Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Bu protokol, superior servikal ganglionu tanımlayarak ve rezeke ederek adrenerjik innervasyonun ablasyonunun bir fare modelini tanımlamaktadır.

Özet

Artan kanıtlar, sempatik sinir sisteminin kanserin ilerlemesinde önemli bir rol oynadığını göstermektedir. Adrenerjik innervasyon tükürük bezi sekresyonunu, sirkadiyen ritmi, makula dejenerasyonunu, bağışıklık fonksiyonunu ve kalp fizyolojisini düzenler. Murin cerrahi sempatektomi, tekrarlanan farmakolojik müdahale ve ilişkili yan etkilere ihtiyaç duyulmadan tam, tek taraflı adrenerjik ablasyona izin vererek adrenerjik innervasyonun etkilerini incelemek için bir yöntemdir. Bununla birlikte, farelerde cerrahi sempatektomi, superior servikal ganglionun küçük boyutu nedeniyle teknik olarak zordur. Bu çalışma, sempatik sinir sistemini ablate etmek için superior servikal ganglionu güvenilir bir şekilde tanımlamak ve rezeke etmek için bir cerrahi tekniği tanımlamaktadır. Ganglionun başarılı bir şekilde tanımlanması ve çıkarılması, floresan sempatik gangliyonların transgenik bir fare kullanılarak görüntülenmesi, rezeksiyon sonrası Horner sendromunun tanımlanması, rezeke edilen gangliyonlarda adrenerjik belirteçlerin boyanması ve sempatektomiyi takiben hedef organlarda azalmış adrenerjik immünofloresansın gözlemlenmesiyle doğrulanır. Bu model, sempatik sinir sistemi tarafından düzenlenen diğer fizyolojik süreçlerin yanı sıra kanser ilerlemesinin gelecekteki çalışmalarını mümkün kılar.

Giriş

Çok sayıda çalışma, tümör mikroçevresindeki sinirlerin tümör ilerlemesini desteklemede aktif bir rol oynadığını bildirmiştir. Adrenerjik sempatik sinirlerin ablasyonunun prostat ve mide kanserinde in vivo 1,2,3'te tümör gelişimini ve yayılımını bozduğu gösterilirken, adrenerjik reseptörlerin farmakolojik blokajı baş ve boyun kanserinde tümör büyümesini inhibe eder4. Sempatik nöral tutulum pankreas, servikal ve bazal hücreli karsinom progresyonunda da tanımlanmıştır 5,6,7.

Sempatik sinir sistemi içinde, superior servikal ganglion (SCG), sempatik gövdenin başı innerve eden tek ganglionudur. SCG, tükürük salgısı ve sirkadiyen ritim gibi çeşitli fizyolojik fonksiyonları düzenler ve servikal lenf düğümlerini doğrudan innerve eder 8,9,10. SCG ayrıca makula dejenerasyonu11 ve aort diseksiyonu12'nin ilerlemesi gibi patolojik süreçlerde de rol oynamaktadır. Ek olarak, SCG'nin rezeksiyonunun iskemi reperfüzyonuna bağlı akut böbrek hasarını13 şiddetlendirdiği ve ayrıca sıçanlarda bağırsak mikrobiyotasını değiştirdiğibildirilmiştir 14.

SCG'nin bir fare modelinde tam ablasyonu, kanser ve otonom sinir sistemi araştırmalarını mümkün kılmak için değerli bir deneysel tekniği temsil edecektir. Birçok çalışmada farmakolojik adrenerjik reseptör blokajı adrenerjik ablasyon olarak kullanılırken 15,16,17,18,19,20, cerrahi rezeksiyon tam, tek taraflı adrenerjik ablasyona izin verirken, tekrarlanan farmakolojik müdahale ihtiyacını ve ilişkili yan etkileri önler 21,22,23.

SCG'nin cerrahi rezeksiyonu sıçanlardatanımlanmıştır 24 ve superior servikal ganglionektominin (SCGx) etkisini inceleyen çoğu rapor sıçan modelini kullanmıştır. Sıçan modeliyle karşılaştırıldığında, SCGx, SCG'nin küçük boyutu nedeniyle farelerde teknik olarak daha zordur. Bununla birlikte, farelerin kullanımı nispeten daha kolaydır, daha uygun maliyetlidir ve genetik manipülasyona daha uygundur. Garcia ve ark. farelerde SCGx'i ilk bildirenlerden biriydi ve insülin salınımınıetkilediği bulundu 25. Daha yakın zamanlarda, Ziegler ve ark. sıçanlar için açıklanan yayınlanmış tekniğe dayanarak farelerde SCGx'itanımladı 24,26. Bu ve diğer makaleler, ortak karotis arterin (CCA) ilk olarak tanımlandığı ve diseke edildiği ve daha sonra SCG'nin CCA 21,22,27,28'in çatallanmasından çıkarıldığı bir yöntemi açıklamaktadır. Bu makalede, farelerde CCA'nın diseksiyonunu önleyen ve böylece bu prosedürün en ciddi komplikasyonu olan CCA'nın yaralanmasından kaynaklanan kanamayı en aza indiren daha az invaziv ve daha güvenli bir teknik açıklanmaktadır.

Protokol

Burada açıklanan hayvan prosedürleri, Memorial Sloan Kettering Kanser Merkezi'ndeki Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi tarafından onaylanmıştır. Burada sekiz haftalık erkek ve dişi NSG fareleri kullanıldı. Hayvanlar ticari bir kaynaktan elde edilmiştir (bkz. Aletler sterilize edilir, cerrahi çalışma yüzeyi dezenfekte edilir, hayvanın cilt yüzeyi dezenfekte edilir ve cerrah işlem boyunca steril eldiven giyer.

1. Farelerin hazırlanması ve ameliyat öncesi kurulum

  1. Ameliyattan önceki gün, fareyi bir indüksiyon odasında% 2 izofluran ile uyuşturun (3.75 inç genişlik x 9 derinlik x 3.75 yükseklik, Malzeme Tablosuna bakınız).
    NOT: Cerrahi anestezi düzlemi, bireysel hayvana bağlı olarak genellikle 3-5 dakika içinde elde edilir. Anestezinin yeterliliğini ayak parmağı tutamıyla değerlendirin ve izofluran yüzdesini uygun şekilde artırın.
    1. Boynun ventral yönünü tıraş edin veya üreticinin talimatlarına göre kimyasal bir epilasyon maddesi kullanın (bkz.
  2. Ameliyat gününde, fareyi bir indüksiyon odasında% 2 izofluran ile uyuşturun. Anestezinin yeterliliğini ayak parmağı tutamıyla değerlendirin ve izofluran yüzdesini uygun şekilde artırın.
  3. Önleyici sistemik analjezi için deri altına 2 mg / kg meloksikam uygulayın. Anestezi altında oküler yaralanmaları ve kuruluğu önlemek için topikal oftalmik merhem uygulayın ( Malzeme Tablosuna bakınız).
  4. Fareyi sırt tarafında bir diseksiyon mikroskobu altına yerleştirin ve termal destek sağlayın. Hassas bir buharlaştırıcı ve burun konisi kullanarak% 2 -% 2.5 izofluran ile inhalasyon anestezisini koruyun. Her iki ön ayağı hipoalerjenik bantla nazikçe sabitleyin (bkz.
  5. Boynun traş edilmiş, ventral yönünü povidon-iyot ile temizleyin ve ardından% 70 alkolle silin. Bu işlemi iki kez daha tekrarlayın. Ameliyat bölgesinde gevşek saç bulunmadığından emin olun.
    NOT: Bir çift kısa kavisli forseps de kullanılabilir. Bu kapalı alanda yeterince çalışmak için bir çift ince veya oftalmik forseps kullandığınızdan emin olun. Kurumsal yönergelere göre ek ameliyat öncesi kurulum dahil edilebilir.

2. Diseksiyon

  1. Çenenin yaklaşık 2 mm altından sternal çentiğin 2 mm yukarısına kadar küçük bir makas kullanarak boynun ventral yönünde 1,5 cm'lik orta hat cilt kesisi yapın.
  2. Altta yatan fasya ve submandibular tükürük bezlerini ortaya çıkarmak için cildin kenarlarını forseps ile yanal olarak geri çekin. Her iki taraftaki derinin altına sivri uçlu makas sokarak ve yayarak cildi alttaki fasyadan ayırın. Altta yatan kasları ortaya çıkarmak için submandibular bezleri forseps ile kaudal olarak aşağı çekin.
  3. Digastrik kas ve omohyoid kasın arka göbeğinin kavşağını bulun (Şekil 1A, siyah daire). Anterior juguler ven uzunlamasına ve omohyoid kasın lateralinde uzandığı görülür.
    NOT: Omohyoid kas trakeayı uzunlamasına kaplarken, digastrik kas trakeanın kraniyal yönünde enine uzanır (Şekil 1C).
    1. 45° açılı forsepsin ucunu, üstteki derin servikal fasyadaki bir açıklığı delmek ve yaymak için bu kavşağa, ön juguler venin lateraline yerleştirin.
  4. Adım 2.3.1'de oluşturulan bu pencereyi 45° açılı forseps ile açık tutun. Diğer elinizde bir çift kavisli forseps ile yayma manevraları yaparak bu açıklığı daha da genişletin.

3. Ganglionun tanımlanması ve rezeksiyonu

  1. Ortaya çıkan boşluğun lateral duvarındaki superior servikal ganglionu (SCG) bulun. Yuvarlak, inci gibi bir doku olarak görünür.
    NOT: SCG tanımlanmamışsa, bu boşluktaki dokuların daha yanal ve üst olarak incelenmesi gerekir. SCG, bu bölgede sıklıkla bulunan yağ ile kolayca karıştırılabilir. Yağın hafif sarı bir tonu vardır, aksine SCG inci beyazı görünür.
  2. Diğer elinizle forseps ile açıklığı korurken, SCG'yi forseps ile nazikçe kavrayın ve daha iyi görünmesi için açıklıktan dışarı çekin.
  3. SCG göründükten sonra, SCG'nin hala çevre dokulara bağlı olduğu lateral tabanını kavrayın. Diğer elinizi kullanarak, SCG'yi ventral ve kaudal yönde yavaşça ve nazikçe geri çekin.
    1. Ganglionu yavaş yavaş avulse etmek için SCG'yi birkaç kez geri çekin. Geride artık ganglion kalıntısı kalmadığından emin olmak için bu manevra sırasında gangliyonu sağlam tutun.
      NOT: Bu adım sırasında kanama olabileceğinden gangliyonu hafifçe çekin. Küçük bir kanama meydana gelirse, açıklığın üzerinde 30 s ila 1 dakika boyunca basınç tutmak için oksitlenmiş rejenere selüloz veya küçük bir steril gazlı bez şeridi kullanın. Ardından, gazlı bezi yavaşça kaldırın ve yeniden değerlendirin. Kanama durana kadar açıklık üzerinde basınç tutma işlemini gerektiği kadar tekrarlayın.
  4. Gangliyonun tabanını tutan diğer forsepsleri yavaşça serbest bırakın. Kan birikintisine bakarak kanama olup olmadığını kontrol edin.
    NOT: Şu anda hafif sızma normaldir. Prosedürü kapatmadan ve bitirmeden önce izleyin ve kalıcı veya önemli bir kanama olmadığından emin olun. Böyle bir durumda, adım 3.3.1'de açıklandığı gibi açıklığın üzerinde baskı tutun.
  5. Tükürük bezlerini normal anatomik pozisyonlarına geri getirin. Basit kesintili 5-0 naylon sütürler kullanarak cildi yaklaştırın ve kapatın (bkz.
  6. Anesteziden tam olarak iyileşmeyi sağlamak için fareyi tek başına temiz bir kafese yerleştirin.
    NOT: Farenin anesteziden tamamen uyanması 5-15 dakika sürebilir. Sternal yaslığı korumak için yeterli bilinci yeniden kazanana kadar fareyi gözetimsiz bırakmayın. Tamamen iyileşene kadar fareyi diğer farelerle birlikte bir kafese koymayın. Fareyi 72 saat boyunca en az 24 saatte bir ameliyat sonrası iyileşme açısından değerlendirin.

Sonuçlar

Bu protokol, bir fare modelinde SCG'nin cerrahi olarak çıkarılmasını açıklar. Şekil 2 , CCA, anterior juguler ven ve SCG dahil olmak üzere anatomik işaretleri göstermektedir. Diseksiyonda (Şekil 2A), sağ anterior juguler ven trakeanın lateral sınırı boyunca uzanırken görülebilir. Anterior juguler venden daha derinde yer aldığından, sol CCA ve bunun internal karotis arter (İKA) ve eksternal karotis artere (ECA) bifurkasyonu venin lateralin...

Tartışmalar

Bu protokol, SCG girişinin cerrahi tek taraflı ablasyonu için bir fare modelini açıklar. Bu teknik, çeşitli ortamlarda adrenerjik innervasyonun etkilerini incelemeye izin verir. Ek olarak, rezeke edilen sempatik ganglion, in vitro deneyler için 3D matrigel kültüründe de büyütülebilir30.

SCGx ile ilgili çalışmalar çoğunlukla sıçanlarda gerçekleştirilmiştir, çünkü daha büyük anatomileri daha kolay anatomik görselleştirme ve diseksiy...

Açıklamalar

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yok.

Teşekkürler

Q. W., NIH T32CA009685 tarafından desteklendi. R. J. W., NIH R01CA219534 tarafından desteklendi. Memorial Sloan Kettering Kanser Merkezi Çekirdek Tesisleri, NIH P30CA008748 tarafından desteklenmiştir.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
Anti-Tyrosine Hydroxylase AntibodyEMD MilliporeAB152
Artificial Tears Lubricant Ophthalmic OintmentAkorn59399-162-35
Curity 2 x 2 Inch Gauze Sponge 8 Ply, SterileCovidien1806
Derf Needle HolderThomas Scientific1177K00
Dissecting Microscope
Dumont #5/45 ForcepsFine Science Tools11251-35
Dumont #7b ForcepsFine Science Tools11270-20
ETHILON Nylon SutureEthicon698H
Fine Scissors - ToughCutFine Science Tools14058-09
Hypoallergenic Surgical Tape3M Blenderm70200419342
Induction Chamber, 2 LiterVetEquip941444
IsofluraneBaxter1001936060
NairChurch & Dwight Co., Inc40002957chemical hair removing agent
NORADRENALINE RESEARCH ELISALabor Diagnostika Nord (Rocky Mountain Diagnostics)BA E-5200
NSG MouseJackson LaboratoryJAX:005557
Povidone-Iodine SwabstickPDIS41350
Webcol Alcohol PrepsCovidien5110

Referanslar

  1. Magnon, C., et al. Autonomic nerve development contributes to prostate cancer progression. Science. 341 (6142), 1236361 (2013).
  2. Zhao, C. M., et al. Denervation suppresses gastric tumorigenesis. Science Translational Medicine. 6 (250), 115 (2014).
  3. Zahalka, A. H., et al. Adrenergic nerves activate an angio-metabolic switch in prostate cancer. Science. 358 (6361), 321-326 (2017).
  4. Amit, M., et al. Loss of p53 drives neuron reprogramming in head and neck cancer. Nature. 578 (7795), 449-454 (2020).
  5. Renz, B. W., et al. Cholinergic signaling via muscarinic receptors directly and indirectly suppresses pancreatic tumorigenesis and cancer stemness. Cancer Discovery. 8 (11), 1458-1473 (2018).
  6. Lucido, C. T., et al. Innervation of cervical carcinoma is mediated by cancer-derived exosomes. Gynecologic Oncology. 154 (1), 228-235 (2019).
  7. Peterson, S. C., et al. Basal cell carcinoma preferentially arises from stem cells within hair follicle and mechanosensory niches. Cell Stem Cell. 16 (4), 400-412 (2015).
  8. Maronde, E., Stehle, J. H. The mammalian pineal gland: Known facts, unknown facets. Trends in Endocrinology & Metabolism. 18 (4), 142-149 (2007).
  9. Yamazaki, S., et al. Ontogeny of circadian organization in the rat. Journal of Biological Rhythms. 24 (1), 55-63 (2009).
  10. Huang, J., et al. S100+ cells: A new neuro-immune cross-talkers in lymph organs. Scientific Reports. 3 (1), 1114 (2013).
  11. Dieguez, H. H., et al. Melatonin protects the retina from experimental nonexudative age-related macular degeneration in mice. Journal of Pineal Research. 68 (4), 12643 (2020).
  12. Liu, H., et al. Bilateral superior cervical ganglionectomy attenuates the progression of β-aminopropionitrile-induced aortic dissection in rats. Life Sciences. 193, 200-206 (2018).
  13. Zhang, W., et al. The role of the superior cervical sympathetic ganglion in ischemia reperfusion-induced acute kidney injury in rats. Frontiers in Medicine. 9, 792000 (2022).
  14. Zhang, W., et al. Superior cervical ganglionectomy alters gut microbiota in rats. American Journal of Translational Research. 14 (3), 2037-2050 (2022).
  15. Wang, X., et al. β-Adrenergic signaling induces Notch-mediated salivary gland progenitor cell control. Stem Cell Reports. 16 (11), 2813-2824 (2021).
  16. Boyd, A., Aragon, I. V., Abou Saleh, L., Southers, D., Richter, W. The cAMP-phosphodiesterase 4 (PDE4) controls β-adrenoceptor- and CFTR-dependent saliva secretion in mice. Biochemical Journal. 478 (10), 1891-1906 (2021).
  17. Smith, B., Butler, M. The effects of long-term propranolol on the salivary glands and intestinal serosa of the mouse. The Journal of Pathology. 124 (4), 185-187 (1978).
  18. Sucharov, C. C., et al. β-Adrenergic receptor antagonism in mice: A model for pediatric heart disease. Journal of Applied Physiology. 115 (7), 979-987 (2013).
  19. Ding, C., Walcott, B., Keyser, K. T. The alpha1- and beta1-adrenergic modulation of lacrimal gland function in the mouse. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 48 (4), 1504-1510 (2007).
  20. Grisanti, L. A., et al. Prior β-blocker treatment decreases leukocyte responsiveness to injury. JCI Insight. 5 (9), 99485 (2019).
  21. Alito, A. E., et al. Autonomic nervous system regulation of murine immune responses as assessed by local surgical sympathetic and parasympathetic denervation. Acta Physiologica, Pharmacologica et Therapeutica Latinoamericana. 37 (3), 305-319 (1987).
  22. Yun, H., Lathrop, K. L., Hendricks, R. L. A central role for sympathetic nerves in herpes stromal keratitis in mice. Ophthalmology & Visual Science. 57 (4), 1749-1756 (2016).
  23. Haug, S. R., Heyeraas, K. J. Effects of sympathectomy on experimentally induced pulpal inflammation and periapical lesions in rats. Neuroscience. 120 (3), 827-836 (2003).
  24. Savastano, L. E., et al. A standardized surgical technique for rat superior cervical ganglionectomy. Journal of Neuroscience Methods. 192 (1), 22-33 (2010).
  25. Garcia, J. B., Romeo, H. E., Basabe, J. C., Cardinali, D. P. Effect of superior cervical ganglionectomy on insulin release by murine pancreas slices. Journal of the Autonomic Nervous System. 22 (2), 159-165 (1988).
  26. Ziegler, K. A., et al. Local sympathetic denervation attenuates myocardial inflammation and improves cardiac function after myocardial infarction in mice. Cardiovascular Research. 114 (2), 291-299 (2017).
  27. Getsy, P. M., Coffee, G. A., Hsieh, Y. H., Lewis, S. J. The superior cervical ganglia modulate ventilatory responses to hypoxia independently of preganglionic drive from the cervical sympathetic chain. Journal of Applied Physiology. 131 (2), 836-857 (2021).
  28. Dieguez, H. H., et al. Superior cervical gangliectomy induces non-exudative age-related macular degeneration in mice. Disease Models & Mechanisms. 11 (2), 031641 (2018).
  29. Zhang, B., et al. Hyperactivation of sympathetic nerves drives depletion of melanocyte stem cells. Nature. 577 (7792), 676-681 (2020).
  30. Pirzgalska, R. M., et al. Sympathetic neuron-associated macrophages contribute to obesity by importing and metabolizing norepinephrine. Nature Medicine. 23 (11), 1309-1318 (2017).
  31. Kajimura, D., Paone, R., Mann, J. J., Karsenty, G. Foxo1 regulates Dbh expression and the activity of the sympathetic nervous system in vivo. Molecular Metabolism. 3 (7), 770-777 (2014).

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

Geri ekmeSay 190

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır