Técnica cirúrgica para ganglionectomia cervical superior em modelo murino

Resumo

O presente protocolo descreve um modelo murino de ablação de inervação adrenérgica através da identificação e ressecção do gânglio cervical superior.

Resumo

Evidências crescentes sugerem que o sistema nervoso simpático desempenha um papel importante na progressão do câncer. A inervação adrenérgica regula a secreção das glândulas salivares, o ritmo circadiano, a degeneração macular, a função imune e a fisiologia cardíaca. A simpatectomia cirúrgica murina é um método para estudar os efeitos da inervação adrenérgica, permitindo a ablação adrenérgica completa e unilateral, evitando a necessidade de intervenção farmacológica repetida e os efeitos colaterais associados. No entanto, a simpatectomia cirúrgica em camundongos é tecnicamente desafiadora devido ao pequeno tamanho do gânglio cervical superior. Este estudo descreve uma técnica cirúrgica para identificar e ressecar de forma confiável o gânglio cervical superior para abater o sistema nervoso simpático. A identificação e remoção bem-sucedidas do gânglio são validadas por imagem dos gânglios simpáticos fluorescentes usando um camundongo transgênico, identificando a síndrome de Horner pós-ressecção, marcando para marcadores adrenérgicos nos gânglios ressecados e observando imunofluorescência adrenérgica diminuída nos órgãos-alvo após simpatectomia. Este modelo possibilita estudos futuros da progressão do câncer, bem como de outros processos fisiológicos regulados pelo sistema nervoso simpático.

Introdução

Vários estudos têm relatado que os nervos no microambiente tumoral desempenham um papel ativo no suporte à progressão tumoral. Demonstrou-se que a ablação dos nervos simpáticos adrenérgicos prejudica o desenvolvimento e a disseminação tumoral no câncer de próstata e gástrico in vivo ^1,2,3, enquanto o bloqueio farmacológico dos receptores adrenérgicos inibe o crescimento tumoral no câncer de cabeça e^pescoço4. O envolvimento simpático neural também tem sido descrito na progressão dos carcinomas pancreáticos, cervicais e basocelulares5,6,7.

Dentro do sistema nervoso simpático, o gânglio cervical superior (GCS) é o único gânglio do tronco simpático que inerva a cabeça. O GCE regula várias funções fisiológicas, como secreção salivar e ritmo circadiano, e inerva diretamente os linfonodos cervicais ^8,9,10. A GCE também tem sido implicada em processos patológicos como a degeneração macular¹¹ e a progressão da dissecção aórtica¹². Além disso, foi relatado que a ressecção da GCE agrava a lesão renal aguda induzida por isquemia e reperfusão¹³ e também altera a microbiota intestinal em ratos¹⁴.

A ablação completa do SCG em um modelo de camundongo representaria uma técnica experimental valiosa para viabilizar a pesquisa do câncer e do sistema nervoso autônomo. Enquanto muitos estudos têm utilizado o bloqueio farmacológico dos receptores adrenérgicos como ablação adrenérgica 15,16,17,18,19,20, a ressecção cirúrgica permite a ablação adrenérgica completa e unilateral, evitando a necessidade de repetidas intervenções farmacológicas e os efeitos colaterais associados ^21,22,23.

A ressecção cirúrgica do GCE tem sido descrita em^ratos24, e a maioria dos relatos estudando o efeito da ganglionectomia cervical superior (GCSx) tem empregado o modelo de ratos. Em comparação com o modelo de rato, SCGx é tecnicamente mais desafiador em camundongos devido ao pequeno tamanho do SCG. No entanto, os camundongos são comparativamente mais fáceis de manusear, mais econômicos e mais passíveis de manipulação genética. Garcia e col. foram um dos primeiros a relatar a SCGx em camundongos, e descobriu-se que ela afeta a liberação de insulina²⁵. Mais recentemente, Ziegler e col. descreveram a SCGx em camundongos com base na técnica publicada descrita para^ratos24,26. Este e outros artigos descrevem um método no qual a artéria carótida comum (ACC) é primeiramente identificada e dissecada, e o GCS é posteriormente removido da bifurcação da ACC21,22,27,28. Neste artigo, uma técnica menos invasiva e segura é descrita em camundongos que evita a dissecção da ACC, minimizando assim a complicação mais grave desse procedimento – o sangramento de uma lesão na ACC.

