マウスモデルにおける上頚部神経節摘出術の手術手技

要約

本プロトコルは、上頸部神経節を同定および切除することによるアドレナリン作動性神経支配のアブレーションのマウスモデルを記載する。

要約

交感神経系が癌の進行に重要な役割を果たすことを示唆する証拠が増えています。アドレナリン作動性神経支配は、唾液腺分泌、概日リズム、黄斑変性症、免疫機能、および心臓生理学を調節します。マウス外科的交感神経切除術は、反復的な薬理学的介入の必要性と関連する副作用を回避しながら、完全な片側アドレナリン作動性アブレーションを可能にすることにより、アドレナリン作動性神経支配の効果を研究する方法です。しかし、マウスの外科的交感神経切除術は、上頸部神経節のサイズが小さいため、技術的に困難です。本研究では,上頸部神経節を確実に同定・切除し,交感神経系を切除するための術法について述べる.神経節の同定と除去の成功は、トランスジェニックマウスを使用して蛍光交感神経節を画像化し、切除後のホーナー症候群を特定し、切除された神経節のアドレナリン作動性マーカーを染色し、交感神経切除後の標的臓器におけるアドレナリン作動性免疫蛍光の低下を観察することによって検証されます。このモデルは、交感神経系によって調節される他の生理学的プロセスと同様に、癌の進行の将来の研究を可能にします。

概要

複数の研究により、腫瘍微小環境の神経が腫瘍の進行をサポートする上で積極的な役割を果たすことが報告されています。アドレナリン作動性交感神経のアブレーションは、in vivoで前立腺がんおよび胃がんの腫瘍の発生と播種を損なうことが示されています^1,2,3一方、アドレナリン受容体の薬理学的遮断は頭頸部がんの腫瘍増殖を阻害します⁴。交感神経の関与は、膵臓癌、子宮頸癌、および基底細胞癌の進行においても説明されています^5,6,7。

交感神経系内では、上頸部神経節(SCG)が頭を神経支配する交感神経幹の唯一の神経節です。SCGは、唾液分泌や概日リズムなどの様々な生理機能を調節し、頸部リンパ節を直接神経支配する^8,9,10。SCGはまた、黄斑変性症¹¹および大動脈解離¹²の進行などの病理学的プロセスにも関与している。さらに、SCGの切除は、虚血再灌流誘発性急性腎障害を悪化させ¹³、ラットの腸内細菌叢を変化させることが報告されています¹⁴。

マウスモデルにおけるSCGの完全なアブレーションは、癌と自律神経系の研究を可能にする貴重な実験技術を表すでしょう。多くの研究がアドレナリン作動性アブレーションとして薬理学的アドレナリン作動性受容体遮断を利用しているが15,16,17,18,19,20、外科的切除は、反復的な薬理学的介入の必要性および関連する副作用を回避しながら、完全な片側アドレナリン作動性アブレーションを可能にする^21,22,23。

SCGの外科的切除はラット²⁴で記載されており、上頸部神経節切除術(SCGx)の効果を研究しているほとんどの報告はラットモデルを採用しています。ラットモデルと比較して、SCGxは、SCGのサイズが小さいため、マウスでは技術的により困難です。ただし、マウスは比較的取り扱いが簡単で、費用効果が高く、遺伝子操作に適しています。Garciaらは、マウスでSCGxを最初に報告した人の1人であり、インスリン放出に影響を与えることが判明しました²⁵。より最近になって、Zieglerらは、ラットについて記載された公表された技術に基づいてマウスにおけるSCGxを記載した^24、26。この記事および他の記事は、総頸動脈(CCA)が最初に同定され解剖され、続いてSCGがCCA^21、22、^27、28の分岐部から除去される方法を説明する。この記事では、CCAの解剖を回避し、それによってこの手順の最も深刻な合併症であるCCAの損傷による出血を最小限に抑える、より侵襲的で安全な技術をマウスで説明します。

プロトコル

ここに記載されている動物の手順は、メモリアルスローンケタリングがんセンターの施設動物管理および使用委員会によって承認されました。ここでは、8週齢の雄および雌のNSGマウスを使用した。動物は商業的な供給源から入手した( 材料表を参照)。器具は滅菌され、外科作業面は消毒され、動物の皮膚表面は消毒され、外科医は処置中ずっと滅菌手袋を着用します。

1. マウスの準備と術前のセットアップ

1. 手術の前日に、誘導チャンバー(幅3.75 x 奥行き9 x 高さ3.75、 材料表参照)で2%イソフルランでマウスに麻酔をかけます。
   注:麻酔の外科的平面は、個々の動物に応じて、通常3〜5分で達成されます。つま先をつまんで麻酔の妥当性を評価し、必要に応じてイソフルランの割合を増やします。.
   1. 首の腹側を剃るか、製造元の指示に従って化学脱毛剤を使用してください( 材料表を参照)。
2. 手術当日に、誘導チャンバー内で2%イソフルランでマウスを麻酔する。つま先をつまんで麻酔の妥当性を評価し、必要に応じてイソフルランの割合を増やします。.
3. 先制全身鎮痛のために2 mg / kgのメロキシカムを皮下投与します。.局所眼軟膏( 材料表を参照)を塗布して、麻酔下での眼の損傷や乾燥を防ぎます。.
4. マウスを解剖顕微鏡の背側に置き、熱サポートを提供します。精密気化器とノーズコーンを使用して、2%〜2.5%のイソフルランで吸入麻酔を維持します。低刺激性テープで両前肢をそっと固定します( 材料表を参照)。
5. 首の剃った腹側をポビドンヨードできれいにしてから、70%アルコールで拭きます。このプロセスをさらに2回繰り返します。手術部位に抜け毛がないことを確認してください。
   注:短い湾曲した鉗子のペアを使用することもできます。この限られたスペースで適切に機能するために、細かい鉗子または眼科用鉗子のペアを使用してください。追加の術前セットアップは、施設のガイドラインに従って含めることができます。

2.解剖

1. あごの下約2 mmから胸骨の切り欠きの上2 mmまでの小さなハサミを使用して、首の腹側に1.5 cmの正中線の皮膚切開を行います。
2. 鉗子で皮膚の縁を横方向に引っ込めて、下にある筋膜と顎下唾液腺を露出させます。両側の皮膚の下に先のとがったハサミを挿入して広げることにより、下にある筋膜から皮膚を分離します。鉗子で顎下腺を尾側に引き下げて、下にある筋肉を明らかにします。
3. 顎二腹筋と舌骨筋の後腹の接合部を見つけます(図1A、黒丸)。前頸静脈は、舌骨筋に対して縦方向および外側に走っているのが見られます。
   注:舌骨筋は気管を縦方向に覆い、顎二腹筋は気管の頭蓋側に横向きにあります(図1C)。
   1. 前頸静脈の外側にあるこの接合部に45°の角度の鉗子の先端を挿入して、上にある深い頸部筋膜に開口部を突き刺して広げます。
4. 手順2.3.1で作成したこのウィンドウは、45°の角度の鉗子で開いたままにします。もう一方の手で一対の湾曲した鉗子で拡散操作を実行して、この開口部をより広く拡大します。

3.神経節の同定と切除

1. 明らかにされた空間の側壁にある上頸部神経節(SCG)を見つけます。それは丸い真珠のような組織として現れます。
   注:SCGが特定されない場合は、この空間の組織をより横方向および上方に検査する必要があります。SCGは、この領域にしばしば存在する脂肪と簡単に混同される可能性があります。脂肪はわずかに黄色味を帯びていますが、対照的に、SCGは真珠のように白く見えます。
2. もう一方の手で鉗子で開口部を維持しながら、鉗子でSCGをそっとつかみ、開口部から引き出して見やすくします。
3. SCGが見えたら、SCGの外側の基部をつかみ、周囲の組織に付着したままにします。もう一方の手を使用して、SCGを腹側および尾方向にゆっくりと穏やかに引っ込めます。
   1. SCGを複数回引っ込めて、神経節を少しずつ徐々に剥離します。この操作中は神経節を無傷に保ち、残りの神経節の残骸が残らないようにします。
      注意: このステップで出血が発生する可能性があるため、神経節をそっと引っ張ってください。軽度の出血が発生した場合は、酸化再生セルロースまたは滅菌ガーゼの小さなストリップを使用して、開口部に30秒から1分間圧力を保持します。次に、ガーゼをゆっくりと持ち上げて再評価します。出血が止まるまで、必要に応じて開口部に圧力を保持するプロセスを繰り返します。
4. 神経節の基部を保持している他の鉗子をゆっくりと放します。血液の溜まりを探して出血をチェックします。
   注意: この時点でのわずかなにじみは正常です。手順を閉じて終了する前に、持続的または重大な出血がないことを監視し、確認します。これが発生した場合は、手順3.3.1の説明に従って、開口部に圧力をかけたままにします。
5. 唾液腺を通常の解剖学的位置に戻します。単純な中断された5-0ナイロン縫合糸を使用して皮膚を近似して閉じます( 材料表を参照)。
6. マウスを単独できれいなケージに入れて、麻酔から完全に回復できるようにします。
   注意: マウスが麻酔から完全に目覚めるまでに5〜15分かかる場合があります。胸骨横臥を維持するのに十分な意識を取り戻すまで、マウスを放置しないでください。完全に回復するまで、マウスを他のマウスと一緒にケージに入れないでください。マウスの術後回復を少なくとも24時間に1回、72時間評価する。

結果

このプロトコルは、マウスモデルにおけるSCGの外科的除去を記述する。 図2 は、CCA、前頸静脈、およびSCGを含む解剖学的ランドマークを示しています。解剖(図2A)では、右前頸静脈が気管の外側境界に沿って流れているのを見ることができます。前頸静脈よりも深い位置にあるため、左CCAとその内頸動脈(ICA)および外頸動脈(ECA)への分岐部は、静脈?...

ディスカッション

このプロトコルは、SCG入力の外科的片側アブレーションのためのマウスモデルを記述する。この技術は、様々な設定におけるアドレナリン作動性神経支配の効果を研究することを可能にする。さらに、切除された交感神経節は、 in vitro 実験³⁰用の3Dマトリゲル培養で増殖させることもできる。

SCGxを含む研究は、解剖学的構造が大きいため、解剖?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anti-Tyrosine Hydroxylase Antibody	EMD Millipore	AB152
Artificial Tears Lubricant Ophthalmic Ointment	Akorn	59399-162-35
Curity 2 x 2 Inch Gauze Sponge 8 Ply, Sterile	Covidien	1806
Derf Needle Holder	Thomas Scientific	1177K00
Dissecting Microscope
Dumont #5/45 Forceps	Fine Science Tools	11251-35
Dumont #7b Forceps	Fine Science Tools	11270-20
ETHILON Nylon Suture	Ethicon	698H
Fine Scissors - ToughCut	Fine Science Tools	14058-09
Hypoallergenic Surgical Tape	3M Blenderm	70200419342
Induction Chamber, 2 Liter	VetEquip	941444
Isoflurane	Baxter	1001936060
Nair	Church & Dwight Co., Inc	40002957	chemical hair removing agent
NORADRENALINE RESEARCH ELISA	Labor Diagnostika Nord (Rocky Mountain Diagnostics)	BA E-5200
NSG Mouse	Jackson Laboratory	JAX:005557
Povidone-Iodine Swabstick	PDI	S41350
Webcol Alcohol Preps	Covidien	5110