Operationstechnik für die überlegene zervikale Ganglionektomie im Mausmodell

Zusammenfassung

Das vorliegende Protokoll beschreibt ein Mausmodell der Ablation der adrenergen Innervation durch Identifizierung und Resektion des Ganglion cervicalis superior.

Zusammenfassung

Immer mehr Hinweise deuten darauf hin, dass das sympathische Nervensystem eine wichtige Rolle beim Fortschreiten von Krebs spielt. Die adrenerge Innervation reguliert die Speicheldrüsensekretion, den zirkadianen Rhythmus, die Makuladegeneration, die Immunfunktion und die Herzphysiologie. Die chirurgische Sympathektomie der Maus ist eine Methode zur Untersuchung der Auswirkungen der adrenergen Innervation, indem sie eine vollständige, einseitige adrenerge Ablation ermöglicht und gleichzeitig die Notwendigkeit wiederholter pharmakologischer Eingriffe und der damit verbundenen Nebenwirkungen vermeidet. Die chirurgische Sympathektomie bei Mäusen ist jedoch aufgrund der geringen Größe des oberen zervikalen Ganglions technisch anspruchsvoll. In dieser Studie wird eine Operationstechnik beschrieben, mit der das Ganglion cervicalis superior zur Ablation des sympathischen Nervensystems zuverlässig identifiziert und reseziert werden kann. Die erfolgreiche Identifizierung und Entfernung des Ganglions wird durch die Bildgebung der fluoreszierenden sympathischen Ganglien mit einer transgenen Maus, die Identifizierung des Horner-Syndroms nach der Resektion, die Färbung auf adrenerge Marker in den resezierten Ganglien und die Beobachtung einer verminderten adrenergen Immunfluoreszenz in den Zielorganen nach Sympathektomie validiert. Dieses Modell ermöglicht zukünftige Studien zum Fortschreiten von Krebs sowie zu anderen physiologischen Prozessen, die durch das sympathische Nervensystem reguliert werden.

Einleitung

Mehrere Studien haben berichtet, dass die Nerven in der Tumormikroumgebung eine aktive Rolle bei der Unterstützung der Tumorprogression spielen. Es wurde gezeigt, dass die Ablation adrenerger sympathischer Nerven die Tumorentwicklung und -ausbreitung bei Prostata- und Magenkrebs in vivo beeinträchtigt ^1,2,3, während die pharmakologische Blockade adrenerger Rezeptoren das Tumorwachstum bei Kopf-Hals-Tumoren hemmt ⁴. Eine sympathische neuronale Beteiligung wurde auch bei der Progression von Pankreas-, Zervikla- und Basalzellkarzinomen beschrieben ^5,6,7.

Innerhalb des sympathischen Nervensystems ist das Ganglion cervicalis superior (SCG) das einzige Ganglion des Sympathikus, das den Kopf innerviert. Das SCG reguliert verschiedene physiologische Funktionen, wie z.B. die Speichelsekretion und den zirkadianen Rhythmus, und innerviert direkt die zervikalen Lymphknoten ^8,9,10. Das SCG wurde auch mit pathologischen Prozessen wie der Makuladegeneration¹¹ und dem Fortschreiten der Aortendissektion¹² in Verbindung gebracht. Darüber hinaus wurde berichtet, dass die Resektion des SCG die Ischämie-Reperfusions-induzierte akute Nierenschädigung verschlimmert¹³ und auch die Darmmikrobiota bei Ratten^{verändert 14}.

Die vollständige Ablation des SCG in einem Mausmodell würde eine wertvolle experimentelle Technik darstellen, um die Krebsforschung und das autonome Nervensystem zu ermöglichen. Während in vielen Studien die pharmakologische adrenerge Rezeptorblockade als adrenerge Ablation eingesetzt wurde 15,16,17,18,19,20, ermöglicht die chirurgische Resektion eine vollständige, einseitige adrenerge Ablation unter Vermeidung wiederholter pharmakologischer Eingriffe und der damit verbundenen Nebenwirkungen ^21,22,23.

Die chirurgische Resektion des SCG wurde bei Ratten^{beschrieben 24}, und die meisten Berichte, die die Wirkung der überlegenen zervikalen Ganglionektomie (SCGx) untersuchten, verwendeten das Rattenmodell. Im Vergleich zum Rattenmodell ist SCGx bei Mäusen aufgrund der geringen Größe des SCG technisch anspruchsvoller. Mäuse sind jedoch vergleichsweise einfacher zu handhaben, kostengünstiger und anfälliger für genetische Manipulationen. Garcia et al. gehörten zu den ersten, die über SCGx bei Mäusen berichteten, und es wurde festgestellt, dass es die Insulinfreisetzung beeinflusst²⁵. In jüngerer Zeit beschrieben Ziegler et al. SCGx in Mäusen auf der Grundlage der veröffentlichten Technik, die für Ratten beschrieben wurde^24,26. Dieser und andere Artikel beschreiben eine Methode, bei der zunächst die Arteria carotis communis (CCA) identifiziert und präpariert wird und anschließend das SCG aus der Bifurkation der CCA entfernt wird^21,22,27,28. In diesem Artikel wird eine weniger invasive und sicherere Technik an Mäusen beschrieben, die die Dissektion des CCA vermeidet und dadurch die schwerwiegendste Komplikation dieses Verfahrens minimiert – Blutungen aus einer Verletzung des CCA.

Protokoll

Die hier beschriebenen Tierbehandlungen wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee am Memorial Sloan Kettering Cancer Center genehmigt. Hier wurden acht Wochen alte männliche und weibliche NSG-Mäuse verwendet. Die Tiere stammten aus einer kommerziellen Quelle (siehe Materialtabelle). Die Instrumente werden sterilisiert, die chirurgische Arbeitsfläche wird desinfiziert, die Hautoberfläche des Tieres wird desinfiziert und der Chirurg trägt während des gesamten Eingriffs sterile Handschuhe.

1. Vorbereitung der Mäuse und präoperativer Aufbau

1. Am Tag vor der Operation wird die Maus in einer Induktionskammer (3,75 in der Breite x 9 in der Tiefe x 3,75 in der Höhe, siehe Materialtabelle) mit 2% Isofluran betäubt.
   HINWEIS: Eine chirurgische Anästhesie wird in der Regel in 3-5 Minuten erreicht, abhängig vom einzelnen Tier. Beurteilen Sie die Angemessenheit der Anästhesie durch Einklemmen der Zehen und erhöhen Sie den Isofluran-Prozentsatz entsprechend.
   1. Rasieren Sie den ventralen Aspekt des Halses oder verwenden Sie ein chemisches Haarentfernungsmittel gemäß den Anweisungen des Herstellers (siehe Materialtabelle).
2. Am Tag der Operation wird die Maus in einer Induktionskammer mit 2% Isofluran betäubt. Beurteilen Sie die Angemessenheit der Anästhesie durch Einklemmen der Zehen und erhöhen Sie den Isofluran-Prozentsatz entsprechend.
3. Verabreichen Sie 2 mg/kg Meloxicam subkutan zur präemptiven systemischen Analgesie. Tragen Sie eine topische Augensalbe auf (siehe Materialtabelle), um Augenverletzungen und Trockenheit unter Narkose zu vermeiden.
4. Legen Sie die Maus auf der dorsalen Seite unter ein Präpariermikroskop und sorgen Sie für eine thermische Unterstützung. Halten Sie die Inhalationsanästhesie mit 2%-2,5% Isofluran unter Verwendung eines Präzisions-Vaporizers und Nasenkonus aufrecht. Sichern Sie beide Vordergliedmaßen vorsichtig mit hypoallergenem Klebeband (siehe Materialtabelle).
5. Reinigen Sie den rasierten, ventralen Teil des Halses mit Povidon-Jod und wischen Sie ihn dann mit 70%igem Alkohol ab. Wiederholen Sie diesen Vorgang noch zwei weitere Male. Stellen Sie sicher, dass die Operationsstelle frei von losen Haaren ist.
   HINWEIS: Es kann auch eine kurze gebogene Pinzette verwendet werden. Stellen Sie sicher, dass Sie eine feine oder augenärztliche Pinzette verwenden, um in diesem engen Raum angemessen arbeiten zu können. Zusätzliche präoperative Setups können gemäß den institutionellen Richtlinien einbezogen werden.

