Tecnica chirurgica per ganglionectomia cervicale superiore in modello murino

Riepilogo

Il presente protocollo descrive un modello murino di ablazione dell'innervazione adrenergica mediante l'identificazione e la resezione del ganglio cervicale superiore.

Abstract

Prove crescenti suggeriscono che il sistema nervoso simpatico svolge un ruolo importante nella progressione del cancro. L'innervazione adrenergica regola la secrezione delle ghiandole salivari, il ritmo circadiano, la degenerazione maculare, la funzione immunitaria e la fisiologia cardiaca. La simpaticectomia chirurgica murina è un metodo per studiare gli effetti dell'innervazione adrenergica consentendo l'ablazione adrenergica completa e unilaterale, evitando la necessità di ripetuti interventi farmacologici e gli effetti collaterali associati. Tuttavia, la simpaticectomia chirurgica nei topi è tecnicamente impegnativa a causa delle piccole dimensioni del ganglio cervicale superiore. Questo studio descrive una tecnica chirurgica per identificare e resecare in modo affidabile il ganglio cervicale superiore per ablare il sistema nervoso simpatico. L'identificazione e la rimozione del ganglio sono convalidate mediante l'imaging dei gangli simpatici fluorescenti utilizzando un topo transgenico, l'identificazione della sindrome di Horner post-resezione, la colorazione per i marcatori adrenergici nei gangli resecati e l'osservazione di una diminuzione dell'immunofluorescenza adrenergica negli organi bersaglio dopo simpaticectomia. Questo modello consente studi futuri sulla progressione del cancro e su altri processi fisiologici regolati dal sistema nervoso simpatico.

Introduzione

Diversi studi hanno riportato che i nervi nel microambiente tumorale svolgono un ruolo attivo nel sostenere la progressione del tumore. È stato dimostrato che l'ablazione dei nervi simpatici adrenergici compromette lo sviluppo e la diffusione del tumore nel cancro alla prostata e allo stomaco in vivo ^1,2,3, mentre il blocco farmacologico dei recettori adrenergici inibisce la crescita tumorale nel cancro della testa e del collo⁴. Il coinvolgimento neurale simpatico è stato descritto anche nella progressione del carcinoma pancreatico, cervicale e basocellulare ^5,6,7.

All'interno del sistema nervoso simpatico, il ganglio cervicale superiore (SCG) è l'unico ganglio del tronco simpatico che innerva la testa. L'SCG regola varie funzioni fisiologiche, come la secrezione salivare e il ritmo circadiano, e innerva direttamente i linfonodi cervicali ^8,9,10. L'SCG è stato anche implicato in processi patologici come la degenerazione maculare¹¹ e la progressione della dissezione aortica¹². Inoltre, è stato riportato che la resezione dell'SCG aggrava il danno renale acuto indotto dalla riperfusione da ischemia¹³ e altera anche il microbiota intestinale nei ratti¹⁴.

L'ablazione completa dell'SCG in un modello murino rappresenterebbe una preziosa tecnica sperimentale per consentire la ricerca sul cancro e sul sistema nervoso autonomo. Mentre molti studi hanno utilizzato il blocco farmacologico del recettore adrenergico come ablazione adrenergica 15,16,17,18,19,20, la resezione chirurgica consente l'ablazione adrenergica completa e unilaterale evitando la necessità di ripetuti interventi farmacologici e gli effetti collaterali associati ^21,22,23.

La resezione chirurgica dell'SCG è stata descritta nei ratti²⁴ e la maggior parte dei rapporti che studiano l'effetto della ganglionectomia cervicale superiore (SCGx) hanno impiegato il modello di ratto. Rispetto al modello di ratto, SCGx è tecnicamente più impegnativo nei topi a causa delle piccole dimensioni dell'SCG. Tuttavia, i topi sono relativamente più facili da maneggiare, più convenienti e più suscettibili di manipolazione genetica. Garcia et al. sono stati tra i primi a riportare SCGx nei topi ed è stato riscontrato che influisce sul rilascio di insulina²⁵. Più recentemente, Ziegler et al. hanno descritto SCGx nei topi sulla base della tecnica pubblicata descritta per i ratti^24,26. Questo e altri articoli descrivono un metodo in cui l'arteria carotide comune (CCA) viene prima identificata e sezionata e l'SCG viene successivamente rimosso dalla biforcazione del CCA^21,22,27,28. In questo articolo, viene descritta una tecnica meno invasiva e più sicura nei topi che evita la dissezione del CCA, riducendo così al minimo la complicanza più grave di questa procedura: il sanguinamento da una lesione al CCA.

Protocollo

Le procedure sugli animali qui descritte sono state approvate dal Comitato Istituzionale per la Cura e l'Uso degli Animali presso il Memorial Sloan Kettering Cancer Center. Qui sono stati utilizzati topi NSG maschi e femmine di otto settimane. Gli animali sono stati ottenuti da una fonte commerciale (vedi Tabella dei materiali). Gli strumenti vengono sterilizzati, la superficie di lavoro chirurgica viene disinfettata, la superficie cutanea dell'animale viene disinfettata e il chirurgo indossa guanti sterili durante tutta la procedura.

1. Preparazione dei topi e setup preoperatorio

1. Il giorno prima dell'intervento, anestetizzare il topo con isoflurano al 2% in una camera di induzione (3,75 pollici di larghezza x 9 di profondità x 3,75 di altezza, vedere la tabella dei materiali).
   NOTA: Un piano chirurgico di anestesia viene solitamente raggiunto in 3-5 minuti, a seconda del singolo animale. Valutare l'adeguatezza dell'anestesia pizzicando le dita dei piedi e aumentare la percentuale di isoflurano in modo appropriato.
   1. Radere l'aspetto ventrale del collo o utilizzare un agente chimico per la depilazione secondo le istruzioni del produttore (vedere la tabella dei materiali).
2. Il giorno dell'intervento, anestetizzare il topo con isoflurano al 2% in una camera di induzione. Valutare l'adeguatezza dell'anestesia pizzicando le dita dei piedi e aumentare la percentuale di isoflurano in modo appropriato.
3. Somministrare 2 mg/kg di meloxicam per via sottocutanea per l'analgesia sistemica preventiva. Applicare un unguento oftalmico topico (vedere la tabella dei materiali) per prevenire lesioni oculari e secchezza sotto anestesia.
4. Posizionare il topo sotto un microscopio da dissezione sul lato dorsale e fornire supporto termico. Mantenere l'anestesia inalatoria con isoflurano al 2%-2,5% utilizzando un vaporizzatore di precisione e un cono nasale. Fissare delicatamente entrambi gli arti anteriori con del nastro adesivo ipoallergenico (vedi Tabella dei materiali).
5. Pulisci l'aspetto ventrale rasato del collo con iodio povidone, quindi pulisci con alcol al 70%. Ripeti questo processo altre due volte. Assicurarsi che il sito chirurgico sia libero da peli sciolti.
   NOTA: È possibile utilizzare anche un paio di pinze curve corte. Assicurarsi di utilizzare un paio di pinze fini o oftalmiche per lavorare adeguatamente in questo spazio ristretto. È possibile includere un'ulteriore configurazione pre-operatoria secondo le linee guida istituzionali.

2. Dissezione

1. Praticare un'incisione cutanea di 1,5 cm sulla parte ventrale del collo utilizzando piccole forbici da circa 2 mm sotto il mento a 2 mm sopra la tacca sternale.
2. Ritrarre lateralmente i bordi della pelle con una pinza per esporre la fascia sottostante e le ghiandole salivari sottomandibolari. Separare la pelle dalla fascia sottostante inserendo delle forbici appuntite sotto la pelle su ciascun lato e allargandole. Tirare verso il basso le ghiandole sottomandibolari caudalmente con una pinza per rivelare i muscoli sottostanti.
3. Localizzare la giunzione della ventre posteriore del muscolo digastrico e del muscolo omoioideo (Figura 1A, cerchio nero). La vena giugulare anteriore è vista correre longitudinalmente e lateralmente al muscolo omoioideo.
   NOTA: Il muscolo omoioideo copre la trachea longitudinalmente, mentre il muscolo digastrico si trova trasversalmente all'aspetto cranico della trachea (Figura 1C).
   1. Inserire la punta della pinza angolata a 45° in questa giunzione, lateralmente alla vena giugulare anteriore, per perforare e allargare un'apertura nella fascia cervicale profonda sovrastante.
4. Tenere aperta questa finestra creata nel passaggio 2.3.1 con la pinza angolata a 45°. Espandi questa apertura eseguendo manovre di allargamento con un paio di pinze curve nell'altra mano.

3. Identificazione e resezione del ganglio

1. Localizzare il ganglio cervicale superiore (SCG) sulla parete laterale dello spazio rivelato. Si presenta come un tessuto rotondo e perlaceo.
   NOTA: Se l'SCG non viene identificato, i tessuti in questo spazio devono essere esaminati più lateralmente e superiormente. L'SCG può essere facilmente confuso con il grasso, che è spesso presente in questa regione. Il grasso ha una leggera sfumatura gialla, mentre al contrario, l'SCG appare bianco perla.
2. Mantenendo l'apertura con la pinza con l'altra mano, afferrare delicatamente l'SCG con una pinza ed estrarlo dall'apertura per renderlo più visibile.
3. Una volta che l'SCG è in vista, afferrare la base laterale dell'SCG, dove è ancora attaccato ai tessuti circostanti. Con l'altra mano, ritrarre lentamente e delicatamente l'SCG in direzione ventrale e caudale.
   1. Ritrarre l'SCG più volte per avulsare gradualmente il ganglio a poco a poco. Mantieni intatto il ganglio durante questa manovra per assicurarti che non rimangano residui di gangli.
      NOTA: Tirare delicatamente il ganglion, poiché durante questa fase potrebbe verificarsi un'emorragia. Se si verifica un sanguinamento minore, utilizzare cellulosa rigenerata ossidata o una piccola striscia di garza sterile per mantenere la pressione sull'apertura per 30 secondi a 1 minuto. Quindi, sollevare lentamente la garza e rivalutare. Ripetere il processo di mantenimento della pressione sull'apertura, se necessario, fino a quando l'emorragia non si è fermata.
4. Rilascia lentamente l'altra pinza che tiene la base del ganglio. Verificare la presenza di sanguinamento cercando il ristagno di sangue.
   NOTA: Una leggera trasudazione in questo momento è normale. Monitorare e assicurarsi che non vi siano sanguinamenti persistenti o significativi prima di chiudere e terminare la procedura. In tal caso, mantenere la pressione sull'apertura, come descritto al punto 3.3.1.
5. Riportare le ghiandole salivari nelle loro normali posizioni anatomiche. Approssimare e chiudere la pelle utilizzando semplici suture di nylon 5-0 interrotte (vedi Tabella dei materiali).
6. Metti il topo in una gabbia pulita da solo per consentire il pieno recupero dall'anestesia.
   NOTA: Potrebbero essere necessari 5-15 minuti prima che il topo si risvegli completamente dall'anestesia. Non lasciare il topo incustodito fino a quando non ha ripreso conoscenza sufficiente per mantenere il decubito sternale. Non mettere il topo in una gabbia con altri topi fino a quando non si è completamente ripreso. Valutare il topo per il recupero post-chirurgico almeno una volta ogni 24 ore per 72 ore.

Risultati

Questo protocollo descrive la rimozione chirurgica dell'SCG in un modello murino. La Figura 2 illustra i punti di riferimento anatomici, tra cui il CCA, la vena giugulare anteriore e l'SCG. Con la dissezione (Figura 2A), la vena giugulare anteriore destra può essere vista scorrere lungo il bordo laterale della trachea. Poiché si trova più in profondità della vena giugulare anteriore, il CCA sinistro e la sua biforcazione nell'arteria carotide interna (ICA) e...

Discussione

Questo protocollo descrive un modello murino per l'ablazione chirurgica unilaterale dell'input SCG. Questa tecnica consente di studiare gli effetti dell'innervazione adrenergica in vari contesti. Inoltre, il ganglio simpatico resecato può anche essere coltivato in coltura matrigel 3D per esperimenti in vitro ³⁰.

Gli studi che coinvolgono SCGx sono stati eseguiti principalmente nei ratti, poiché la loro anatomia più ampia consente una più facile visualizzazi...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anti-Tyrosine Hydroxylase Antibody	EMD Millipore	AB152
Artificial Tears Lubricant Ophthalmic Ointment	Akorn	59399-162-35
Curity 2 x 2 Inch Gauze Sponge 8 Ply, Sterile	Covidien	1806
Derf Needle Holder	Thomas Scientific	1177K00
Dissecting Microscope
Dumont #5/45 Forceps	Fine Science Tools	11251-35
Dumont #7b Forceps	Fine Science Tools	11270-20
ETHILON Nylon Suture	Ethicon	698H
Fine Scissors - ToughCut	Fine Science Tools	14058-09
Hypoallergenic Surgical Tape	3M Blenderm	70200419342
Induction Chamber, 2 Liter	VetEquip	941444
Isoflurane	Baxter	1001936060
Nair	Church & Dwight Co., Inc	40002957	chemical hair removing agent
NORADRENALINE RESEARCH ELISA	Labor Diagnostika Nord (Rocky Mountain Diagnostics)	BA E-5200
NSG Mouse	Jackson Laboratory	JAX:005557
Povidone-Iodine Swabstick	PDI	S41350
Webcol Alcohol Preps	Covidien	5110