Technique chirurgicale pour la ganglionectomie cervicale supérieure dans un modèle murin

Résumé

Le présent protocole décrit un modèle murin de l’ablation de l’innervation adrénergique par identification et réséquence du ganglion cervical supérieur.

Résumé

De plus en plus de preuves suggèrent que le système nerveux sympathique joue un rôle important dans la progression du cancer. L’innervation adrénergique régule la sécrétion des glandes salivaires, le rythme circadien, la dégénérescence maculaire, la fonction immunitaire et la physiologie cardiaque. La sympathectomie chirurgicale murine est une méthode permettant d’étudier les effets de l’innervation adrénergique en permettant une ablation adrénergique complète et unilatérale tout en évitant la nécessité d’une intervention pharmacologique répétée et les effets secondaires associés. Cependant, la sympathectomie chirurgicale chez la souris est techniquement difficile en raison de la petite taille du ganglion cervical supérieur. Cette étude décrit une technique chirurgicale permettant d’identifier et de réséquer de manière fiable le ganglion cervical supérieur afin d’ablater le système nerveux sympathique. L’identification et l’ablation réussies du ganglion sont validées par l’imagerie des ganglions sympathiques fluorescents à l’aide d’une souris transgénique, l’identification du syndrome de Horner post-résection, la coloration des marqueurs adrénergiques dans les ganglions réséqués et l’observation d’une diminution de l’immunofluorescence adrénergique dans les organes cibles après sympathectomie. Ce modèle permet d’étudier à l’avenir la progression du cancer ainsi que d’autres processus physiologiques régulés par le système nerveux sympathique.

Introduction

De nombreuses études ont rapporté que les nerfs du microenvironnement tumoral jouent un rôle actif dans le soutien de la progression tumorale. Il a été démontré que l’ablation des nerfs sympathiques adrénergiques altère le développement et la dissémination des tumeurs dans les cancers de la prostate et de l’estomac in vivo ^1,2,3, tandis que le blocage pharmacologique des récepteurs adrénergiques inhibe la croissance tumorale dans les cancers de la tête et du cou⁴. Une atteinte neuronale sympathique a également été décrite dans la progression du carcinome pancréatique, cervical et basocellulaire ^5,6,7.

Dans le système nerveux sympathique, le ganglion cervical supérieur (GCS) est le seul ganglion du tronc sympathique qui innerve la tête. Le SCG régule diverses fonctions physiologiques, telles que la sécrétion salivaire et le rythme circadien, et innerve directement les ganglions lymphatiques cervicaux 8,9,10. Le SCG a également été impliqué dans des processus pathologiques tels que la dégénérescence maculaire¹¹ et la progression de la dissection aortique¹². De plus, il a été rapporté que la résection du SCG aggrave les lésions rénales aiguës induites par l’ischémie¹³ et altère également le microbiote intestinal chez le rat¹⁴.

L’ablation complète du SCG dans un modèle murin représenterait une technique expérimentale précieuse pour permettre la recherche sur le cancer et le système nerveux autonome. Alors que de nombreuses études ont utilisé le blocage pharmacologique des récepteurs adrénergiques comme ablation adrénergique 15,16,17,18,19,20, la résection chirurgicale permet une ablation adrénergique complète et unilatérale tout en évitant la nécessité d’une intervention pharmacologique répétée et les effets secondaires associés ^21,22,23.

La résection chirurgicale de la SCG a été décrite chez le rat²⁴, et la plupart des rapports étudiant l’effet de la ganglionectomie cervicale supérieure (SCGx) ont utilisé le modèle du rat. Par rapport au modèle de rat, le SCGx est techniquement plus difficile chez la souris en raison de la petite taille du SCG. Cependant, les souris sont comparativement plus faciles à manipuler, plus rentables et plus susceptibles d’être manipulées génétiquement. Garcia et al. ont été parmi les premiers à signaler le SCGx chez la souris, et il a été constaté qu’il affectait la libération d’insuline²⁵. Plus récemment, Ziegler et al. ont décrit SCGx chez la souris en se basant sur la technique publiée décrite pour les rats^24,26. Cet article et d’autres décrivent une méthode dans laquelle l’artère carotide commune (ACC) est d’abord identifiée et disséquée, et le SCG est ensuite retiré de la bifurcation de l’ACC^21,22,27,28. Dans cet article, une technique moins invasive et plus sûre est décrite chez la souris qui évite la dissection de l’ACC, minimisant ainsi la complication la plus grave de cette procédure – le saignement d’une blessure à l’ACC.

Protocole

Les procédures sur les animaux décrites ici ont été approuvées par le comité institutionnel de soins et d’utilisation des animaux du Memorial Sloan Kettering Cancer Center. Des souris NSG mâles et femelles âgées de huit semaines ont été utilisées ici. Les animaux ont été obtenus auprès d’une source commerciale (voir le tableau des matériaux). Les instruments sont stérilisés, la surface de travail chirurgicale est désinfectée, la surface cutanée de l’animal est désinfectée et le chirurgien porte des gants stériles tout au long de l’intervention.

1. Préparation des souris et mise en place préopératoire

1. La veille de la chirurgie, anesthésier la souris avec 2 % d’isoflurane dans une chambre d’induction (3,75 po de largeur x 9 po de profondeur x 3,75 po de hauteur, voir le tableau des matériaux).
   REMARQUE: Un plan chirurgical d’anesthésie est généralement réalisé en 3 à 5 minutes, selon l’animal. Évaluer l’adéquation de l’anesthésie par pincement des orteils et augmenter le pourcentage d’isoflurane au besoin.
   1. Rasez la face ventrale du cou ou utilisez un agent d’épilation chimique selon les instructions du fabricant (voir le tableau des matériaux).
2. Le jour de l’opération, anesthésiez la souris avec de l’isoflurane à 2 % dans une chambre d’induction. Évaluer l’adéquation de l’anesthésie par pincement des orteils et augmenter le pourcentage d’isoflurane au besoin.
3. Administrer 2 mg/kg de méloxicam par voie sous-cutanée pour une analgésie systémique préventive. Appliquez une pommade ophtalmique topique (voir le tableau des matériaux) pour prévenir les blessures oculaires et la sécheresse sous anesthésie.
4. Placez la souris sous un microscope à dissection sur sa face dorsale et offrez-lui un soutien thermique. Maintenez l’anesthésie par inhalation avec de l’isoflurane à 2 % à 2,5 % à l’aide d’un vaporisateur de précision et d’un cône nasal. Fixez délicatement les deux membres antérieurs avec du ruban hypoallergénique (voir le tableau des matériaux).
5. Nettoyez la face ventrale rasée du cou avec de la povidone iodée, puis essuyez avec de l’alcool à 70%. Répétez ce processus deux fois de plus. Assurez-vous que le site chirurgical est exempt de poils lâches.
   REMARQUE: Une paire de pinces courtes et incurvées peut également être utilisée. Assurez-vous d’utiliser une paire de pinces fines ou ophtalmiques pour travailler adéquatement dans cet espace confiné. Une configuration préopératoire supplémentaire peut être incluse conformément aux directives de l’établissement.

2. Dissection

1. Faites une incision cutanée médiane de 1,5 cm sur la face ventrale du cou à l’aide de petits ciseaux d’environ 2 mm sous le menton à 2 mm au-dessus de l’encoche sternale.
2. Rétractez les bords de la peau latéralement à l’aide d’une pince pour exposer le fascia sous-jacent et les glandes salivaires sous-maxillaires. Séparez la peau du fascia sous-jacent en insérant des ciseaux pointus sous la peau de chaque côté et en les écartant. Tirez les glandes sous-maxillaires vers le bas caudalement avec des pinces pour révéler les muscles sous-jacents.
3. Localisez la jonction du ventre postérieur du muscle digastrique et du muscle omohyoïdien (Figure 1A, cercle noir). La veine jugulaire antérieure s’étend longitudinalement et latéralement au muscle omohyoïdien.
   REMARQUE: Le muscle omohyoïdien recouvre la trachée longitudinalement, tandis que le muscle digastrique se trouve transversalement à la face crânienne de la trachée (Figure 1C).
   1. Insérez l’extrémité de la pince coudée à 45° à cette jonction, latéralement à la veine jugulaire antérieure, pour percer et écarter une ouverture dans le fascia cervical profond sus-jacent.
4. Gardez cette fenêtre créée à l’étape 2.3.1 ouverte avec la pince coudée à 45°. Élargissez cette ouverture en effectuant des manœuvres d’écartement avec une paire de pinces incurvées dans l’autre main.

3. Identification et résection du ganglion

1. Localisez le ganglion cervical supérieur (SCG) sur la paroi latérale de l’espace révélé. Il se présente sous la forme d’un tissu rond et nacré.
   REMARQUE: Si le SCG n’est pas identifié, les tissus de cet espace doivent être examinés plus latéralement et plus haut. Le SCG peut être facilement confondu avec la graisse, qui est souvent présente dans cette région. La graisse a une teinte légèrement jaune, tandis qu’en revanche, le SCG apparaît blanc perle.
2. Tout en maintenant l’ouverture avec une pince de l’autre main, saisissez doucement le SCG avec une pince et retirez-le de l’ouverture pour le mettre en évidence.
3. Une fois que le SCG est en vue, saisissez la base latérale du SCG, où il est toujours attaché aux tissus environnants. À l’aide de l’autre main, rétractez lentement et doucement le SCG dans une direction ventrale et caudale.
   1. Rétractez le SCG plusieurs fois pour évacuer progressivement le ganglion petit à petit. Gardez le ganglion intact pendant cette manœuvre pour vous assurer qu’aucun reste ganglionnaire résiduel n’est laissé derrière.
      REMARQUE: Tirez doucement sur le ganglion, car des saignements peuvent survenir pendant cette étape. En cas de saignement mineur, utilisez de la cellulose régénérée oxydée ou une petite bande de gaze stérile pour maintenir la pression sur l’ouverture pendant 30 s à 1 min. Ensuite, soulevez lentement la gaze et réévaluez. Répétez le processus de maintien de la pression sur l’ouverture si nécessaire jusqu’à ce que le saignement ait cessé.
4. Relâchez lentement l’autre pince qui maintient la base du ganglion. Vérifiez s’il y a des saignements en recherchant l’accumulation de sang.
   REMARQUE: Un léger suintement à ce moment-là est normal. Surveillez et assurez-vous qu’il n’y a pas de saignement persistant ou important avant de fermer et de terminer la procédure. Si cela se produit, maintenez la pression sur l’ouverture, comme décrit à l’étape 3.3.1.
5. Remettez les glandes salivaires dans leurs positions anatomiques normales. Approximez et fermez la peau à l’aide de simples sutures en nylon 5-0 interrompues (voir le tableau des matériaux).
6. Placez la souris dans une cage propre pour permettre une récupération complète de l’anesthésie.
   REMARQUE: Cela peut prendre 5 à 15 minutes pour que la souris se réveille complètement de l’anesthésie. Ne laissez pas la souris sans surveillance jusqu’à ce qu’elle ait retrouvé suffisamment de conscience pour maintenir la position couchée sternale. Ne placez pas la souris dans une cage avec d’autres souris jusqu’à ce qu’elle soit complètement rétablie. Évaluez la récupération postopératoire de la souris au moins une fois toutes les 24 h pendant 72 h.

Résultats

Ce protocole décrit l’ablation chirurgicale du SCG dans un modèle murin. La figure 2 illustre les repères anatomiques, y compris l’ACC, la veine jugulaire antérieure et le SCG. Lors de la dissection (figure 2A), on peut voir la veine jugulaire antérieure droite longer le bord latéral de la trachée. Comme il est situé plus profondément que la veine jugulaire antérieure, l’ACC gauche et sa bifurcation dans l’artère carotide interne (ICA) et l’...

Discussion

Ce protocole décrit un modèle murin pour l’ablation chirurgicale unilatérale de l’entrée SCG. Cette technique permet d’étudier les effets de l’innervation adrénergique dans divers contextes. De plus, le ganglion sympathique réséqué peut également être cultivé en culture de matrigel 3D pour des expériences in vitro ³⁰.

Les études impliquant SCGx ont principalement été réalisées sur des rats, car leur anatomie plus large permet une visua...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anti-Tyrosine Hydroxylase Antibody	EMD Millipore	AB152
Artificial Tears Lubricant Ophthalmic Ointment	Akorn	59399-162-35
Curity 2 x 2 Inch Gauze Sponge 8 Ply, Sterile	Covidien	1806
Derf Needle Holder	Thomas Scientific	1177K00
Dissecting Microscope
Dumont #5/45 Forceps	Fine Science Tools	11251-35
Dumont #7b Forceps	Fine Science Tools	11270-20
ETHILON Nylon Suture	Ethicon	698H
Fine Scissors - ToughCut	Fine Science Tools	14058-09
Hypoallergenic Surgical Tape	3M Blenderm	70200419342
Induction Chamber, 2 Liter	VetEquip	941444
Isoflurane	Baxter	1001936060
Nair	Church & Dwight Co., Inc	40002957	chemical hair removing agent
NORADRENALINE RESEARCH ELISA	Labor Diagnostika Nord (Rocky Mountain Diagnostics)	BA E-5200
NSG Mouse	Jackson Laboratory	JAX:005557
Povidone-Iodine Swabstick	PDI	S41350
Webcol Alcohol Preps	Covidien	5110