JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

يصف هذا البروتوكول توليد العضيات الكبدية الباطنة السريعة والقابلة للتكرار (eHEPOs). باستخدام هذا البروتوكول ، يمكن إنتاج eHEPOs في غضون أسبوعين والتوسع على المدى الطويل (أكثر من عام) دون أن تفقد تمايزها ووظائفها.

Abstract

سمحت لنا التكنولوجيا العضوية بتوليد مجموعة متنوعة من الهياكل المصغرة الشبيهة بالأعضاء البشرية ، مثل الكبد والدماغ والأمعاء ، في المختبر. فتحت التطورات الملحوظة في النماذج العضوية مؤخرا حقبة تجريبية جديدة لتطبيقات مختلفة في نمذجة الأمراض وعلم الأحياء التنموي واكتشاف الأدوية. تتحكم الخلايا الجذعية البالغة أو عضيات الكبد المستحثة متعددة القدرات المشتقة من الخلايا الجذعية (iPSC) على توليد خلايا الكبد لاستخدامها في تطبيقات متنوعة. هنا ، نقدم بروتوكولا قويا وقابلا للتكرار لتوليد العضيات الكبدية من الخلايا الجذعية متعددة القدرات. ينطبق هذا البروتوكول على الخلايا السليمة والمشتقة من المريض. لتحقيق العضيات الكبدية المشتقة من الأديم الباطن ثلاثية الأبعاد (eHEPOs) ، تم تمييز iPSCs مباشرة أولا إلى خلايا الأديم الباطني ، ثم تم استخدام الخلايا الإيجابية EpCAM المخصبة ب FACS (EpCAM +) لإنشاء العضيات الكبدية باستخدام وسط التمدد. نحن نقدم طريقة سريعة وفعالة لتوليد العضيات الكبدية في غضون أسبوعين. تحاكي العضيات المتولدة الخصائص والوظائف الأساسية لخلايا الكبد ، مثل إفراز الألبومين وتخزين الجليكوجين ونشاط إنزيم السيتوكروم P450. إلى جانب أوجه التشابه في التعبير الجيني الخاص بالكبد ، تشتمل eHEPOs على خلايا ظهارية مستقطبة مع قنوات صفراوية بينهما. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن توسيع eHEPOs والممرات التسلسلية على المدى الطويل (1 سنة) دون أن تفقد قدرتها على التمايز إلى خلايا كبد ناضجة. وبالتالي ، توفر eHEPOs مصدرا بديلا لإنتاج خلايا الكبد الوظيفية.

Introduction

العضيات عبارة عن هياكل مصغرة تشبه الأعضاء تزرع في ظروف ثقافة ثلاثية الأبعاد تحاكي البيئة المكروية للأعضاء وتشمل العوامل الجوهرية اللازمة للتنظيم الذاتي والتجديد الذاتي في نمو الأعضاء نفسها. يمكن اشتقاق العضيات إما من الخلايا الجذعية متعددة القدرات (PSCs) أو الخلايا المشتقة من الأنسجة البالغة (الخلايا الجذعية أو السلفية)1. على الرغم من أن تنظيمها الدقيق الشبيه بالأعضاء والتشابه الوظيفي مع العضو المحدد يجعلها أدوات قيمة لنمذجة الأمراض ، إلا أنها لا تزال بحاجة إلى مزيد من التحسينات من حيث التوحيد القياسي في الثقافة. على وجه الخصوص ، تم نشر العديد من البروتوكولات لتوليد عضيات الكبد ، وهي تختلف في تعقيدها وقابليتها للتكاثر2. على سبيل المثال ، عضيات براعم الكبد التي طورها Takebe et al. تأخذ شكل هياكل كثيفة متعددة الخلايا تحتوي على الخلايا الجذعية متعددة القدرات المستحثة التالية (iPSCs): أسلاف الأديم الباطن الكبدي ، والخلايا البطانية للوريد السري البشري (HUVECs) ، والخلايا الجذعية الوسيطة (MSCs). ومع ذلك ، فإن هذه العضيات ليس لديها قدرة على التجديد الذاتي على المدى الطويل3،4.

من منظور تاريخي ، Huch et al. أبلغ لأول مرة عن إنتاج العضيات الظهارية الكبدية البشرية المشتقة من الأنسجة البالغة ، حيث تستقطب الخلايا وتتخصص لإعادة إنتاج جوانب من الظهارةالأصلية 5. ثم, Guan et al. استخدم العضيات الكبدية المشتقة من iPSC لنمذجة متلازمة ألاجيل (ALGS), اضطراب وراثي نادر مرتبط بتصغير القناة الصفراوية داخلالكبد 6. تتمتع كل من هذه العضيات بقدرة على التجديد الذاتي ويمكن أن تكتسب وظائف خلايا كبد ناضجة ، مثل إفراز الصفراء والألبومين ، وتخزين الجليكوجين ، وإزالة السموم من الأدوية الخاصة بالكبد. في دراسة حديثة ، قدم Ramli et al. نموذجا عضويا للكبد مشتق من PSC يحتوي على شبكات قناة صفراوية وظيفية بين الخلايا الشبيهة بخلايا الكبد المستقطبة (HLCs) التي تفرغ الأدوية الصفراوية في أكياس صفراوية تتكون من خلايا شبيهة بالخلايا الصفراوية (CLCs) 7.

تقدم هذه الدراسة ثقافة فريدة لتوليد العضيات الكبدية المشتقة من iPSC, تسمى eHEPOs. يتم وصف ثقافة iPSC والتمايز إلى الأديم الباطن خطوة بخطوة, ويتم إثبات توليد eHEPOs من أسلاف EpCAM + المخصبة. أخيرا ، يتم وصف توصيف الوظائف والتنظيم الهيكلي ل eHEPOs ، بالإضافة إلى حفظ العضيات بالتبريد.

Protocol

تم الحصول على الأذونات المتعلقة بالخطوات التجريبية من لجنة أخلاقيات البحث السريري المحلية التابعة لكلية الطب بجامعة دوكوز إيلول (2013/25-4، 12 مايو 2013؛ 2016/30-29، 24 نوفمبر 2016).

1. تحضير حلول لزراعة الخلايا

  1. قم بإعداد وسط تمايز الأديم الباطن عن طريق خلط المكونات التالية في غطاء التدفق الرقائقي: 1٪ B27 ، 100 نانوغرام / مل Activin A ، Wnt3a أو 30٪ wnt3a-CM ، و R-spo1 أو 10٪ R-spo1-CM (انظر جدول المواد).
  2. قم بإعداد المخزن المؤقت لفرز الخلايا المنشط بالفلورة (FACS) بالتركيبة التالية: PBS ، 1 ملي مولار EDTA ، 25 ملي مولار HEPES ، 1٪ FBS.
  3. تحضير وسط التمدد (EM): 1٪ N2 ، 1٪ B27 ، 1.25 ملي مولار N-acetyl-L-cysteine ، 50 نانوغرام / مل EGF ، 10٪ R-spo1 وسط مكيف ، 100 نانوغرام / مل FGF 10 ، 10 ملي نيكوتيناميد ، 5 ميكرومتر A8301 ، و 10 ميكرومتر فورسكولين (FSK) في DMEM / F-12 المتقدم. أضف 10 نانومتر Y-27632 و 0.3 نانومتر WNT3a (انظر جدول المواد).
    ملاحظة: احتفظ بالوسط الكامل لمدة أسبوعين كحد أقصى عند 2-8 درجة مئوية.
  4. تحضير وسط التمايز (DM): 1٪ N2 ، 1٪ B27 ، 10 نانومتر جاسترين ، 50 نانوغرام / مل EGF ، 100 نانوغرام / مل FGF 10 ، 25 نانوغرام / مل HGF ، 500 نانومتر A8301 ، 10 ميكرومتر DAPT ، 25 نانوغرام / مل BMP7 ، و 30 ميكرومتر ديكساميثازون في Ad-DMEM / F-12 (انظر جدول المواد).
    ملاحظة: احتفظ بالوسط الكامل لمدة أسبوعين عند 2-8 درجة مئوية.

2. ذوبان iPSCs على لوحة خالية من المغذيات

  1. قم بتغطية لوحة زراعة الخلية بمصفوفة الغشاء القاعدي (BMM).
    1. قم بإذابة قنينة واحدة من كمية BMM طوال الليل على الجليد أو لمدة ساعتين على الأقل قبل بدء الطلاء. أضف 6 مل من DMEM / F-12 البارد في أنبوب مخروطي سعة 15 مل ، وأضف على الفور 80 ميكرولتر من BMM المذاب ، واخلطه جيدا.
    2. استخدم ألواح الآبار المعالجة بزراعة الأنسجة ، وقم بتغطية لوحة الثقافة بمحلول BMM ، وقم بتوزيعها لتغطية سطح لوحة البئر. احتضان اللوحة في حاضنة 37 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة على الأقل قبل الاستخدام. بعد وقت الحضانة, تجاهل حل BMM, وأضف على الفور الوسيط الخاص ب iPSC.
  2. قم بإزالة قارورة واحدة من iPSCs من تخزين النيتروجين السائل باستخدام قفازات مبردة. ضع القارورة على الفور على رف أنبوبي عائم ، واغمر الرف في حمام مائي بدرجة حرارة 37 درجة مئوية حتى تذوب بلورات الثلج.
    1. قم بإزالة القارورة من الحمام المائي ، وامسح الجزء الخارجي منها جيدا بنسبة 70٪ من الإيثانول. ثم ضعه في غطاء المحرك الرقائقي. من المهم أن تكون سريعا في هذه الخطوة.
    2. في ظل ظروف معقمة ، في غطاء رقائقي ، انقل الخلايا المذابة إلى أنبوب مخروطي معقم 15 مل يحتوي على 5 مل من الوسط الخاص ب iPSC.
      1. الطرد المركزي للخلايا عند 200 × جم (في درجة حرارة الغرفة) لمدة 3 دقائق. تخلص من المادة الطافية ببطء, إعادة تعليق الخلايا في 2 مل من الوسط الخاص iPSC عن طريق سحب العينة برفق جدا عدة مرات مع 5 مل ماصة مصلية, وزرع الخلايا على الآبار المطلية.
    3. حرك اللوحة بسرعة لتفريق الخلايا في جميع أنحاء سطح البئر. احتضان اللوحة في حاضنة 37 درجة مئوية ، 5٪ ثاني أكسيد الكربون2 .
    4. قم بتحديث وسيط الثقافة كل يوم.

3. تمايز الأديم الباطن

  1. قم بتغطية لوحة بئر جديدة ب BMM 1 ساعة قبل تقسيم iPSCs, كما هو مذكور في القسم 2.
  2. التحكم في سلامة وقابلية استمرارية iPSCs تحت الفحص المجهري الضوئي. iPSCs غير المتمايزة هي خلايا ذات نوى كبيرة, السيتوبلازم الصغير, ومستعمرات الخلايا المدمجة ذات الحواف المميزة.
    ملاحظة: هناك نوعان من الحلين الأنزيميين لتقسيم الخلايا. في حالة استخدام التباين (1 وحدة / مل) ، يجب إزالة مناطق الخلايا المتمايزة. إذا تم استخدام إنزيم معين ، فلا داعي للتمييز يدويا بين المناطق باستخدام الكشط أو الشفط. احتفظ بالإنزيم المحدد في درجة حرارة الغرفة.
  3. تسخين iPSC متوسط إلى درجة حرارة الغرفة. شفط الوسط, وشطف لوحة iPSC مع DMEM / F-12 أو D-PBS. أضف 1 مل من الإنزيم المحدد إلى بئر واحد من صفيحة مكونة من 6 آبار ، واحتضن لمدة دقيقة واحدة في درجة حرارة الغرفة ، ثم استنشق الإنزيم المحدد ، واحتضن اللوحة عند 37 درجة مئوية لمدة 5-7 دقائق.
    ملاحظة: يجب تحسين وقت المعالجة الأمثل مع الإنزيمات بناء على خط iPSC المستخدم.
  4. بعد وقت الحضانة, إضافة 1 مل من وسط iPSC الدافئ مسبقا, واضغط برفق على جانب اللوحة لفصل المجاميع مستعمرات غير متمايزة من سطح اللوحة. الحجم الأمثل للركام هو 50-200 ميكرومتر.
    1. باستخدام ماصة مصلية سعة 5 مل، امزج المعلق برفق، ثم قم بزرع معلق الخلية بالكثافة المطلوبة على البئر المطلي ب BMM. احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية لمدة 3-5 أيام للوصول إلى التقاء 70٪.
  5. قبل البدء في التمايز, استبدال الوسط iPSC مع وسط الأديم الباطن (الخطوة 1.1). قم بتحديث الوسيط كل يوم. التحكم في التغيرات المورفولوجية للخلايا أثناء خطوات التمايز. تبدأ تفاعلات الخلية في الظهور بعد التمايز ، وتكتسب الخلايا شكلا شائكا.

4. تأسيس eHEPO

  1. قم بتخصيب خلايا الأديم الباطن EpCAM + باستخدام FACS.
    1. قم بإذابة قارورة واحدة من BMM العضوي (انظر جدول المواد) على الجليد قبل تجربة فرز الخلايا. قم بتسخين ألواح زراعة الأنسجة مسبقا عند 37 درجة مئوية طوال الليل قبل تجربة فرز الخلايا.
    2. اشطف خلايا الأديم الباطن باستخدام 1x PBS. أضف 300 ميكرولتر من التربسين ، واحتضن لمدة 5 دقائق في الحاضنة. أضف 3 مل من DMEM-F12 البارد ، وماصة مع أطراف مرشح 1,000 ميكرولتر لتوليد خلايا مفردة.
    3. اجمع معلق الخلية في أنبوب مخروطي سعة 15 مل. الطرد المركزي للخلايا عند 300 × جم (في درجة حرارة الغرفة) لمدة 5 دقائق. تخلص من المادة الطافية ، واغسل الحبيبات ب 10 مل من المخزن المؤقت FACS (الخطوة 1.2).
    4. لعمل تعليق أحادي الخلية ، قم بتصفية الخلايا أولا باستخدام مصفاة شبكية 100 ميكرومتر ثم مصفاة شبكية 40 ميكرومتر.
      ملاحظة: قبل استخدام المصفاة ، اشطف سطح المصفاة ب 1 مل من المخزن المؤقت FACS.
    5. جهاز الطرد المركزي لتعليق الخلية عند 300 × جم (في درجة حرارة الغرفة) لمدة 5 دقائق. عد رقم الخلية باستخدام Trypan Blue8.
    6. نسبة التلوين هي 1:11. على سبيل المثال ، قم بإعادة تعليق 15 × 106 خلايا مع 105 ميكرولتر من المخزن المؤقت FACS ، وأضف 45 ميكرولتر من FcR و 15 ميكرولتر من EpCAM (انظر جدول المواد). احتضان الخلايا لمدة 10 دقائق عند 40 درجة مئوية ، وحماية الأنبوب من الضوء. بعد الحضانة ، أضف 500 ميكرولتر من المخزن المؤقت FACS لغسل تعليق الخلية. الطرد المركزي للخلايا عند 300 × جم (في درجة حرارة الغرفة) لمدة 5 دقائق.
    7. أعد تعليق الحبيبات في 500 ميكرولتر من المخزن المؤقت FACS. أضف DAPI (0.5 ميكرومتر / 1 مل ، التركيز النهائي) إلى تعليق الخلية لتحديد الخلايا الميتة. احتفظ بالخلايا على الجليد حتى تبدأ خطوة فرز الخلايا.
  2. قم بتضمين EpCAM والخلايا التي تم فرزها في BMM. بعد فرز الخلايا ، قم بالطرد المركزي للخلايا عند 300 × جم لمدة 5 دقائق لسحب المخزن المؤقت FACS. قم بإزالة المادة الطافية ، وأعد تعليق 3,000-5,000 خلية في 20 ميكرولتر من BMM.
    1. قم بزرع الخلايا عن طريق إضافة قطرة من BMM إلى وسط كل لوحة 48 بئرا. احتضان الخلايا لمدة دقيقتين عند 37 درجة مئوية حتى يتم ترسيخ BMM. أعد الطبق بعناية ، واحتفظ به في الحاضنة لمدة 10 دقائق أخرى. تراكب القطرة بوسط التمدد (250 ميكرولتر لكل بئر للوحة 48 بئرا).
    2. قم بتحديث الوسط العضوي كل 3 أيام. في الأيام 10-11 ، سيكون حجم العضوية أكبر من 100 ميكرومتر.
  3. إجراء التفكك والتمايز الميكانيكي eHEPO.
    1. قسم كل قطرة عضوية بنسبة 1: 4. للتقسيم ، تخلص من الوسط العضوي وأضف 500 ميكرولتر من Ad-DMEM / F12 البارد. باستخدام أطراف مرشح سعة 1,000 ميكرولتر، قم بعمل ماصة قطرات BMM بقوة.
    2. اجمع قطرات 10 BMM كحد أقصى في أنابيب مخروطية سعة 15 مل ، وأضف 5 مل من Ad-DMEM / F12 البارد. احتفظ بالأنبوب على الجليد لمدة 3-5 دقائق.
    3. الطرد المركزي للخلايا عند 200 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية. تخلص من المادة الطافية حتى يتبقى 1 مل. قم بسحب حبيبات الخلية بقوة 30-40 مرة باستخدام 200 أطراف مرشح ميكرولتر. تحقق من الحجم العضوي تحت المجهر الضوئي ، وتجنب بعناية تكوين تعليق أحادي الخلية.
    4. بعد التفكك الميكانيكي ، أضف 5 مل من Ad-DMEM / F12 البارد ، وقم بالطرد المركزي للخلايا عند 200 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية.
    5. تخلص من المادة الطافية ، واحتفظ بالتعليق على الجليد حتى بذر الخلايا.
    6. قم بزرع قطرة 50 ميكرولتر من BMM (تحتوي على 35 ميكرولتر من BMM + 15 ميكرولتر من الخلايا و Ad-DMEM / F-12 لكل بئر للوحة 24 بئرا).
    7. أضف BMP7 (25 نانوغرام / مل ، انظر جدول المواد) إلى وسط EM ، وزراعته لمدة 3 أيام. في اليوم 4 ، استبدل الوسيط بوسط التمايز (الخطوة 1.4). قم بتحديث الوسط كل 3 أيام ، وزرع الخلايا لمدة 14 يوما على الأقل.

