 1504-1510 (2007).
  20. Grisanti, L. A., et al. Prior β-blocker treatment decreases leukocyte responsiveness to injury. JCI Insight. 5 (9), 99485 (2019).
  21. Alito, A. E., et al. Autonomic nervous system regulation of murine immune responses as assessed by local surgical sympathetic and parasympathetic denervation. Acta Physiologica, Pharmacologica et Therapeutica Latinoamericana. 37 (3), 305-319 (1987).
  22. Yun, H., Lathrop, K. L., Hendricks, R. L. A central role for sympathetic nerves in herpes stromal keratitis in mice. Ophthalmology & Visual Science. 57 (4), 1749-1756 (2016).
  23. Haug, S. R., Heyeraas, K. J. Effects of sympathectomy on experimentally induced pulpal inflammation and periapical lesions in rats. Neuroscience. 120 (3), 827-836 (2003).
  24. Savastano, L. E., et al. A standardized surgical technique for rat superior cervical ganglionectomy. Journal of Neuroscience Methods. 192 (1), 22-33 (2010).
  25. Garcia, J. B., Romeo, H. E., Basabe, J. C., Cardinali, D. P. Effect of superior cervical ganglionectomy on insulin release by murine pancreas slices. Journal of the Autonomic Nervous System. 22 (2), 159-165 (1988).
  26. Ziegler, K. A., et al. Local sympathetic denervation attenuates myocardial inflammation and improves cardiac function after myocardial infarction in mice. Cardiovascular Research. 114 (2), 291-299 (2017).
  27. Getsy, P. M., Coffee, G. A., Hsieh, Y. H., Lewis, S. J. The superior cervical ganglia modulate ventilatory responses to hypoxia independently of preganglionic drive from the cervical sympathetic chain. Journal of Applied Physiology. 131 (2), 836-857 (2021).
  28. Dieguez, H. H., et al. Superior cervical gangliectomy induces non-exudative age-related macular degeneration in mice. Disease Models & Mechanisms. 11 (2), 031641 (2018).
  29. Zhang, B., et al. Hyperactivation of sympathetic nerves drives depletion of melanocyte stem cells. Nature. 577 (7792), 676-681 (2020).
  30. Pirzgalska, R. M., et al. Sympathetic neuron-associated macrophages contribute to obesity by importing and metabolizing norepinephrine. Nature Medicine. 23 (11), 1309-1318 (2017).
  31. Kajimura, D., Paone, R., Mann, J. J., Karsenty, G. Foxo1 regulates Dbh expression and the activity of the sympathetic nervous system in vivo. Molecular Metabolism. 3 (7), 770-777 (2014).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

190

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved