АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Настоящий протокол описывает мышиную модель абляции адренергической иннервации путем идентификации и резекции верхнего шейного ганглия.

Аннотация

Все больше данных свидетельствуют о том, что симпатическая нервная система играет важную роль в прогрессировании рака. Адренергическая иннервация регулирует секрецию слюнных желез, циркадный ритм, дегенерацию желтого пятна, иммунную функцию и физиологию сердца. Мышиная хирургическая симпатэктомия – это метод изучения эффектов адренергической иннервации, позволяющий проводить полную, одностороннюю адренергическую абляцию, избегая при этом необходимости повторного фармакологического вмешательства и связанных с ним побочных эффектов. Тем не менее, хирургическая симпатэктомия у мышей технически сложна из-за небольшого размера верхнего шейного ганглия. В этом исследовании описывается хирургическая техника для надежной идентификации и резекции верхнего шейного ганглия для абляции симпатической нервной системы. Успешная идентификация и удаление ганглия подтверждаются визуализацией флуоресцентных симпатических ганглиев с использованием трансгенной мыши, выявлением пострезекционного синдрома Горнера, окрашиванием на адренергические маркеры в резецированных ганглиях и наблюдением сниженной адренергической иммунофлюоресценции в органах-мишенях после симпатэктомии. Эта модель позволяет в будущем изучать прогрессирование рака, а также другие физиологические процессы, регулируемые симпатической нервной системой.

Введение

Многочисленные исследования показали, что нервы в микроокружении опухоли играют активную роль в поддержке прогрессирования опухоли. Было показано, что абляция адренергических симпатических нервов нарушает развитие и диссеминацию опухоли при раке предстательной железы и желудка in vivo 1,2,3, в то время как фармакологическая блокада адренергических рецепторов ингибирует рост опухоли при раке головы и шеи4. Вовлечение симпатической нервной системы также было описано при прогрессировании карциномы поджелудочной, шейной и базальноклеточной карциномы 5,6,7.

В симпатической нервной системе верхний шейный ганглий (SCG) является единственным ганглием симпатического ствола, который иннервирует голову. SCG регулирует различные физиологические функции, такие как секреция слюны и циркадный ритм, и непосредственно иннервирует шейные лимфатические узлы 8,9,10. SCG также участвует в патологических процессах, таких как дегенерация желтого пятна11 и прогрессирование расслоения аорты12. Кроме того, сообщалось, что резекция SCG усугубляет острое повреждение почек, вызванное ишемической реперфузией13, а также изменяет микробиоту кишечника у крыс14.

Полная абляция SCG на мышиной модели представляет собой ценный экспериментальный метод для исследования рака и вегетативной нервной системы. В то время как во многих исследованиях использовалась фармакологическая блокада адренергических рецепторовв качестве адренергической абляции 15,16,17,18,19,20, хирургическая резекция позволяет провести полную, одностороннюю адренергическую абляцию, избегая при этом необходимости повторного фармакологического вмешательства и связанных с ним побочных эффектов 21,22,23.

Хирургическая резекция SCG была описана у крыс24, и в большинстве отчетов, изучающих эффект верхней шейной ганглионэктомии (SCGx), использовалась модель крыс. По сравнению с моделью на крысах, SCGx технически более сложен для мышей из-за небольшого размера SCG. Тем не менее, с мышами сравнительно легче обращаться, они более экономичны и более поддаются генетическим манипуляциям. Garcia et al. были одними из первых, кто сообщил о SCGx у мышей, и было обнаружено, что он влияет на высвобождение инсулина25. Совсем недавно Ziegler et al. описали SCGx у мышей на основе опубликованной методики, описанной на крысах24,26. В этой и других статьях описывается метод, при котором сначала идентифицируется и рассекается общая сонная артерия (КЦА), а затем удаляется СКГ из бифуркации ССА 21,22,27,28. В данной статье описана менее инвазивная и более безопасная методика на мышах, которая позволяет избежать рассечения КЦА, тем самым минимизируя самое серьезное осложнение этой процедуры – кровотечение из травмы КЦА.

протокол

Описанные здесь процедуры для животных были одобрены Комитетом по уходу за животными и их использованию в Мемориальном онкологическом центре им. Слоуна-Кеттеринга. Здесь использовали восьминедельных самцов и самок мышей NSG. Животные были получены из коммерческого источника (см. Таблицу материалов). Инструменты стерилизуются, операционная рабочая поверхность дезинфицируется, поверхность кожи животного дезинфицируется, хирург носит стерильные перчатки на протяжении всей процедуры.