2. Sezieren

1. Führen Sie einen 1,5 cm langen Hautschnitt in der Mittellinie der ventralen Seite des Halses mit einer kleinen Schere von ca. 2 mm unterhalb des Kinns bis 2 mm oberhalb der Brustbeinkerbe durch.
2. Ziehen Sie die Hautränder seitlich mit einer Pinzette zurück, um die darunter liegende Faszie und die submandibulären Speicheldrüsen freizulegen. Trennen Sie die Haut von der darunterliegenden Faszie, indem Sie auf jeder Seite eine spitze Schere unter die Haut einführen und spreizen. Ziehen Sie die Unterkieferdrüsen mit einer Pinzette kaudal nach unten, um die darunter liegenden Muskeln freizulegen.
3. Lokalisieren Sie den Übergang des hinteren Bauches des Digastricus-Muskels und des Musculus omohyoidus (Abbildung 1A, schwarzer Kreis). Die Vena jugularis anterior verläuft in Längsrichtung und lateral des Musculus omohyoideus.
   ANMERKUNG: Der Musculus omohyoideus bedeckt die Luftröhre in Längsrichtung, während der Musculus digastricus quer an der kranialen Seite der Luftröhre liegt (Abbildung 1C).
   1. Führen Sie die Spitze einer um 45° abgewinkelten Pinzette an dieser Verbindungsstelle, lateral der vorderen Halsvene, ein, um eine Öffnung in der darüber liegenden tiefen Halsfaszie zu stechen und zu spreizen.
4. Lassen Sie dieses in Schritt 2.3.1 erstellte Fenster mit der um 45° abgewinkelten Pinzette geöffnet. Erweitern Sie diese Öffnung weiter, indem Sie Spreizmanöver mit einer gebogenen Pinzette in der anderen Hand ausführen.

3. Identifizierung und Resektion des Ganglions

1. Lokalisieren Sie das Ganglion cervicalis superior (SCG) an der lateralen Wand des freigelegten Raumes. Es erscheint als rundes, perlmuttartiges Gewebe.
   HINWEIS: Wenn das SCG nicht identifiziert wird, muss das Gewebe in diesem Raum lateraler und überlegener untersucht werden. Das SCG kann leicht mit Fett verwechselt werden, das in dieser Region häufig vorhanden ist. Fett hat einen leicht gelblichen Schimmer, während das SCG im Gegensatz dazu perlweiß erscheint.
2. Während du mit der anderen Hand die Öffnung mit einer Pinzette hältst, greifst du den SCG vorsichtig mit der Pinzette und ziehst ihn aus der Öffnung heraus, um ihn besser sichtbar zu machen.
3. Sobald das SCG im Blickfeld ist, fassen Sie die seitliche Basis des SCGs, wo es noch mit dem umgebenden Gewebe verbunden ist. Mit der anderen Hand ziehen Sie den SCG langsam und vorsichtig in ventraler und kaudaler Richtung zurück.
   1. Ziehen Sie den SCG mehrmals zurück, um das Ganglion nach und nach zu avulzieren. Halten Sie das Ganglion während dieses Manövers intakt, um sicherzustellen, dass keine Reste von Ganglien zurückbleiben.
      HINWEIS: Ziehen Sie vorsichtig am Ganglion, da es bei diesem Schritt zu Blutungen kommen kann. Wenn leichte Blutungen auftreten, verwenden Sie oxidierte, regenerierte Zellulose oder einen kleinen Streifen steriler Gaze, um den Druck über der Öffnung für 30 s bis 1 Minute zu halten. Heben Sie dann langsam die Gaze an und bewerten Sie sie erneut. Wiederholen Sie den Vorgang des Haltens des Drucks über der Öffnung nach Bedarf, bis die Blutung gestoppt ist.
4. Lassen Sie langsam die andere Zange los, die die Basis des Ganglions hält. Überprüfe auf Blutungen, indem du nach Blutansammlungen suchst.
   HINWEIS: Leichtes Nässen ist zu diesem Zeitpunkt normal. Überwachen und stellen Sie sicher, dass keine anhaltenden oder signifikanten Blutungen auftreten, bevor Sie den Eingriff schließen und beenden. Halten Sie in diesem Fall den Druck auf die Öffnung, wie in Schritt 3.3.1 beschrieben.
5. Bringen Sie die Speicheldrüsen wieder in ihre normale anatomische Position. Approximieren und schließen Sie die Haut mit einfachen, unterbrochenen 5-0-Nylonnähten (siehe Materialtabelle).
6. Legen Sie die Maus in einen sauberen Käfig, um eine vollständige Erholung von der Narkose zu ermöglichen.
   HINWEIS: Es kann 5-15 Minuten dauern, bis die Maus vollständig aus der Anästhesie erwacht. Lassen Sie die Maus nicht unbeaufsichtigt, bis sie wieder zu Bewusstsein gekommen ist, um das Brustbein zu halten. Setzen Sie die Maus nicht mit anderen Mäusen in einen Käfig, bis sie sich vollständig erholt hat. Untersuchen Sie die postoperative Genesung der Maus mindestens einmal alle 24 Stunden für 72 Stunden.

Ergebnisse

Dieses Protokoll beschreibt die chirurgische Entfernung des SCG in einem Mausmodell. Abbildung 2 zeigt die anatomischen Orientierungspunkte, einschließlich der CCA, der Vena jugularis anterior und des SCG. Bei der Dissektion (Abbildung 2A) verläuft die rechte Vena jugularis anterior entlang des lateralen Randes der Luftröhre. Da sie tiefer als die Vena jugularis anterior liegt, sind die linke CCA und ihre Verzweigung in die Arteria carotis interna (ICA) und d...

Diskussion

Dieses Protokoll beschreibt ein Mausmodell für die chirurgische einseitige Ablation des SCG-Inputs. Diese Technik ermöglicht es, die Auswirkungen der adrenergen Innervation in verschiedenen Situationen zu untersuchen. Darüber hinaus kann das resezierte sympathische Ganglion auch in 3D-Matrigelkultur für In-vitro-Experimente gezüchtet werden³⁰.

Studien mit SCGx wurden hauptsächlich an Ratten durchgeführt, da ihre größere Anatomie eine einfachere anatomi...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anti-Tyrosine Hydroxylase Antibody	EMD Millipore	AB152
Artificial Tears Lubricant Ophthalmic Ointment	Akorn	59399-162-35
Curity 2 x 2 Inch Gauze Sponge 8 Ply, Sterile	Covidien	1806
Derf Needle Holder	Thomas Scientific	1177K00
Dissecting Microscope
Dumont #5/45 Forceps	Fine Science Tools	11251-35
Dumont #7b Forceps	Fine Science Tools	11270-20
ETHILON Nylon Suture	Ethicon	698H
Fine Scissors - ToughCut	Fine Science Tools	14058-09
Hypoallergenic Surgical Tape	3M Blenderm	70200419342
Induction Chamber, 2 Liter	VetEquip	941444
Isoflurane	Baxter	1001936060
Nair	Church & Dwight Co., Inc	40002957	chemical hair removing agent
NORADRENALINE RESEARCH ELISA	Labor Diagnostika Nord (Rocky Mountain Diagnostics)	BA E-5200
NSG Mouse	Jackson Laboratory	JAX:005557
Povidone-Iodine Swabstick	PDI	S41350
Webcol Alcohol Preps	Covidien	5110