טכניקה כירורגית לכריתת גנגליון צוואר הרחם מעולה במודל מורין

Summary

הפרוטוקול הנוכחי מתאר מודל עכברי של אבלציה של עצבוב אדרנרגי על ידי זיהוי וכריתה של גנגליון צוואר הרחם העליון.

Abstract

עדויות הולכות וגדלות מצביעות על כך שמערכת העצבים הסימפתטית ממלאת תפקיד חשוב בהתקדמות הסרטן. עצבוב אדרנרגי מווסת את הפרשת בלוטת הרוק, שעון ביולוגי, ניוון מקולרי, תפקוד מערכת החיסון ופיזיולוגיה של הלב. Murine surgical sympathectomy היא שיטה לחקר ההשפעות של עצבוב אדרנרגי על ידי מתן אפשרות אבלציה אדרנרגית מלאה, חד צדדית תוך הימנעות מהצורך בהתערבות פרמקולוגית חוזרת ונשנית ותופעות הלוואי הנלוות. עם זאת, כריתת סימפטקטומיה כירורגית בעכברים מאתגרת מבחינה טכנית בגלל הגודל הקטן של גנגליון צוואר הרחם העליון. מחקר זה מתאר טכניקה כירורגית לזיהוי אמין וכריתה של גנגליון צוואר הרחם העליון כדי לעבד את מערכת העצבים הסימפתטית. הזיהוי וההסרה המוצלחים של הגנגליון מאומתים על ידי הדמיה של הגרעינים הסימפתטיים הפלואורסצנטיים באמצעות עכבר מהונדס, זיהוי תסמונת הורנר לאחר כריתה, צביעה לסמנים אדרנרגיים בגרעינים המנותחים, וצפייה באימונופלואורסנציה אדרנרגית מופחתת באיברי המטרה לאחר כריתת סימפתקטיה. מודל זה מאפשר מחקרים עתידיים על התקדמות הסרטן, כמו גם תהליכים פיזיולוגיים אחרים המווסתים על ידי מערכת העצבים הסימפתטית.

Introduction

מחקרים רבים דיווחו כי העצבים במיקרו-סביבה של הגידול ממלאים תפקיד פעיל בתמיכה בהתקדמות הגידול. אבלציה של עצבים סימפתטיים אדרנרגיים הוכחה כפוגעת בהתפתחות הגידול ובהתפשטותו בסרטן הערמונית והקיבה in vivo ^1,2,3, בעוד שהחסימה הפרמקולוגית של קולטנים אדרנרגיים מעכבת את צמיחת הגידול בסרטן הראש והצוואר⁴. מעורבות עצבית סימפתטית תוארה גם בהתקדמות קרצינומה של תאי הלבלב, צוואר הרחם ותאי הבסיס ^5,6,7.

בתוך מערכת העצבים הסימפתטית, גנגליון צוואר הרחם העליון (SCG) הוא הגנגליון היחיד של החדק הסימפתטי שמעצבב את הראש. ה- SCG מווסת תפקודים פיזיולוגיים שונים, כגון הפרשת רוק ושעון ביולוגי, ומעצבב ישירות את בלוטות הלימפה הצוואריות ^8,9,10. ה- SCG היה מעורב גם בתהליכים פתולוגיים כגון ניוון מקולרי¹¹ והתקדמות דיסקציה של אבי העורקים¹². בנוסף, כריתה של SCG דווחה כמחמירה פגיעה חריפה בכליות הנגרמת על ידי איסכמיה¹³ וגם משנה את מיקרוביוטת המעי בחולדות¹⁴.

אבלציה מלאה של SCG במודל עכבר תייצג טכניקה ניסיונית רבת ערך כדי לאפשר סרטן ומחקר מערכת העצבים האוטונומית. בעוד שמחקרים רבים השתמשו בחסימת קולטן אדרנרגי פרמקולוגי כאבלציה אדרנרגית 15,16,17,18,19,20, כריתה כירורגית מאפשרת אבלציה אדרנרגית מלאה וחד צדדית תוך הימנעות מהצורך בהתערבות פרמקולוגית חוזרת ותופעות הלוואי הנלוות ^21,22,23.

כריתה כירורגית של SCG תוארה בחולדות²⁴, ורוב הדיווחים שחקרו את ההשפעה של כריתת גנגליון צווארי עליון (SCGx) השתמשו במודל החולדות. בהשוואה למודל החולדות, SCGx מאתגר יותר מבחינה טכנית בעכברים בשל גודלו הקטן של ה-SCG. עם זאת, עכברים קלים יחסית לטיפול, חסכוניים יותר ונוחים יותר למניפולציה גנטית. גרסיה ועמיתיו היו בין הראשונים לדווח על SCGx בעכברים, ונמצא שהוא משפיע על שחרור אינסולין²⁵. לאחרונה, Ziegler et al. תיארו SCGx בעכברים בהתבסס על הטכניקה שפורסמה שתוארה עבור חולדות^24,26. מאמר זה ומאמרים אחרים מתארים שיטה שבה עורק התרדמה המשותף (CCA) מזוהה ומנותח לראשונה, ולאחר מכן ה-SCG מוסר מהפיצול של CCA^21,22,27,28. במאמר זה, טכניקה פחות פולשנית ובטוחה יותר מתוארת בעכברים המונעת את הדיסקציה של CCA, ובכך ממזערת את הסיבוך החמור ביותר של הליך זה – דימום מפגיעה ב- CCA.

Protocol

ההליכים המתוארים כאן אושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים במרכז הסרטן ממוריאל סלואן קטרינג. עכברי NSG זכרים ונקבות בני שמונה שבועות שימשו כאן. בעלי החיים התקבלו ממקור מסחרי (ראו טבלת חומרים). המכשירים מעוקרים, משטח העבודה הכירורגי עובר חיטוי, משטח העור של בעל החיים עובר חיטוי, והמנתח לובש כפפות סטריליות לאורך כל ההליך.

1. הכנת העכברים ומערך טרום ניתוחי

1. יום לפני הניתוח, יש להרדים את העכבר עם איזופלורן 2% בתא אינדוקציה (3.75 אינץ' רוחב x 9 אינץ' עומק x 3.75 גובה, ראה טבלת חומרים).
   הערה: מישור כירורגי של הרדמה מושג בדרך כלל תוך 3-5 דקות, בהתאם לחיה הבודדת. להעריך את הלימות ההרדמה על ידי צביטת בוהן, ולהגדיל את אחוז isoflurane לפי הצורך.
   1. יש לגלח את החלק הגחוני של הצוואר או להשתמש בחומר כימי להסרת שיער בהתאם להוראות היצרן (ראה טבלת חומרים).
2. ביום הניתוח, להרדים את העכבר עם 2% isoflurane בתא אינדוקציה. להעריך את הלימות ההרדמה על ידי צביטת בוהן, ולהגדיל את אחוז isoflurane לפי הצורך.
3. יש לתת 2 מ"ג/ק"ג של meloxicam תת עורית לשיכוך כאבים מערכתי מונע. יש למרוח משחת עיניים מקומית (ראו טבלת חומרים) למניעת פגיעות עיניים ויובש בהרדמה.
4. הניחו את העכבר תחת מיקרוסקופ מנתח בצד הגבי שלו וספקו תמיכה תרמית. יש לשמור על הרדמה אינהלציונית עם איזופלורן 2%-2.5% באמצעות וופורייזר מדויק וחרוט אף. הדקו בעדינות את שתי הגפיים הקדמיות בעזרת סרט היפואלרגני (ראו טבלת חומרים).
5. נקו את החלק הגחוני המגולח של הצוואר עם פובידון-יוד, ולאחר מכן נגבו עם 70% אלכוהול. חזור על תהליך זה פעמיים נוספות. ודא כי אתר הניתוח נקי מכל שיער רופף.
   הערה: ניתן להשתמש גם בזוג מלקחיים קצרים ומעוקלים. הקפידו להשתמש בזוג מלקחיים עדינים או אופתלמיים כדי לעבוד כראוי בחלל סגור זה. ניתן לכלול מערך טרום ניתוחי נוסף בהתאם להנחיות המוסדיות.

2. דיסקציה

1. בצע חתך עור בקו האמצע של 1.5 ס"מ באספקט הגחוני של הצוואר באמצעות מספריים קטנים מכ-2 מ"מ מתחת לסנטר ועד 2 מ"מ מעל החריץ החזה.
2. משכו את קצוות העור לרוחב בעזרת מלקחיים כדי לחשוף את הפאשיה הבסיסית ואת בלוטות הרוק התת-לסתות. הפרידו את העור מהפאשיה שמתחתיו על ידי החדרת מספריים מחודדים מתחת לעור בכל צד והתפשטות. משוך מטה את הבלוטות submandibular caudally עם מלקחיים כדי לחשוף את השרירים הבסיסיים.
3. אתרו את צומת הבטן האחורית של שריר הקיבה ושריר האומוהיואיד (איור 1A, עיגול שחור). הווריד הצווארי הקדמי נראה רץ לאורך ולרוחב לשריר האומוהיואיד.
   הערה: שריר האומוהיואיד מכסה את קנה הנשימה לאורך, בעוד שהשריר הדיגסטרי נמצא באופן רוחבי באספקט הגולגולתי של קנה הנשימה (איור 1C).
   1. הכנס את קצה המלקחיים הזוויתיים 45° בצומת זה, לרוחב לווריד הצוואר הקדמי, כדי לחדור ולהפיץ פתח בפאשיה הצווארית העמוקה שמעליו.
4. השאר חלון זה שנוצר בשלב 2.3.1 פתוח באמצעות מלקחיים זוויתיים של 45°. הרחב פתח זה על ידי ביצוע תמרוני התפשטות עם זוג מלקחיים מעוקלים ביד השנייה.