1. Подготовка мышей и предоперационная подготовка

  1. За день до операции обезболивайте мышь 2% изофлураном в индукционной камере (3,75 в ширину x 9 в глубину x 3,75 в высоту, см. таблицу материалов).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Хирургическая плоскость анестезии обычно достигается за 3-5 минут, в зависимости от конкретного животного. Оцените адекватность анестезии с помощью щипкового зажима пальца ноги и при необходимости увеличьте процентное содержание изофлурана.
    1. Побрейте брюшную часть шеи или используйте химическое средство для удаления волос в соответствии с инструкциями производителя (см. Таблицу материалов).
  2. В день операции обезболивайте мышь 2% изофлураном в индукционной камере. Оцените адекватность анестезии с помощью щипкового зажима пальца ноги и при необходимости увеличьте процентное содержание изофлурана.
  3. Вводят 2 мг/кг мелоксикама подкожно для упреждающей системной анальгезии. Применяют местную офтальмологическую мазь (см. Таблицу материалов) для предотвращения травм глаз и сухости под наркозом.
  4. Поместите мышь под препарирующий микроскоп на тыльную сторону и обеспечьте тепловую поддержку. Поддерживайте ингаляционную анестезию 2%-2,5% изофлураном, используя прецизионный испаритель и носовой конус. Аккуратно закрепите обе передние конечности гипоаллергенной лентой (см. Таблицу материалов).
  5. Выбритую брюшную часть шеи очистить повидон-йодом, а затем протереть 70% спиртом. Повторите этот процесс еще два раза. Убедитесь, что в месте операции нет выпавших волос.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Также можно использовать пару коротких изогнутых щипцов. Обязательно используйте пару тонких или офтальмологических щипцов для адекватной работы в этом ограниченном пространстве. В соответствии с рекомендациями учреждения может быть включена дополнительная предоперационная подготовка.

2. Вскрытие

  1. Сделайте разрез кожи по средней линии 1,5 см на вентральной стороне шеи маленькими ножницами примерно на 2 мм ниже подбородка и на 2 мм выше грудинной выемки.
  2. Втяните края кожи латерально с помощью щипцов, чтобы обнажить подлежащую фасцию и подчелюстные слюнные железы. Отделите кожу от нижележащей фасции, вставив заостренные ножницы под кожу с каждой стороны и распределив. Потяните подчелюстные железы каудально щипцами, чтобы обнажить нижележащие мышцы.
  3. Найдите место соединения задней части живота двугубой мышцы и подъязычной мышцы (рис. 1А, черный круг). Передняя яремная вена проходит продольно и латерально по отношению к подъязычной мышце.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Подъязычная мышца покрывает трахею в продольном направлении, в то время как двудневая мышца лежит поперечно в краниальной части трахеи (Рисунок 1C).
    1. Введите кончик щипцов под углом 45° в это соединение, латеральнее передней яремной вены, чтобы проколоть и расширить отверстие в вышележащей глубокой шейной фасции.
  4. Держите это окно, созданное на шаге 2.3.1, открытым щипцами под углом 45°. Расширьте это отверстие шире, выполняя разбрасывающие маневры с парой изогнутых щипцов в другой руке.

3. Идентификация и резекция ганглия

  1. Локализуют верхний шейный ганглий (SCG) на боковой стенке выявленного пространства. Он выглядит как круглая перламутровая ткань.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Если SCG не идентифицирована, ткани в этом пространстве должны быть исследованы более латерально и сверху. SCG можно легко спутать с жиром, который часто присутствует в этой области. Жир имеет слегка желтоватый оттенок, в то время как SCG, напротив, выглядит жемчужно-белым.
  2. Удерживая отверстие щипцами другой рукой, осторожно возьмитесь щипцами за SCG и вытащите его из отверстия, чтобы он был лучше виден.
  3. Как только SCG окажется в поле зрения, возьмитесь за боковое основание SCG, где он все еще прикреплен к окружающим тканям. Другой рукой медленно и осторожно втягивайте SCG в вентральном и каудальном направлениях.
    1. Втяните SCG несколько раз, чтобы постепенно удалить ганглий. Сохраняйте ганглий нетронутым во время этого маневра, чтобы убедиться, что не осталось остаточных остатков ганглия.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Осторожно потяните за ганглий, так как на этом этапе может возникнуть кровотечение. При незначительном кровотечении используйте окисленную регенерированную целлюлозу или небольшую полоску стерильной марли, чтобы удерживать давление над отверстием от 30 с до 1 мин. Затем медленно поднимите марлю и повторите оценку. При необходимости повторяйте процесс удержания давления на отверстие до тех пор, пока кровотечение не остановится.
  4. Медленно отпустите другие щипцы, удерживающие основание ганглия. Проверьте наличие кровотечения, обратив внимание на скопление крови.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Небольшое сочащееся в это время является нормальным. Контролируйте и убедитесь в отсутствии постоянного или значительного кровотечения перед закрытием и завершением процедуры. В этом случае удерживайте давление над отверстием, как описано в шаге 3.3.1.
  5. Верните слюнные железы в их нормальное анатомическое положение. Приблизите и закройте кожу простыми прерывистыми нейлоновыми швами 5-0 (см. таблицу материалов).
  6. Поместите мышь в чистую клетку отдельно, чтобы она полностью восстановилась после анестезии.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Может потребоваться 5-15 минут, чтобы мышь полностью очнулась от анестезии. Не оставляйте мышь без присмотра до тех пор, пока она не придет в сознание, достаточное для поддержания грудинного лежачего положения. Не помещайте мышь в клетку с другими мышами до тех пор, пока она полностью не выздоровеет. Оценивайте состояние мыши на предмет послеоперационного восстановления не реже одного раза в 24 ч в течение 72 ч.

