Técnica quirúrgica para la ganglionectomía cervical superior en un modelo murino

Resumen

El presente protocolo describe un modelo murino de ablación de inervación adrenérgica mediante la identificación y resección del ganglio cervical superior.

Resumen

Cada vez hay más pruebas que sugieren que el sistema nervioso simpático desempeña un papel importante en la progresión del cáncer. La inervación adrenólica regula la secreción de las glándulas salivales, el ritmo circadiano, la degeneración macular, la función inmunitaria y la fisiología cardíaca. La simpatectomía quirúrgica murina es un método para estudiar los efectos de la inervación adrenérgica al permitir una ablación adrenérgica completa y unilateral, evitando la necesidad de una intervención farmacológica repetida y los efectos secundarios asociados. Sin embargo, la simpatectomía quirúrgica en ratones es técnicamente desafiante debido al pequeño tamaño del ganglio cervical superior. En este estudio se describe una técnica quirúrgica para identificar y resecar de forma fiable el ganglio cervical superior para extirpar el sistema nervioso simpático. La identificación y extirpación exitosas del ganglio se validan mediante la obtención de imágenes de los ganglios simpáticos fluorescentes utilizando un ratón transgénico, la identificación del síndrome de Horner posterior a la resección, la tinción de marcadores adrenérgicos en los ganglios resecados y la observación de una inmunofluorescencia adrenenérgica disminuida en los órganos diana después de la simpatectomía. Este modelo permite futuros estudios de la progresión del cáncer, así como de otros procesos fisiológicos regulados por el sistema nervioso simpático.

Introducción

Múltiples estudios han reportado que los nervios en el microambiente tumoral desempeñan un papel activo en el apoyo a la progresión tumoral. Se ha demostrado que la ablación de los nervios simpáticos adrenérgicos perjudica el desarrollo y la diseminación tumoral en el cáncer de próstata y gástrico in vivo ^1,2,3, mientras que el bloqueo farmacológico de los receptores adrenérgicos inhibe el crecimiento tumoral en el cáncer de cabeza y cuello⁴. También se ha descrito afectación neural simpática en la progresión del carcinoma de páncreas, cuello uterino y basocelular ^5,6,7.

Dentro del sistema nervioso simpático, el ganglio cervical superior (SCG) es el único ganglio del tronco simpático que inerva la cabeza. El SCG regula diversas funciones fisiológicas, como la secreción salival y el ritmo circadiano, e inerva directamente los ganglios linfáticos cervicales 8,9,10. El SCG también ha sido implicado en procesos patológicos como la degeneración macular¹¹ y la progresión de la disección aórtica¹². Además, se ha descrito que la resección del SCG agrava la lesión renal aguda inducida por la isquemia^{reperfusión 13} y también altera la microbiota intestinal en ratas¹⁴.

La ablación completa de la SCG en un modelo de ratón representaría una técnica experimental valiosa para permitir la investigación del cáncer y del sistema nervioso autónomo. Si bien muchos estudios han utilizado el bloqueo farmacológico del receptor adrenérgico como ablación adrenérgica 15,16,17,18,19,20, la resección quirúrgica permite una ablación adrenenérgica completa y unilateral, evitando la necesidad de una intervención farmacológica repetida y los efectos secundarios asociados ^21,22,23.

La resección quirúrgica de la SCG se ha descrito en ratas²⁴, y la mayoría de los informes que estudian el efecto de la ganglionectomía cervical superior (SCGx) han empleado el modelo de rata. En comparación con el modelo de rata, SCGx es técnicamente más desafiante en ratones debido al pequeño tamaño de la SCG. Sin embargo, los ratones son comparativamente más fáciles de manejar, más rentables y más susceptibles a la manipulación genética. García et al. fueron uno de los primeros en reportar SCGx en ratones, y se encontró que afectaba la liberación de insulina²⁵. Más recientemente, Ziegler et al. describieron SCGx en ratones basándose en la técnica publicada descrita para ratas^24,26. Este y otros artículos describen un método en el que primero se identifica y disecciona la arteria carótida común (ACC), y posteriormente se retira el SCG de la bifurcación de la CCA^21,22,27,28. En este artículo, se describe una técnica menos invasiva y más segura en ratones que evita la disección de la ACC, minimizando así la complicación más grave de este procedimiento: el sangrado por una lesión en la CCA.

Protocolo

Los procedimientos con animales descritos aquí fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales del Memorial Sloan Kettering Cancer Center. Aquí se utilizaron ratones NSG machos y hembras de ocho semanas de edad. Los animales se obtuvieron de una fuente comercial (ver Tabla de Materiales). Los instrumentos se esterilizan, se desinfecta la superficie de trabajo quirúrgico, se desinfecta la superficie de la piel del animal y el cirujano usa guantes estériles durante todo el procedimiento.

1. Preparación de los ratones y configuración preoperatoria

1. El día antes de la cirugía, anestesiar al ratón con isoflurano al 2% en una cámara de inducción (3,75 de ancho x 9 de profundidad x 3,75 de alto, ver Tabla de Materiales).
   NOTA: Un plano quirúrgico de anestesia generalmente se logra en 3-5 minutos, dependiendo de cada animal. Evaluar la idoneidad de la anestesia mediante el pellizco del dedo del pie y aumentar el porcentaje de isoflurano según corresponda.
   1. Afeitar la cara ventral del cuello o utilizar un agente químico de depilación de acuerdo con las instrucciones del fabricante (ver Tabla de Materiales).
2. El día de la cirugía, anestesiar al ratón con isoflurano al 2% en una cámara de inducción. Evaluar la idoneidad de la anestesia mediante el pellizco del dedo del pie y aumentar el porcentaje de isoflurano según corresponda.
3. Administrar 2 mg/kg de meloxicam por vía subcutánea para analgesia sistémica preventiva. Aplique ungüento oftálmico tópico (ver Tabla de materiales) para prevenir lesiones oculares y sequedad bajo anestesia.
4. Coloque al ratón bajo un microscopio de disección en su lado dorsal y proporciónele soporte térmico. Mantenga la anestesia inhalatoria con isoflurano al 2%-2.5% usando un vaporizador de precisión y un cono nasal. Asegure suavemente ambas extremidades anteriores con cinta hipoalergénica (consulte la Tabla de materiales).
5. Limpie la cara ventral afeitada del cuello con povidona yodada y luego limpie con alcohol al 70%. Repite este proceso dos veces más. Asegúrese de que el sitio quirúrgico esté libre de cabello suelto.
   NOTA: También se puede usar un par de pinzas cortas curvas. Asegúrese de usar un par de pinzas finas u oftálmicas para trabajar adecuadamente en este espacio confinado. Se puede incluir una configuración preoperatoria adicional según las pautas institucionales.

2. Disección

1. Realice una incisión de 1,5 cm en la línea media de la piel en la cara ventral del cuello con unas tijeras pequeñas desde aproximadamente 2 mm por debajo de la barbilla hasta 2 mm por encima de la muesca esternal.
2. Retraiga los bordes de la piel lateralmente con pinzas para exponer la fascia subyacente y las glándulas salivales submandibulares. Separe la piel de la fascia subyacente insertando unas tijeras puntiagudas debajo de la piel a cada lado y extendiéndola. Tire hacia abajo de las glándulas submandibulares caudalmente con fórceps para revelar los músculos subyacentes.
3. Localice la unión del vientre posterior del músculo digástrico y el músculo omohioideo (Figura 1A, círculo negro). La vena yugular anterior se ve corriendo longitudinal y lateral al músculo omohioideo.
   NOTA: El músculo omohioideo cubre la tráquea longitudinalmente, mientras que el músculo digástrico se encuentra transversalmente en la cara craneal de la tráquea (Figura 1C).
   1. Inserte la punta de las pinzas en ángulo de 45° en esta unión, lateral a la vena yugular anterior, para perforar y extender una abertura en la fascia cervical profunda suprayacente.
4. Mantenga abierta esta ventana creada en el paso 2.3.1 con las pinzas en ángulo de 45°. Amplíe esta abertura realizando maniobras de extensión con un par de pinzas curvas en la otra mano.

3. Identificación y resección del ganglio

1. Localice el ganglio cervical superior (SCG) en la pared lateral del espacio revelado. Aparece como un tejido redondo y nacarado.
   NOTA: Si no se identifica el SCG, los tejidos de este espacio deben examinarse más lateral y superiormente. El SCG puede confundirse fácilmente con la grasa, que a menudo está presente en esta región. La grasa tiene un tinte ligeramente amarillo, mientras que, por el contrario, el SCG aparece de color blanco perla.
2. Mientras mantiene la abertura con fórceps con la otra mano, sujete suavemente el SCG con pinzas y sáquelo de la abertura para que se vea mejor.
3. Una vez que el SCG esté a la vista, agarre la base lateral del SCG, donde todavía está unido a los tejidos circundantes. Con la otra mano, retraiga lenta y suavemente el SCG en dirección ventral y caudal.
   1. Retraiga el SCG varias veces para avulpar gradualmente el ganglio poco a poco. Mantenga el ganglio intacto durante esta maniobra para asegurarse de que no queden restos de ganglios residuales.
      NOTA: Tire del ganglio suavemente, ya que puede producirse sangrado durante este paso. Si se produce una hemorragia leve, use celulosa regenerada oxidada o una pequeña tira de gasa estéril para mantener la presión sobre la abertura durante 30 s a 1 min. Luego, levante lentamente la gasa y vuelva a evaluar. Repita el proceso de mantener la presión sobre la abertura según sea necesario hasta que el sangrado se haya detenido.
4. Suelte lentamente las otras pinzas que sujetan la base del ganglio. Compruebe si hay sangrado buscando sangre acumulada.
   NOTA: Es normal que haya una ligera supuración en este momento. Controle y asegúrese de que no haya sangrado persistente o significativo antes de cerrar y finalizar el procedimiento. Si esto ocurre, mantenga la presión sobre la abertura, como se describe en el paso 3.3.1.
5. Mueva las glándulas salivales a sus posiciones anatómicas normales. Aproximar y cerrar la piel con suturas simples de nylon 5-0 interrumpidas (ver Tabla de Materiales).
6. Coloque al ratón en una jaula limpia por sí mismo para permitir una recuperación completa de la anestesia.
   NOTA: El ratón puede tardar entre 5 y 15 minutos en despertarse completamente de la anestesia. No deje al ratón desatendido hasta que haya recuperado la conciencia suficiente para mantener la decúbito esternal. No coloque al ratón en una jaula con otros ratones hasta que se haya recuperado por completo. Evaluar la recuperación postquirúrgica del ratón al menos una vez cada 24 h durante 72 h.

Resultados

Este protocolo describe la extirpación quirúrgica de la SCG en un modelo de ratón. La figura 2 ilustra los puntos de referencia anatómicos, incluyendo el CCA, la vena yugular anterior y el SCG. Con la disección (Figura 2A), se puede ver la vena yugular anterior derecha discurriendo a lo largo del borde lateral de la tráquea. Como se encuentra más profundo que la vena yugular anterior, la CCA izquierda y su bifurcación en la arteria carótida interna (ACI...

Discusión

Este protocolo describe un modelo murino para la ablación quirúrgica unilateral de la entrada de SCG. Esta técnica permite estudiar los efectos de la inervación adrenérgica en diversos entornos. Además, el ganglio simpático resecado también puede cultivarse en cultivo de matrigel 3D para experimentos in vitro ³⁰.

Los estudios que involucran SCGx se han realizado principalmente en ratas, ya que su anatomía más grande permite una visualización y disecc...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anti-Tyrosine Hydroxylase Antibody	EMD Millipore	AB152
Artificial Tears Lubricant Ophthalmic Ointment	Akorn	59399-162-35
Curity 2 x 2 Inch Gauze Sponge 8 Ply, Sterile	Covidien	1806
Derf Needle Holder	Thomas Scientific	1177K00
Dissecting Microscope
Dumont #5/45 Forceps	Fine Science Tools	11251-35
Dumont #7b Forceps	Fine Science Tools	11270-20
ETHILON Nylon Suture	Ethicon	698H
Fine Scissors - ToughCut	Fine Science Tools	14058-09
Hypoallergenic Surgical Tape	3M Blenderm	70200419342
Induction Chamber, 2 Liter	VetEquip	941444
Isoflurane	Baxter	1001936060
Nair	Church & Dwight Co., Inc	40002957	chemical hair removing agent
NORADRENALINE RESEARCH ELISA	Labor Diagnostika Nord (Rocky Mountain Diagnostics)	BA E-5200
NSG Mouse	Jackson Laboratory	JAX:005557
Povidone-Iodine Swabstick	PDI	S41350
Webcol Alcohol Preps	Covidien	5110