3. זיהוי וכריתה של הגנגליון

1. אתר את גנגליון צוואר הרחם העליון (SCG) על הקיר הצידי של החלל שנחשף. הוא מופיע כרקמה עגולה ופנינית.
   הערה: אם SCG אינו מזוהה, הרקמות בחלל זה צריכות להיבדק באופן רוחבי וטוב יותר. SCG עשוי להיות מבולבל בקלות עם שומן, אשר קיים לעתים קרובות באזור זה. שומן יש גוון צהוב מעט, בעוד לעומת זאת, SCG נראה לבן פנינה.
2. תוך שמירה על הפתח עם מלקחיים ביד השנייה, תפסו בעדינות את ה-SCG עם מלקחיים, ומשכו אותו החוצה מהפתח כדי להביא אותו לראייה טובה יותר.
3. ברגע שה-SCG נמצא בתצוגה, תפסו את הבסיס הצידי של ה-SCG, שם הוא עדיין מחובר לרקמות הסובבות אותו. בעזרת היד השנייה, לאט ובעדינות למשוך את SCG לכיוון הגחון והקאודלי.
   1. משוך את SCG מספר פעמים כדי בהדרגה לפלוט את הגנגליון לאט לאט. שמור על שלמות הגנגליון במהלך תמרון זה כדי להבטיח שלא יישארו שאריות גנגליון מאחור.
      הערה: משוך את הגנגליון בעדינות, מכיוון שדימום עלול להתרחש במהלך שלב זה. אם מתרחש דימום קל, השתמש תאית מחומצנת מתחדשת או רצועה קטנה של גזה סטרילית כדי להחזיק לחץ על הפתח במשך 30 שניות עד 1 דקה. לאחר מכן, לאט להרים את הגזה ולהעריך מחדש. חזור על התהליך של החזקת לחץ על הפתח לפי הצורך עד שהדימום ייפסק.
4. שחררו לאט לאט את המלקחיים האחרים המחזיקים את בסיס הגנגליון. בדוק דימום על ידי חיפוש איגום דם.
   הערה: נוטף קל בשלב זה הוא נורמלי. עקוב וודא שאין דימום מתמשך או משמעותי לפני סגירה וסיום ההליך. במקרה כזה, החזק את הלחץ מעל הפתח, כמתואר בשלב 3.3.1.
5. החזירו את בלוטות הרוק למיקומן האנטומי הרגיל. יש לקרב ולסגור את העור באמצעות תפרים פשוטים מניילון קטועים של 5-0 (ראו טבלת חומרים).
6. הניחו את העכבר בכלוב נקי בפני עצמו כדי לאפשר החלמה מלאה מההרדמה.
   הערה: ייתכן שיחלפו 5-15 דקות עד שהעכבר יתעורר באופן מלא מההרדמה. אל תשאיר את העכבר ללא השגחה עד שהוא חזר להכרה מספקת כדי לשמור על שכיבה עצם החזה. אין להניח את העכבר בכלוב עם עכברים אחרים עד שהוא מחלים לחלוטין. להעריך את העכבר עבור התאוששות לאחר הניתוח לפחות פעם אחת כל 24 שעות במשך 72 שעות.

תוצאות

פרוטוקול זה מתאר את ההסרה הכירורגית של SCG במודל עכבר. איור 2 מדגים את ציוני הדרך האנטומיים, כולל CCA, וריד הצוואר הקדמי וה-SCG. בדיסקציה (איור 2A) ניתן לראות את הווריד הצווארי הקדמי הימני זורם לצד הגבול הצידי של קנה הנשימה. מכיוון שהוא ממוקם עמוק יותר מהווריד הצווא...

Discussion

פרוטוקול זה מתאר מודל עכבר לאבלציה חד צדדית כירורגית של קלט SCG. טכניקה זו מאפשרת ללמוד את ההשפעות של עצבוב אדרנרגי בסביבות שונות. בנוסף, ניתן לגדל את הגנגליון הסימפתטי המנותח גם בתרבית מטריג'ל תלת ממדית לניסויים חוץ גופיים ³⁰.

מחקרים הכוללים SCGx בוצעו בעיקר ב?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anti-Tyrosine Hydroxylase Antibody	EMD Millipore	AB152
Artificial Tears Lubricant Ophthalmic Ointment	Akorn	59399-162-35
Curity 2 x 2 Inch Gauze Sponge 8 Ply, Sterile	Covidien	1806
Derf Needle Holder	Thomas Scientific	1177K00
Dissecting Microscope
Dumont #5/45 Forceps	Fine Science Tools	11251-35
Dumont #7b Forceps	Fine Science Tools	11270-20
ETHILON Nylon Suture	Ethicon	698H
Fine Scissors - ToughCut	Fine Science Tools	14058-09
Hypoallergenic Surgical Tape	3M Blenderm	70200419342
Induction Chamber, 2 Liter	VetEquip	941444
Isoflurane	Baxter	1001936060
Nair	Church & Dwight Co., Inc	40002957	chemical hair removing agent
NORADRENALINE RESEARCH ELISA	Labor Diagnostika Nord (Rocky Mountain Diagnostics)	BA E-5200
NSG Mouse	Jackson Laboratory	JAX:005557
Povidone-Iodine Swabstick	PDI	S41350
Webcol Alcohol Preps	Covidien	5110