Protocolo

Os procedimentos com animais aqui descritos foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais do Memorial Sloan Kettering Cancer Center. Camundongos NSG machos e fêmeas com oito semanas de idade foram usados aqui. Os animais foram obtidos de fonte comercial (ver Tabela de Materiais). Os instrumentos são esterilizados, a superfície de trabalho cirúrgica é desinfetada, a superfície da pele do animal é desinfetada e o cirurgião usa luvas estéreis durante todo o procedimento.

1. Preparo dos camundongos e posicionamento pré-operatório

1. Na véspera da cirurgia, anestesiar o camundongo com isoflurano a 2% em câmara de indução (3,75 de largura x 9 de profundidade x 3,75 de altura, ver Tabela de Materiais).
   NOTA: Um plano cirúrgico de anestesia é geralmente alcançado em 3-5 min, dependendo do animal individual. Avaliar a adequação da anestesia por pinça dos dedos dos pés e aumentar a porcentagem de isoflurano conforme apropriado.
   1. Faça a barba no aspecto ventral do pescoço ou use um agente químico de depilação de acordo com as instruções do fabricante (consulte a Tabela de Materiais).
2. No dia da cirurgia, anestesiar o camundongo com isoflurano a 2% em câmara de indução. Avaliar a adequação da anestesia por pinça dos dedos dos pés e aumentar a porcentagem de isoflurano conforme apropriado.
3. Administrar 2 mg/kg de meloxicam por via subcutânea para analgesia sistêmica preemptiva. Aplique pomada oftálmica tópica (ver Tabela de Materiais) para evitar lesões oculares e ressecamento sob anestesia.
4. Coloque o camundongo sob um microscópio dissecante em seu lado dorsal e forneça suporte térmico. Manter anestesia inalatória com isoflurano a 2%-2,5% com vaporizador de precisão e cone nasal. Fixe suavemente ambos os membros anteriores com fita hipoalergénica (ver Tabela de Materiais).
5. Limpe o aspecto ventral raspado do pescoço com iodopovidona e, em seguida, limpe com álcool a 70%. Repita esse processo mais duas vezes. Certifique-se de que o local cirúrgico esteja livre de qualquer cabelo solto.
   NOTA: Um par de pinças curvas curtas também pode ser usado. Certifique-se de usar um par de pinças finas ou oftálmicas para trabalhar adequadamente neste espaço confinado. Ajustes pré-operatórios adicionais podem ser incluídos de acordo com as diretrizes institucionais.

2. Dissecção

1. Faça uma incisão cutânea mediana de 1,5 cm na face ventral do pescoço com uma pequena tesoura de aproximadamente 2 mm abaixo do queixo até 2 mm acima da fúrcula esternal.
2. Retrair as bordas da pele lateralmente com pinça para expor a fáscia subjacente e as glândulas salivares submandibulares. Separe a pele da fáscia subjacente inserindo tesouras pontiagudas sob a pele de cada lado e espalhando. Puxe as glândulas submandibulares caudalmente com pinça para revelar os músculos subjacentes.
3. Localiza-se a junção do ventre posterior do músculo digástrico com o músculo omo-hioideo (Figura 1A, círculo preto). A veia jugular anterior é vista correndo longitudinalmente e lateralmente ao músculo omo-hioideo.
   OBS: O músculo omo-hioideo recobre longitudinalmente a traqueia, enquanto o digástrico situa-se transversalmente na face cranial da traqueia (Figura 1C).
   1. Inserir a ponta da pinça angulada de 45° nessa junção, lateral à veia jugular anterior, para perfurar e espalhar uma abertura na fáscia cervical profunda sobrejacente.
4. Mantenha esta janela criada na etapa 2.3.1 aberta com a pinça angulada de 45°. Expanda essa abertura mais largamente realizando manobras de espalhamento com um par de pinças curvas na outra mão.

3. Identificação e ressecção do gânglio

1. Localizar o gânglio cervical superior (GCS) na parede lateral do espaço revelado. Aparece como um tecido redondo e perolado.
   NOTA: Se o SCG não for identificado, os tecidos neste espaço precisam ser examinados mais lateral e superiormente. O GCE pode ser facilmente confundido com a gordura, que muitas vezes está presente nessa região. A gordura tem uma coloração levemente amarelada, enquanto em contraste, o SCG aparece branco pérola.
2. Enquanto mantém a abertura com pinça com a outra mão, segure suavemente o SCG com pinças e puxe-o para fora da abertura para trazê-lo para melhor visualização.
3. Uma vez que o GCE esteja em vista, segure a base lateral do GCS, onde ele ainda está aderido aos tecidos circundantes. Com a outra mão, retrair lenta e suavemente o GCE no sentido ventral e caudal.
   1. Retrair o SCG várias vezes para gradualmente avular o gânglio pouco a pouco. Mantenha o gânglio intacto durante esta manobra para garantir que nenhum remanescente de gânglio residual seja deixado para trás.
      NOTA: Puxe o gânglio suavemente, pois pode ocorrer sangramento durante esta etapa. Se ocorrer um pequeno sangramento, use celulose regenerada oxidada ou uma pequena tira de gaze estéril para manter a pressão sobre a abertura por 30 s a 1 min. Em seguida, levante lentamente a gaze e reavalie. Repita o processo de manter a pressão sobre a abertura, conforme necessário, até que o sangramento tenha parado.
4. Solte lentamente a outra pinça que segura a base do gânglio. Verifique se há sangramento procurando acúmulo de sangue.
   NOTA: Ligeira exsudação neste momento é normal. Monitore e certifique-se de que não há sangramento persistente ou significativo antes de fechar e terminar o procedimento. Se tal ocorrer, manter a pressão sobre a abertura, conforme descrito no passo 3.3.1.
5. Mover as glândulas salivares de volta para suas posições anatômicas normais. Aproximar e fechar a pele usando pontos de náilon 5-0 simples interrompidos (ver Tabela de Materiais).
6. Coloque o rato numa gaiola limpa por si só para permitir a recuperação total da anestesia.
   NOTA: Pode levar 5-15 minutos para o rato acordar totalmente da anestesia. Não deixe o rato sozinho até que ele tenha recuperado a consciência suficiente para manter a decúbito esternal. Não coloque o rato numa gaiola com outros ratinhos até que esteja totalmente recuperado. Avaliar o camundongo para recuperação pós-cirúrgica pelo menos uma vez a cada 24 h por 72 h.

Resultados

Este protocolo descreve a remoção cirúrgica do GCE em um modelo de camundongo. A Figura 2 ilustra os pontos anatômicos, incluindo a ACC, a veia jugular anterior e o GCE. Com a dissecção (Figura 2A), observa-se a veia jugular anterior direita cursando ao longo da borda lateral da traqueia. Por localizar-se mais profundamente que a veia jugular anterior, a ACC esquerda e sua bifurcação na artéria carótida interna (ACI) e na artéria carótida externa (EC...

Discussão

Este protocolo descreve um modelo de camundongo para ablação unilateral cirúrgica da entrada do SCG. Esta técnica permite estudar os efeitos da inervação adrenérgica em vários contextos. Além disso, o gânglio simpático ressecado também pode ser cultivado em cultura matrigel^3D para experimentos in vitro30.

Estudos envolvendo GCSx têm sido realizados principalmente em ratos, pois sua anatomia maior permite fácil visualização anatômica e dissecç?...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anti-Tyrosine Hydroxylase Antibody	EMD Millipore	AB152
Artificial Tears Lubricant Ophthalmic Ointment	Akorn	59399-162-35
Curity 2 x 2 Inch Gauze Sponge 8 Ply, Sterile	Covidien	1806
Derf Needle Holder	Thomas Scientific	1177K00
Dissecting Microscope
Dumont #5/45 Forceps	Fine Science Tools	11251-35
Dumont #7b Forceps	Fine Science Tools	11270-20
ETHILON Nylon Suture	Ethicon	698H
Fine Scissors - ToughCut	Fine Science Tools	14058-09
Hypoallergenic Surgical Tape	3M Blenderm	70200419342
Induction Chamber, 2 Liter	VetEquip	941444
Isoflurane	Baxter	1001936060
Nair	Church & Dwight Co., Inc	40002957	chemical hair removing agent
NORADRENALINE RESEARCH ELISA	Labor Diagnostika Nord (Rocky Mountain Diagnostics)	BA E-5200
NSG Mouse	Jackson Laboratory	JAX:005557
Povidone-Iodine Swabstick	PDI	S41350
Webcol Alcohol Preps	Covidien	5110