5. توصيف eHEPOs

  1. إجراء الفحوصات النسيجية.
    1. أداء تضمين البارافين.
      1. قم بإزالة الوسيط ، وأضف 1-2 مل من 1x PBS البارد ، وأعد تعليق BMM برفق في 1x PBS البارد. انقل العضيات بعناية إلى أنبوب طرد مركزي سعة 15 مل. اسمح للعضيات بالاستقرار تحت الجاذبية ، ثم استنشق PBS بعناية. كرر خطوة الغسيل ثلاث مرات.
      2. أضف 10 مل من المثبت الطازج (10٪ فورمالين محايد مؤقت) إلى العضيات ، واحتضنه لمدة 30 دقيقة. قم بإزالة المثبت برفق ، وأضف 10 مل من 1x PBS البارد ، واحتضنه لمدة 10 دقائق. استنشق بعناية PBS.
      3. تلطخ العضيات في محلول 0.5٪ يوزين (انظر جدول المواد) المذاب في 96٪ من الإيثانول لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
        ملاحظة: إذا كان سيتم التلوين المناعي ، فلا تلطخ باليوزين.
      4. قم بتجفيف العضيات عن طريق الغسيل باستخدام سلسلة كحول (70٪ إيثانول ، 80٪ إيثانول ، و 96٪ إيثانول) لمدة 5 دقائق لكل منها في درجة حرارة الغرفة. انقع العضيات في 100٪ إيثانول (الإيثانول المطلق) لمدة 30 دقيقة.
      5. قم بمسح العضيات باستخدام الزيلين (انظر جدول المواد) ثلاث مرات لمدة 20 دقيقة في كل مرة9.
        تنبيه: الزيلين مركب شديد السمية وقابل للاشتعال ، لذا تعامل معه باستخدام معدات السلامة المناسبة. تجنب العمل بكميات كبيرة.
      6. انقل العضيات برفق إلى قالب قاعدة معدنية مسخن مسبقا (انظر جدول المواد) باستخدام البارافين المنصهر باستخدام ماصة بلاستيكية. امسك العضيات في البارافين المصهور ثلاث مرات لمدة 30 دقيقة لكل منها في حاضنة 65 درجة مئوية (استبدلها بالبارافين المذاب الطازج الجديد عند كل تغيير).
      7. ثم قم بتضمين العضيات في البارافين الطازج الجديد. حرك العضيات برفق في منتصف قالب القاعدة المعدنية.
        ملاحظة: في هذه الخطوة ، من الضروري العمل بسرعة لأن البارافين يتجمد في درجة حرارة الغرفة.
      8. انقل قالب القاعدة المعدنية إلى الصفيحة الباردة لمدة 10-20 ثانية لتثبيت العضيات. بعد ذلك ، اسكب البارافين المنصهر لتغطية قالب القاعدة المعدنية ، وأضف كاسيت مناديل (انظر جدول المواد) في الجزء العلوي من قالب القاعدة المعدنية لوضع العلامات. تأكد من وجود كمية كافية من البارافين في القالب ، ثم اتركه يتجمد على الطبق البارد. قم بإزالة قالب القاعدة المعدنية.
      9. قم بقص أقسام بسمك 5-7 ميكرومتر باستخدام ميكروتوم قياسي (انظر جدول المواد). ضع أقسام البارافين التسلسلية على شرائح المجهر اللاصق. دع الشرائح تجف طوال الليل.
    2. إجراء الهيماتوكسيلين والأيوزين (H&E) والتلوين الدوري للأحماض (PAS).
      1. ضع الشرائح المدمجة في البارافين في حاضنة 63 درجة مئوية طوال الليل لإزالة البارافين. في اليوم التالي ، ضع الشرائح في الزيلين ثلاث مرات لمدة 20 دقيقة في كل مرة. لا تدع الشرائح تجف.
      2. أعد ترطيب الشرائح بسلسلة كحول متدرجة (100٪ إيثانول ، 96٪ إيثانول ، 80٪ إيثانول ، و 70٪ إيثانول) لمدة دقيقتين. ثم ضع الشرائح في الماء المقطر لمدة 1 دقيقة.
      3. بالنسبة إلى تلطيخ H& E ، قم بتنفيذ الخطوات التالية.
      4. ضع الشرائح في محلول الهيماتوكسيلين لمدة 5 دقائق. اشطف الشرائح بماء الصنبور الجاري لمدة 5 دقائق. قم بتلطيخ الشرائح بمحلول 1٪ eosin Y (انظر جدول المواد) لمدة 10 ثوان.
      5. قم بتجفيف الأقسام بسلسلة من 80٪ إيثانول ، 96٪ إيثانول ، وتغييرين بنسبة 100٪ من الإيثانول لمدة 30 ثانية لكل منهما.
      6. ضع الشرائح في الزيلين للمسح ثلاث مرات لمدة 20 دقيقة في كل مرة.
      7. قم بتركيب أغطية بعناية على الأقسام الموجودة على الشرائح الزجاجية بوسيط تثبيت (انظر جدول المواد). تأكد من عدم وجود فقاعات متبقية.
      8. بالنسبة لتلوين PAS ، قم بتنفيذ الخطوات 5.1.2.4-5.1.2.6 ، متبوعة بإجراءات تلطيخ PAS كما أفاد Akbari et al.10. ثم قم بتركيب الغطاء بعناية على الأقسام الموجودة على الشرائح الزجاجية باستخدام وسط التثبيت. تأكد من عدم وجود فقاعات متبقية.
    3. إجراء تلطيخ الكيمياء المناعية (IHC).
      1. قم بتنفيذ الخطوة 5.1.2.1 والخطوة 5.1.2.2 في بروتوكول تلطيخ H&E.
      2. قم بتسخين الشرائح في محلول سترات 0.1 متر (درجة الحموضة 6.0) في الميكروويف لمدة 10 دقائق.
      3. استمر حتى تبرد الشرائح إلى درجة حرارة الغرفة (حوالي 20 دقيقة) ، واشطف الشرائح بالماء المقطر.
      4. ضع الشرائح في 3٪ H2O2 محضرة طازجة في الميثانول لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة. ثم اشطف الشرائح بالماء المقطر لمدة 1 دقيقة.
      5. منع الارتباط غير المحدد للأجسام المضادة التمهيدي عن طريق احتضان الأقسام بمحلول مانع (2٪ مصل + 0.1٪ Triton X-100 + 0.1٪ BSA) في درجة حرارة الغرفة لمدة 1 ساعة.
      6. قم بإزالة محلول الحجب برفق ، وأضف الأجسام المضادة الأولية (E-CAD ، ALB ، EPCAM ، A1AT ، CK19) (انظر جدول المواد) المخففة في محلول الحجب عند 4 درجات مئوية بين عشية وضحاها.
      7. في اليوم التالي ، اشطف الشرائح بعناية مرتين لمدة 10 دقائق (.
      8. أضف الأجسام المضادة الثانوية (مضاد للأرانب الماعز ، مضاد للماعز ، مضاد للفأر) (انظر جدول المواد) لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة ، واشطف الشرائح بالماء المقطر لمدة 5 دقائق (ثلاث مرات).
      9. قم بإعداد محلول 3'3 ديامينوبينزيدين رباعي هيدروكلوريد (DAB ، انظر جدول المواد) (يجب تحضيره قبل 30 دقيقة من الاستخدام).
      10. ضع محلول DAB على الشرائح لمدة 1-5 دقائق ، واشطف الشرائح بالماء المقطر لمدة 5 دقائق (ثلاث مرات).
      11. قم بإزالة البقع المضادة للأقسام باستخدام الهيماتوكسيلين لمدة 1 دقيقة ، واشطف الشرائح بماء الصنبور الجاري لمدة 1 دقيقة.
      12. قم بتجفيف الأقسام بسلسلة من 80٪ إيثانول ، 96٪ إيثانول ، وتغييرين بنسبة 100٪ من الإيثانول لمدة 30 ثانية لكل منهما.
      13. ضع الشرائح في الزيلين لمدة 20 دقيقة (ثلاث مرات).
      14. قم بتركيب الغطاء بعناية على القسم الموجود على الشريحة الزجاجية باستخدام وسيط تثبيت. تأكد من عدم وجود فقاعات متبقية.
    4. قم بإجراء تضمين OCT.
      1. قم بإصلاح العضيات باستخدام PFA البارد الطازج 4٪ طوال الليل عند 4 درجات مئوية. قم بإزالة المثبت بعناية ، واغسله باستخدام 1x PBS لمدة 15 دقيقة (ثلاث مرات).
      2. تحضير محلول سكروز بنسبة 30٪ (وزن / حجم) باستخدام الماء المقطر. قم بإزالة 1x PBS ، وأضف 30٪ من السكروز لتجفيف العضيات.
      3. احتضان العضيات عند 4 درجات مئوية بين عشية وضحاها. في البداية ، تطفو معظم الأنسجة في 30٪ من السكروز وتغرق بمجرد اكتمال التغلغل. يمكن اعتبار الحماية بالتبريد كاملة في هذه المرحلة.
      4. تحضير الثلج الجاف أو النيتروجين السائل لعملية التضمين.
      5. ضع قطرتين إلى ثلاث قطرات من OCT (انظر جدول المواد) في قوالب التبريد البلاستيكية. ضع العضيات في الأعلى في الاتجاه الصحيح للقطع.
      6. اسكب OCT ببطء وحذر فوق العضيات. كن حذرا لتجنب الفقاعات. اسمح للعضيات بالاستقرار تحت الجاذبية لمدة 10-15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
      7. قم بتسمية قوالب التبريد قبل خطوة التجميد. ضع القوالب على الثلج الجاف أو النيتروجين السائل للتجميد السريع. انقل القوالب المبردة إلى -80 درجة مئوية ، وقم بتخزينها هناك حتى عملية التقسيم.
    5. قم بإجراء تلطيخ التألق المناعي (IF).
      1. قم بإجراء تلطيخ القسم المجمد.
        1. جفف أقسام التبريد بالهواء لمدة 20-30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. أعد ترطيب الشرائح بالماء المقطر لمدة 5 دقائق (ثلاث مرات). أحيط الأنسجة بحاجز كاره للماء باستخدام قلم بابي (انظر جدول المواد).
        2. أضف 200-300 ميكرولتر من 0.2٪ Triton X-100 لكل قسم. اغسل الشرائح بعناية لمدة 5 دقائق (ثلاث مرات). تأكد من أن الأقسام لا تسقط من الشرائح أثناء خطوات الغسيل.
        3. أضف محلول مانع (2٪ مصل + 0.1٪ Triton X-100 + 0.1٪ BSA) لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة.
        4. قم بإزالة محلول الحجب برفق ، وأضف الأجسام المضادة الأولية (E-CAD ، A1AT ، HNF4α) المخففة في محلول الحجب (انظر جدول المواد) ، واحتضن الشرائح طوال الليل عند 4 درجات مئوية ، وفي اليوم التالي ، اشطف الشرائح بعناية لمدة 10 دقائق (مرتين).
        5. أضف أجساما مضادة ثانوية مناسبة (Alexa Fluor 488 [Mouse] ، Alexa Fluor 594 [Mouse ] ، Alexa Fluor 594 [Rabbit]) لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة (انظر جدول المواد) ، واشطف الشرائح بالماء المقطر لمدة 5 دقائق (ثلاث مرات).
        6. أضف 100-200 ميكرولتر من Hoechst أو DAPI صبغة نووية لكل قسم لمدة 3 دقائق ، واغسل الشرائح باستخدام 1x PBS ، وكرر خطوة الغسيل ثلاث مرات.
        7. قم بتركيب الغطاء على الأقسام الموجودة على الشرائح الزجاجية باستخدام وسيط تثبيت مضاد للبهتان. احتفظ بالشرائح طوال الليل عند 4 درجات مئوية ، واحميها من الضوء حتى عملية التصوير.
      2. أداء تلطيخ كامل التلقيب.
        1. قم بتنفيذ الخطوة 5.1.1.1 والخطوة 5.1.1.2 في إجراء تضمين البارافين.
        2. أضف محلول حجب (0.1٪ -1٪ Triton X-100 ، 1٪ DMSO ، 1٪ BSA ، و 1٪ مصل الماعز في 1x PBS ، انظر جدول المواد) ، واحتضان العضيات بمحلول مانع لمدة 2-3 ساعات في درجة حرارة الغرفة.
        3. قم بإزالة محلول المانع برفق ، وأضف الأجسام المضادة الأولية (CK19 ، CK18 ، ZO-1 ، ALB) المخففة في محلول الحجب طوال الليل عند 4 درجات مئوية (انظر جدول المواد).
        4. في اليوم التالي ، قم بإزالة المحلول برفق ، وأضف 1x PBS. دع العضيات تستقر تحت الجاذبية لمدة تصل إلى 10 دقائق. قم بإزالة المحلول بعناية ، وكرر خطوة الغسيل ثلاث مرات.
        5. احتضان العضيات بالأجسام المضادة الثانوية (Alexa Fluor 594 [Mouse ] ، Alexa Fluor 488 [Rabbit] ، Alexa Fluor 488 [Mouse]) لمدة ساعة واحدة على الأقل في درجة حرارة الغرفة. قم بإزالة المحلول بعناية ، وكرر خطوة الغسيل أربع مرات.
        6. للتلوين النووي ، احتضان العضيات بصبغة نووية Hoechst أو DAPI لمدة 10 دقائق. اغسل العضيات بإضافة 1x PBS ، وكرر خطوة الغسيل ثلاث مرات. دع العضيات تستقر في قاع الأنبوب.
        7. باستخدام ماصة باستور بلاستيكية ، قم بإزالة العضيات من الأنبوب ، وضعها على شرائح زجاجية. تأكد من القيام بذلك بأقل قدر من الضرر الذي يلحق بالعضيات.
        8. قم بإزالة PBS الزائد ، وأضف كمية (قطرة إلى قطرتين) من وسط التثبيت. قم بتركيب الغطاء بعناية على العضيات على الشرائح الزجاجية باستخدام وسيط التثبيت. احتفظ بالشرائح عند 4 درجات مئوية ، واحمها من الضوء حتى عملية التصوير.
  2. إجراء المجهر الإلكتروني.
    1. قم بإصلاح العضيات باستخدام محلول كارنوفسكي (2.5٪ جلوتارالديهايد مخزن + 2٪ بارافورمالدهيد في محلول فوسفات الصوديوم 0.1 M [عازلة سورنسن] ، درجة الحموضة 7.4 ، انظر جدول المواد) بين عشية وضحاها عند 4 درجات مئوية.
    2. اغسل العضيات بمحلول 0.1 متر من سورنسون + 0.1 متر من السكروز (1: 1) لمدة 15 دقيقة (ثلاث مرات). بعد ذلك ، قم بتثبيت العضيات في 2٪ من رابع أكسيد الأوزميوم المخزن بفوسفات الصوديوم (انظر جدول المواد) لمدة 90 دقيقة.
    3. قم بتضمين العضيات في أجار دافئ بنسبة 2٪. اقطع الأجار الزائد حول العضيات باستخدام إبرة وخز. اغسل العضيات في عازلة سورنسن لمدة 15 دقيقة (ثلاث مرات).
    4. جفف باستخدام 50٪ أسيتون لمدة 15 دقيقة (مرتين).
    5. تباين بين عشية وضحاها باستخدام 70٪ أسيتون + 1٪ حمض فوسفوتنجستيك + 0.5٪ أسيتات اليورانيل (انظر جدول المواد) عند 4 درجات مئوية.
    6. في اليوم التالي ، قم بتجفيف العضيات باستخدام سلسلة الأسيتون (80٪ أسيتون ، 90٪ أسيتون ، 96٪ أسيتون ، و 100٪ أسيتون) لمدة 15 دقيقة (مرتين).
    7. قم بتنظيف العضيات باستخدام أكسيد البروبيلين لمدة 10 دقائق (مرتين) ، ثم ضع العضيات في خليط إيبون: أكسيد البروبيلين (انظر جدول المواد) لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
    8. أضف محلول epon جديدا إلى العضيات ، واحتضنه طوال الليل عند 4 درجات مئوية.
    9. في اليوم التالي ، ضع محلول epon جديدا جديدا في القالب الأساسي ، ثم قم بتضمين العضيات. ضع في حاضنة لمدة 48 ساعة عند 65 درجة مئوية للبلمرة.
    10. قم بقص كتل epon العضوية باستخدام ميكروتوم فائق الصغر على سمك قسم 50-100 نانومتر. ضع الأقسام على الشبكات المغطاة بformvar.
  3. قياس نشاط إنزيم CYP3A4.
    1. قم بقياس نشاط CYP باستخدام مجموعة متوفرة تجاريا (انظر جدول المواد) باتباع تعليمات الشركة المصنعة.
      ملاحظة: تقوم إنزيمات CYP بتحويل الركيزة إلى منتج وسيط قابل للاكتشاف11،12،13. هناك خياران (محلل الخلية وغير المحلل) لقياس نشاط إنزيم CYP. توفر المجموعة تطبيقا لتحليل أنشطة CYP القاعدية وأنشطة CYP المستحثة بعد العلاج المركب.
    2. قم بتشغيل التجربة بثلاث نسخ. اقرأ التلألؤ باستخدام مقياس الإضاءة ، واحسب الإشارة. للتطبيع ، قم بتربسين العضيات ، واحسب عدد الخلايا.
  4. إجراء قياس الألبومين البشري.
    1. استبدل وسط زراعة الخلية بوسط جديد قبل 24 ساعة من اختبار ELISA. بعد 24 ساعة من الحضانة ، اجمع وسط زراعة الخلايا (300-500 ميكرولتر) ، وجهاز الطرد المركزي عند 500 × جم (عند 4 درجات مئوية) لمدة دقيقتين لإزالة بقايا الخلية والجزيئات. قم بتخزين المادة الطافية ، وقم بتخزين العينات عند -80 درجة مئوية (حتى 3 أشهر).
    2. قم بتشغيل المعيار والعينة في نسختين. تفرز العضيات الناضجة الألبومين في وسط الثقافة. حدد كمية هذا الألبومين باستخدام مجموعة القياس الكمي ELISA (انظر جدول المواد). قم بقياس الامتصاص باستخدام قارئ لوحة ELISA عند 450 نانومتر في غضون 30 دقيقة بعد إيقاف إضافة المحلول. قم بتربسين العضيات ، واحسب عدد الخلايا المراد تطبيعها.
  5. إجراء فحص القضاء على الأمونيا.
    1. قم بإجراء فحص التخلص من الأمونيا باتباع تعليمات الشركة المصنعة (انظر جدول المواد). باختصار ، أضف 1.5 ملي مولار NH4Cl إلى وسط الثقافة ، واحتضنه لمدة 24 ساعة.
    2. بعد الحضانة ، حدد تركيز الأمونيا باستخدام مجموعة فحص الأمونيا (انظر جدول المواد). احسب القياسات باستخدام قارئ متعدد الألواح متعدد الأوضاع ، وقم بتطبيع القيم لأرقام الخلايا.
  6. قم بإجراء فحص كوليل جليسيلاميدو فلورسين (CLF).
    1. باختصار ، عالج العضيات ب 10 ميكرولتر / لتر CLF (انظر جدول المواد) ، واحتضن لمدة ساعة واحدة في حاضنة 37 درجة مئوية. بعد الحضانة ، اغسل العضيات باستخدام 1x PBS. إجراء التصوير باستخدام الفحص المجهري الفلوري.
  7. إجراء تحليل التعبير الجيني.
    1. اتبع تعليمات مجموعة RNeasy (انظر جدول المواد) لعزل إجمالي الحمض النووي الريبي عن eHEPOs.
    2. قم بإعداد تفاعل تفاعل تفاعل البوليميراز المتسلسل باستخدام مزيج رئيسي متاح تجاريا (انظر جدول المواد)، باتباع تعليمات الشركة المصنعة. بعد تحضير مزيج PCR لكل مجموعة أولية ، ضع 10 ميكرولتر من كل عينة في ألواح qPCR المكونة من 96 بئرا (الجدول 1).
    3. أغلق الألواح بمادة لاصقة مانعة للتسرب ، ثم قم بالطرد المركزي للألواح عند 1,000 × جم لمدة دقيقتين في درجة حرارة الغرفة. قم بتحميل الألواح في جهاز PCR. تطبيع التعبير الجيني النسبي إلى عنصر تحكم داخلي (RPL41 ، الجدول 1) ، وقم بالتحليل باستخدام طريقة 2−ΔΔCt 14.

6. الحفظ بالتبريد لوحدات eHEPO

  1. قم بتسمية المبردات بعلامة مقاومة للنيتروجين. تحقق من مستوى الأيزوبروبانول في حاوية التجميد ، واحتفظ به عند 4 درجات مئوية لمدة 15-30 دقيقة قبل بدء التجربة.
  2. قم بتجميد قطرة واحدة سعة 50 ميكرولتر من BMM في تبريد واحد. تابع التفكك الميكانيكي العضوي كما هو موضح في الخطوة 4.3. بعد التفكك ، أعد تعليق ركام الخلية في 500 ميكرولتر من وسط التجميد البارد ، ثم انقل المعلق برفق إلى cryovials ، واحتفظ بها في حاوية التجميد.
  3. انقل حاوية تجميد الخلية إلى -80 درجة مئوية ، وبعد 24 ساعة ، انقل المبردات إلى النيتروجين السائل للتخزين طويل الأجل.

7. إذابة eHEPOs

  1. قم بتسخين حمام مائي مسبقا و Ad-DMEM / F12 إلى 37 درجة مئوية.
  2. قم بإزالة قارورة واحدة من eHEPOs من تخزين النيتروجين السائل باستخدام قفازات مبردة. ضع القارورة في حمام مائي 37 درجة مئوية حتى تذوب بلورات الثلج. انقل معلق الخلية إلى أنبوب مخروطي سعة 15 مل ، وجهاز طرد مركزي عند 200 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية.
  3. استنشق المادة الطافية ، وانتقل إلى بذر eHEPOs كما هو موضح في القسم 4. قم بتراكب قطرة BMM بوسط التمدد المكمل ب 10 ميكرومتر Y-27632 (انظر جدول المواد). قم بتحديث الوسط كل 3 أيام ، وقم بإزالة مثبط ROCK بعد 3 أيام.

النتائج

أولا, الخلايا الليفية البشرية أو خلايا الدم المحيطية أحادية النواة (PBMC) تم استزراعها وتحويلها إلى iPSCs عن طريق إعادة البرمجة العرضية. كان مصل خروج المغلوب الطازج ضروريا للحصول على iPSCs صحية. ثم, تم زرع iPSCs في لوحات الاستزراع المغلفة ب BMM مع 50٪-60٪ التقاء. وجود مستعمرات iPSC ص...

Discussion

يصف البروتوكول الحالي طريقة شاملة لتوليد, توسيع, وتجميد/ذوبان العضيات الكبدية بدءا من iPSCs. يغطي هذا البروتوكول جميع الخطوات, بما في ذلك زراعة iPSCs على المغذي والثقافة الخالية من المغذي, تمايز الأديم الباطن ثنائي الأبعاد, إثراء الخلايا السلفية مع FACS وتشكيل العضوية, وتوليد ا...

Disclosures

المؤلفون ليس لديهم ما يكشفون عنه. ليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح للإعلان عنه. إسراء إردال هي المؤسس المشارك لشركة ORGANO-ID للتكنولوجيا الحيوية.

Acknowledgements

تم دعم هذا البحث من قبل مجلس البحث العلمي والتكنولوجي التركي (TÜBİTAK) من خلال المشروعين SBAG-115S465 و SBAG-213S182. تم إنشاء الشكل 1 باستخدام BioRender.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
15 mL conical centrifuge tubesCorning430052
37 °C water bathNüve210.NB9
37 °C, 5 % CO2 incubatorMemmertINCO 153
50 mL conical centrifuge tubesCorning430290
70 µm and 40 µm Cell strainerFalcon352350/ 352340
70% EthanolSigma1009832511
A1ATAbcamab166610Dilution: 1/500 (IF), 1/50 (IHC)
A-83.01 (TGF-β inhibitor)Tocris Biosciene2939
AcetoneIsolab9,01,026
Adhesive Microscope SlideHistobondC981040
Advanced DMEM-F12Gibco12634-010
AFPAbcamab3980Dilution: 1/25 (IHC)
AgarEMS10200
ALBAbcamab10241Dilution: 1/100 (IF), 1/20 (IHC)
Alexa Flour 488 (Mouse)InvitrogenA11001Dilution: 1/1000 (IF)
Alexa Flour 488 (Rabbit)InvitrogenA110034Dilution: 1/1000 (IF)
Alexa Flour 594 (Mouse)InvitrogenA11005Dilution: 1/1000 (IF)
Alexa flour 594 (Rabbit) InvitrogenA11037Dilution: 1/1000 (IF)
Ammonia Assay KitSigma-AldrichMAK-310
Ammonium clorideSanta Cruzsc-202936
B27 Supplement 50xGibco12587010
Base moldSakura4216
b-FGFPeprotech100-18B
Biosafety, CLASS II,SAFETY CABINETThermoSAFE 2020
Calibrated pipettesGilsonF167380
CentrifugeEppendorf5702
Cholylglycylamido-fluoresceinCorning451041
Citrate Buffer pH 6.0Bio-optica15-M103
CK-18Santa Cruzsc-51582Dilution: 1/100 (IF), 1/20 (IHC)
CK-19Santa Cruzsc-6278Dilution: 1/100 (IF), 1/20 (IHC)
Confocal MicroscopeZeissLSM880
Cryogenic handling gloves and eye protectionCryokit5274
CryostatLeicaCM 1950
Cryovial tubesCorning430659
DABRoche11718096001
DAPTSigma-Aldricha5942
DexamethasoneSigma-AldrichD4902
Dispase Stem Cell Technologies7923
DMEM F12Gibco31330038
E-CADSanta Cruzsc-8426Dilution: 1/100 (IF), 1/20 (IHC)
EDTAInvitrogen15575-020
Electron MicroscopeZeissSigma500
ELISA kitFortis life sciences bethylE88-129
Embed 812 Embedding KitEMS14121
EntellanMerck107961
Eosin Y %1Sigma-AldrichHT110332
EpCAMMiltenyi Biotec130-059-901Dilution: 1/11 (FACS)
EthanolMerck1,00,98,32,511
Fetal Bovine Serum (FBS)Gibco26010066
Forskolin (FSK)Tocris Biosciene1099
Freezing container (Mr. Frosty)Thermo5100-0001
Freezing MediumGibco12648010
Glass Pasteur pipetteIsolab084.01.001
Glutamax 100xGibco35050-068
Gluteraldehyde %25, EM gradeEMS16210-1L
Goat Anti-Mouse HRPThermo Fisher62-6520Dilution: 1/1000 (IHC)
Goat Anti-Rabbit HRPThermo Fisher31460Dilution: 1/1000 (IHC)
Goat SerumGibco162-10-072
H2O2Merck107209
HematoxylinMilliporeHX86017674
HEPES, 1 MGibco15630-056
HNF-4αAbcamab55223Dilution: 1/50 (IHC)
Ice and dry icehomemadehomemade
Incubator (65 °C)NüveEN 400
IsopropanolSigma-Aldrich24137
Leu15 Gastrin I humanSigma-AldrichG9145
LuminometerBerthold TechLB 960
Master mix Applied Biosystems43676659
Matrigel matrix, hESC-QualifiedCorning354277
Matrigel matrix, phenol-red-freeCorning356231
MethanolMerck179337
Microcentrifuge tubesAxygen321-02-501
MicroscopeZeissAXIO VERT A1
Microtome bladeFeatherS35, C35
mTeSR1Stem Cell Technologiessc-05850
Multi well suspension culture platesSarstedt83,39,21,500
N2 supplement 100xGibco17502048
N-AcetylcysteineSigma-AldrichA9165
Neutral Buffered Formalin %10TekkimTK.60161.05001
NicotinamideSigma-AldrichN0636
Non-essential Amino Acide (NEAA)Gibco11140050
OCTTissue-Tek4583
Osmium tetroxideEMS19110
P450-Glo Assays kit PromegaV9001
Pap-penSigmaZ377821-1EA
ParaffinTekkimTK.200661.01002
PAS stain kitAbcamab150680
PBSLonzabe17-516
Penicillin/StreptomycinGibco15630-056
Phosphotungustic acidTed Pella19402
Pipette aidAxygenMotopet-1
Plate reader varioskan flash Thermo5250040
Prolong Antifade MountantInvitrogenP36980
Propylene Oxide, EM gradeEMS20401
Real Time PCR systemApplied Biosystems7500 Fast 
Recombinant human Activin AR&D338-Ac-050
Recombinant human BMP7Peprotech120-03
Recombinant human EGFPeprotechaf-100-15
Recombinant human FGF10Peprotech100-26
Recombinant human FGF19Peprotech100-32
Recombinant human HGFPeprotech100-39
Rho kinase inhibitor, Y-27632 dihydrochlorideSigma-AldrichY0503
RNase/DNase free 1.5 mL tubeAxygen31108101
RNase/DNase free filter tipsSarstedt703031255
Rotary MicrotomeLeicaRM 2245
RPMI 1640 MediumGibco61870010
Rspo1-conditioned mediumHomemade
Slide masterBio-optica15-MEQ001
Sorenson’s Phosphate BufferEMS11600-10
SpinnerThermoMY SPIN 6
Sterile serological pipettesFalcon357543
Tissue CasetteLeica3802240
TrimmerLeicaEM TRIM2
Triton X-100Thermo Scientific28314
TrypLE Express EnzymeGibco12605010
Trypsin-EDTAGibco25200-056
UltramicrotomeLeicaEM UC7
UranylacetateEMS22400
VortexThermo88880018
Wnt Surrogate-Fc Fusion ProteinImmunoPreciseN001
XyleneSigma 16446
ZO-1Invitrogen40-2200Dilution: 1/400 (IF)

References

  1. Huch, M., Koo, B. K. Modeling mouse and human development using organoid cultures. Development. 142 (18), 3113-3125 (2015).
  2. Marsee, A., et al. Building consensus on definition and nomenclature of hepatic, pancreatic, and biliary organoids. Cell Stem Cell. 28 (5), 816-832 (2021).
  3. Takebe, T., et al. Vascularized and functional human liver from an iPSC-derived organ bud transplant. Nature. 499 (7459), 481-484 (2013).
  4. Takebe, T., et al. Massive and reproducible production of liver buds entirely from human pluripotent stem cells. Cell Reports. 21 (10), 2661-2670 (2017).
  5. Huch, M., et al. Long-term culture of genome-stable bipotent stem cells from adult human liver. Cell. 160 (1-2), 299-312 (2015).
  6. Guan, Y., et al. Human hepatic organoids for the analysis of human genetic diseases. JCI Insight. 2 (17), e94954 (2017).
  7. Ramli, M. N. B., et al. Human pluripotent stem cell-derived organoids as models of liver disease. Gastroenterology. 159 (4), 1471-1486 (2020).
  8. Strober, W. Trypan blue exclusion test of cell viability. Current Protocols in Immunology. 21 (1), 3 (1997).
  9. Feldman, A. T., Wolfe, D. Tissue processing and hematoxylin and eosin staining. Histopathology: Methods and Protocols. 1180, 31-43 (2014).
  10. Akbari, S., et al. long-term culture of endoderm-derived hepatic organoids for disease modeling. Stem Cell Reports. 13 (4), 627-641 (2019).
  11. Meisenheimer, P. L., et al. Proluciferin acetals as bioluminogenic substrates for cytochrome P450 activity and probes for CYP3A inhibition. Drug Metabolism and Disposition. 39 (12), 2403-2410 (2011).
  12. Cali, J. J., Ma, D., Wood, M. G., Meisenheimer, P. L., Klaubert, D. H. Bioluminescent assays for ADME evaluation: dialing in CYP selectivity with luminogenic substrates. Expert Opinion on Drug Metabolism & Toxicology. 8 (9), 1115-1130 (2012).
  13. Cali, J. J., et al. Luminogenic cytochrome P450 assays. Expert Opinion on Drug Metabolism & Toxicology. 2 (4), 629-645 (2006).
  14. Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2−ΔΔCT method. Methods. 25 (4), 402-408 (2001).
  15. Duval, K., et al. Modeling physiological events in 2D vs. 3D cell culture. Physiology. 32 (4), 266-277 (2017).
  16. Rowe, R. G., Daley, G. Q. Induced pluripotent stem cells in disease modelling and drug discovery. Nature Reviews Genetics. 20 (7), 377-388 (2019).
  17. Akbari, S., Arslan, N., Senturk, S., Erdal, E. Next-generation liver medicine using organoid models. Frontiers in Cell Development and Biology. 7, 345 (2019).
  18. Michalopoulos, G. K., Bowen, W. C., Mule, K., Stolz, D. B. Histological organization in hepatocyte organoid cultures. American Journal of Pathology. 159 (5), 1877-1887 (2001).
  19. Shinozawa, T., et al. High-fidelity drug-induced liver injury screen using human pluripotent stem cell-derived organoids. Gastroenterology. 160 (3), 831-846 (2021).
  20. Wu, F., et al. Generation of hepatobiliary organoids from human induced pluripotent stem cells. Journal of Hepatology. 70 (6), 1145-1158 (2019).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

219

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved