小鼠模型中上颈神经节切除术的手术技术

摘要

本协议描述了通过识别和切除颈上神经节来消融肾上腺素能神经支配的小鼠模型。

摘要

越来越多的证据表明，交感神经系统在癌症进展中起着重要作用。肾上腺素能神经支配调节唾液腺分泌、昼夜节律、黄斑变性、免疫功能和心脏生理学。小鼠外科交感神经切除术是一种研究肾上腺素能神经支配作用的方法，允许完全、单侧肾上腺素能消融，同时避免重复药物干预和相关副作用。然而，由于颈上神经节的尺寸较小，小鼠的手术交感神经切除术在技术上具有挑战性。本研究描述了一种手术技术，用于可靠地识别和切除颈上神经节以消融交感神经系统。通过使用转基因小鼠对荧光交感神经节进行成像、鉴定切除后的霍纳综合征、对切除的神经节中的肾上腺素能标志物进行染色以及观察交感神经切除术后靶器官中肾上腺素能免疫荧光减弱，验证了神经节的成功鉴定和去除。该模型能够对癌症进展以及交感神经系统调节的其他生理过程进行未来研究。

引言

多项研究报道，肿瘤微环境中的神经在支持肿瘤进展方面起着积极作用。肾上腺素能交感神经的消融已被证明会损害体内^前列腺癌和胃癌的肿瘤发展和播散^1,2,3，而肾上腺素能受体的药理学阻断抑制头颈癌的肿瘤生长⁴。交感神经受累也见于胰腺癌、宫颈癌和基底细胞癌进展 ^5,6,7。

在交感神经系统中，颈上神经节（SCG）是交感神经干中唯一支配头部的神经节。SCG调节各种生理功能，如唾液分泌和昼夜节律，并直接支配颈部淋巴结^8,9,10。SCG 还与病理过程有关，例如黄斑变性¹¹ 和主动脉夹层^{的进展 12}。此外，据报道，SCG切除会加重缺血再灌注引起的急性肾损伤¹³，并改变大鼠的肠道微生物群¹⁴。

在小鼠模型中完全消融SCG将代表一种有价值的实验技术，使癌症和自主神经系统研究成为可能。虽然许多研究已利用药物学肾上腺素能受体阻断作为肾上腺素能消融术15,16,17,18,19,20，但手术切除允许完全，单侧肾上腺素能消融，同时避免需要重复的药物干预和相关副作用21,22,23。

SCG的手术切除已在大鼠²⁴中描述，大多数研究颈上神经节切除术（SCGx）效果的报告都采用了大鼠模型。与大鼠模型相比，由于SCG的尺寸小，SCGx在小鼠中的技术更具挑战性。然而，小鼠相对更容易处理，更具成本效益，并且更适合基因操作。Garcia等人是最早在小鼠中报告SCGx的人之一，发现它会影响胰岛素释放²⁵。最近，Ziegler等人根据已发表的大鼠^24,26技术描述了小鼠中的SCGx。本文和其他文章描述了一种方法，其中首先识别和解剖颈总动脉（CCA），随后从CCA ^21,22,27,28的分叉中取出SCG。在本文中，描述了一种侵入性较小且更安全的小鼠技术，该技术避免了CCA的解剖，从而最大限度地减少了该过程最严重的并发症 - CCA损伤引起的出血。

研究方案

这里描述的动物程序得到了纪念斯隆凯特琳癌症中心的机构动物护理和使用委员会的批准。这里使用了八周龄的雄性和雌性NSG小鼠。这些动物是从商业来源获得的（见 材料表）。器械经过消毒，手术工作表面消毒，动物皮肤表面消毒，外科医生在整个手术过程中戴无菌手套。

1.小鼠的准备和术前设置

1. 在手术前一天，在诱导室（3.75英寸宽x 9英寸深x 3.75英寸高，见 材料表）中用2%异氟醚麻醉小鼠。
   注意:麻醉的手术平面通常在3-5分钟内完成，具体取决于个体动物。通过捏住脚趾评估麻醉的充分性，并酌情增加异氟醚百分比。
   1. 根据制造商的说明剃除颈部的腹侧或使用化学脱毛剂（见 材料表）。
2. 在手术当天，在诱导室中用2%异氟醚麻醉小鼠。通过捏住脚趾评估麻醉的充分性，并酌情增加异氟醚百分比。
3. 皮下注射 2 mg/kg 美洛昔康，用于预防性全身镇痛。应用局部眼药膏（见 材料表），以防止麻醉下的眼部损伤和干燥。
4. 将鼠标放在其背面的解剖显微镜下并提供热支持。使用精密蒸发器和鼻锥用2%-2.5%异氟醚维持吸入麻醉。用低过敏性胶带轻轻固定双前肢（见 材料表）。
5. 用聚维酮碘清洁剃光的颈部腹侧，然后用70%的酒精擦拭。再重复此过程两次。确保手术部位没有任何松散的毛发。
   注意:也可以使用一对短弯曲的镊子。确保使用一对细镊子或眼科镊子在这个密闭空间内充分工作。根据机构指南，可以包括额外的术前设置。

2. 解剖

1. 使用小剪刀在颈部腹侧切开 1.5 cm 的中线皮肤切口，从下巴下方约 2 毫米到胸骨切口上方 2 毫米。
2. 用镊子横向缩回皮肤边缘，露出下面的筋膜和下颌下唾液腺。通过在每侧的皮肤下插入尖剪刀并展开，将皮肤与下面的筋膜分开。用镊子向下拉下颌下腺尾部，露出下面的肌肉。
3. 找到二腹肌和舌骨肌后腹部的交界处（图1A，黑色圆圈）。颈前静脉可见于舌骨肌纵向和外侧延伸。
   注意:舌骨肌纵向覆盖气管，而二腹肌横向位于气管的颅面（图1C）。
   1. 将 45° 角镊子的尖端插入颈前静脉外侧的交界处，以刺穿并张开上覆的深颈筋膜开口。
4. 使用45°角镊子打开在步骤2.3.1中创建的此窗口。通过另一只手用一对弯曲的镊子进行展开动作来扩大这个开口。

3.识别和切除神经节

1. 在显示空间的侧壁上找到颈上神经节 （SCG）。它看起来像一个圆形的珍珠组织。
   注意:如果未识别SCG，则需要对该空间中的组织进行更横向和更高级的检查。SCG可能很容易与脂肪混淆，脂肪通常存在于该区域。脂肪略带黄色，而相比之下，SCG 呈珍珠白。
2. 在用另一只手用镊子保持开口的同时，用镊子轻轻抓住SCG，并将其从开口中拉出，使其更清晰地看到。
3. 一旦SCG在视野中，抓住SCG的侧基部，它仍然附着在周围组织上。用另一只手，缓慢而轻柔地在腹侧和尾部方向缩回SCG。
   1. 多次缩回SCG，逐渐撕脱神经节。在此过程中保持神经节完整，以确保不会留下残留的神经节残留物。
      注意:轻轻拉动神经节，因为在此步骤中可能会出现出血。如果发生轻微出血，请使用氧化再生纤维素或一小条无菌纱布在开口上保持压力30秒至1分钟。然后，慢慢提起纱布并重新评估。根据需要重复对开口保持压力的过程，直到出血停止。
4. 慢慢松开握住神经节底部的其他镊子。通过寻找血液淤积来检查出血。
   注意:此时有轻微渗出是正常的。在关闭和完成手术之前，监测并确保没有持续或显着的出血。如果发生这种情况，请按住开口的压力，如步骤 3.3.1 中所述。
5. 将唾液腺移回其正常的解剖位置。使用简单的中断5-0尼龙缝合线近似并闭合皮肤（见 材料表）。
6. 将鼠标单独放在干净的笼子中，以便从麻醉中完全恢复。
   注意:鼠标可能需要 5-15 分钟才能从麻醉中完全唤醒。在小鼠恢复足够的意识以维持胸骨卧位之前，不要让鼠标无人看管。在鼠标完全恢复之前，不要将鼠标与其他小鼠一起放在笼子里。每24小时至少评估一次小鼠术后恢复，持续72小时。

结果

该协议描述了小鼠模型中SCG的手术切除。 图 2 显示了解剖标志，包括 CCA、颈前静脉和 SCG。通过夹层（图2A），可以看到右颈前静脉沿着气管的侧缘流动。由于它位于颈前静脉更深的地方，因此左 CCA 及其分叉到颈内动脉 （ICA） 和颈外动脉 （ECA） 仅在静脉外侧隐约可见。在 NSG 中检查此问题时。B6-P0TdTomato转基因小鼠（一种P0-Cre TdTomato小鼠，其中雪旺?...

讨论

该协议描述了用于SCG输入的手术单侧消融的小鼠模型。该技术允许研究肾上腺素能神经支配在各种环境中的影响。此外，切除的交感神经节也可以在3D基质胶培养物中生长，用于 体外 实验³⁰。

涉及SCGx的研究大多在大鼠中进行，因为它们较大的解剖结构允许更容易的解剖可视化和解剖。虽然Ziegler等人之前已经描述了小鼠中的SCGx26，并...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anti-Tyrosine Hydroxylase Antibody	EMD Millipore	AB152
Artificial Tears Lubricant Ophthalmic Ointment	Akorn	59399-162-35
Curity 2 x 2 Inch Gauze Sponge 8 Ply, Sterile	Covidien	1806
Derf Needle Holder	Thomas Scientific	1177K00
Dissecting Microscope
Dumont #5/45 Forceps	Fine Science Tools	11251-35
Dumont #7b Forceps	Fine Science Tools	11270-20
ETHILON Nylon Suture	Ethicon	698H
Fine Scissors - ToughCut	Fine Science Tools	14058-09
Hypoallergenic Surgical Tape	3M Blenderm	70200419342
Induction Chamber, 2 Liter	VetEquip	941444
Isoflurane	Baxter	1001936060
Nair	Church & Dwight Co., Inc	40002957	chemical hair removing agent
NORADRENALINE RESEARCH ELISA	Labor Diagnostika Nord (Rocky Mountain Diagnostics)	BA E-5200
NSG Mouse	Jackson Laboratory	JAX:005557
Povidone-Iodine Swabstick	PDI	S41350
Webcol Alcohol Preps	Covidien	5110