Результаты

Этот протокол описывает хирургическое удаление SCG на мышиной модели. На рисунке 2 показаны анатомические ориентиры, включая CCA, переднюю яремную вену и SCG. При рассечении (рис. 2А) видна правая передняя яремная вена, проходящая вдоль латеральной границы тра...

Обсуждение

Этот протокол описывает мышиную модель для хирургической односторонней абляции входа SCG. Эта методика позволяет изучать эффекты адренергической иннервации в различных условиях. Кроме того, резецированный симпатический ганглий также может быть выращен в 3D-культуре матригеля для эксп?...

Раскрытие информации

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

Q. W. был поддержан NIH T32CA009685. R. J. W. был поддержан NIH R01CA219534. Основные объекты Мемориального онкологического центра имени Слоуна-Кеттеринга были поддержаны Национальным институтом здравоохранения P30CA008748.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
Anti-Tyrosine Hydroxylase AntibodyEMD MilliporeAB152
Artificial Tears Lubricant Ophthalmic OintmentAkorn59399-162-35
Curity 2 x 2 Inch Gauze Sponge 8 Ply, SterileCovidien1806
Derf Needle HolderThomas Scientific1177K00
Dissecting Microscope
Dumont #5/45 ForcepsFine Science Tools11251-35
Dumont #7b ForcepsFine Science Tools11270-20
ETHILON Nylon SutureEthicon698H
Fine Scissors - ToughCutFine Science Tools14058-09
Hypoallergenic Surgical Tape3M Blenderm70200419342
Induction Chamber, 2 LiterVetEquip941444
IsofluraneBaxter1001936060
NairChurch & Dwight Co., Inc40002957chemical hair removing agent
NORADRENALINE RESEARCH ELISALabor Diagnostika Nord (Rocky Mountain Diagnostics)BA E-5200
NSG MouseJackson LaboratoryJAX:005557
Povidone-Iodine SwabstickPDIS41350
Webcol Alcohol PrepsCovidien5110

Ссылки

  1. Magnon, C., et al. Autonomic nerve development contributes to prostate cancer progression. Science. 341 (6142), 1236361 (2013).
  2. Zhao, C. M., et al. Denervation suppresses gastric tumorigenesis. Science Translational Medicine. 6 (250), 115 (2014).
  3. Zahalka, A. H., et al. Adrenergic nerves activate an angio-metabolic switch in prostate cancer. Science. 358 (6361), 321-326 (2017).
  4. Amit, M., et al. Loss of p53 drives neuron reprogramming in head and neck cancer. Nature. 578 (7795), 449-454 (2020).
  5. Renz, B. W., et al. Cholinergic signaling via muscarinic receptors directly and indirectly suppresses pancreatic tumorigenesis and cancer stemness. Cancer Discovery. 8 (11), 1458-1473 (2018).
  6. Lucido, C. T., et al. Innervation of cervical carcinoma is mediated by cancer-derived exosomes. Gynecologic Oncology. 154 (1), 228-235 (2019).
  7. Peterson, S. C., et al. Basal cell carcinoma preferentially arises from stem cells within hair follicle and mechanosensory niches. Cell Stem Cell. 16 (4), 400-412 (2015).
  8. Maronde, E., Stehle, J. H. The mammalian pineal gland: Known facts, unknown facets. Trends in Endocrinology & Metabolism. 18 (4), 142-149 (2007).
  9. Yamazaki, S., et al. Ontogeny of circadian organization in the rat. Journal of Biological Rhythms. 24 (1), 55-63 (2009).
  10. Huang, J., et al. S100+ cells: A new neuro-immune cross-talkers in lymph organs. Scientific Reports. 3 (1), 1114 (2013).
  11. Dieguez, H. H., et al. Melatonin protects the retina from experimental nonexudative age-related macular degeneration in mice. Journal of Pineal Research. 68 (4), 12643 (2020).
  12. Liu, H., et al. Bilateral superior cervical ganglionectomy attenuates the progression of β-aminopropionitrile-induced aortic dissection in rats. Life Sciences. 193, 200-206 (2018).
  13. Zhang, W., et al. The role of the superior cervical sympathetic ganglion in ischemia reperfusion-induced acute kidney injury in rats. Frontiers in Medicine. 9, 792000 (2022).
  14. Zhang, W., et al. Superior cervical ganglionectomy alters gut microbiota in rats. American Journal of Translational Research. 14 (3), 2037-2050 (2022).
  15. Wang, X., et al. β-Adrenergic signaling induces Notch-mediated salivary gland progenitor cell control. Stem Cell Reports. 16 (11), 2813-2824 (2021).
  16. Boyd, A., Aragon, I. V., Abou Saleh, L., Southers, D., Richter, W. The cAMP-phosphodiesterase 4 (PDE4) controls β-adrenoceptor- and CFTR-dependent saliva secretion in mice. Biochemical Journal. 478 (10), 1891-1906 (2021).
  17. Smith, B., Butler, M. The effects of long-term propranolol on the salivary glands and intestinal serosa of the mouse. The Journal of Pathology. 124 (4), 185-187 (1978).
  18. Sucharov, C. C., et al. β-Adrenergic receptor antagonism in mice: A model for pediatric heart disease. Journal of Applied Physiology. 115 (7), 979-987 (2013).
  19. Ding, C., Walcott, B., Keyser, K. T. The alpha1- and beta1-adrenergic modulation of lacrimal gland function in the mouse. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 48 (4), 1504-1510 (2007).
  20. Grisanti, L. A., et al. Prior β-blocker treatment decreases leukocyte responsiveness to injury. JCI Insight. 5 (9), 99485 (2019).
  21. Alito, A. E., et al. Autonomic nervous system regulation of murine immune responses as assessed by local surgical sympathetic and parasympathetic denervation. Acta Physiologica, Pharmacologica et Therapeutica Latinoamericana. 37 (3), 305-319 (1987).
  22. Yun, H., Lathrop, K. L., Hendricks, R. L. A central role for sympathetic nerves in herpes stromal keratitis in mice. Ophthalmology & Visual Science. 57 (4), 1749-1756 (2016).
  23. Haug, S. R., Heyeraas, K. J. Effects of sympathectomy on experimentally induced pulpal inflammation and periapical lesions in rats. Neuroscience. 120 (3), 827-836 (2003).
  24. Savastano, L. E., et al. A standardized surgical technique for rat superior cervical ganglionectomy. Journal of Neuroscience Methods. 192 (1), 22-33 (2010).
  25. Garcia, J. B., Romeo, H. E., Basabe, J. C., Cardinali, D. P. Effect of superior cervical ganglionectomy on insulin release by murine pancreas slices. Journal of the Autonomic Nervous System. 22 (2), 159-165 (1988).
  26. Ziegler, K. A., et al. Local sympathetic denervation attenuates myocardial inflammation and improves cardiac function after myocardial infarction in mice. Cardiovascular Research. 114 (2), 291-299 (2017).
  27. Getsy, P. M., Coffee, G. A., Hsieh, Y. H., Lewis, S. J. The superior cervical ganglia modulate ventilatory responses to hypoxia independently of preganglionic drive from the cervical sympathetic chain. Journal of Applied Physiology. 131 (2), 836-857 (2021).
  28. Dieguez, H. H., et al. Superior cervical gangliectomy induces non-exudative age-related macular degeneration in mice. Disease Models & Mechanisms. 11 (2), 031641 (2018).
  29. Zhang, B., et al. Hyperactivation of sympathetic nerves drives depletion of melanocyte stem cells. Nature. 577 (7792), 676-681 (2020).
  30. Pirzgalska, R. M., et al. Sympathetic neuron-associated macrophages contribute to obesity by importing and metabolizing norepinephrine. Nature Medicine. 23 (11), 1309-1318 (2017).
  31. Kajimura, D., Paone, R., Mann, J. J., Karsenty, G. Foxo1 regulates Dbh expression and the activity of the sympathetic nervous system in vivo. Molecular Metabolism. 3 (7), 770-777 (2014).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

190

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены