功能性内胚层肝类器官的产生

摘要

该协议描述了快速且可重复的内胚层肝类器官 （eHEPO） 的产生。使用该方案，eHEPO 可以在 2 周内生产并长期扩展（超过 1 年），而不会失去其差异化和功能。

摘要

类器官技术使我们能够 在体外产生各种类似人体器官的微型结构，例如肝脏、大脑和肠道。类器官模型的显著进步最近为疾病建模、发育生物学和药物发现方面的各种应用开辟了一个新的实验时代。成体干细胞或诱导多能干细胞 （iPSC） 衍生的肝脏类器官控制肝细胞的产生，用于各种应用。在这里，我们提出了一种从多能干细胞生成肝类器官的稳健且可重复的方案。该方案适用于健康和患者来源的细胞。为了实现 3D 内胚层来源的肝类器官 （eHEPOs），首先将 iPSCs 直接分化为内胚层细胞，然后使用富含 FACS 的 EpCAM 阳性 （EpCAM+） 细胞通过扩增培养基建立肝脏类器官。我们提供了一种快速有效的方法，可在 2 周内生成肝脏类器官。生成的类器官模拟肝细胞的基本特性和功能，例如白蛋白分泌、糖原储存和细胞色素 P450 酶活性。除了肝脏特异性基因表达的相似性外，eHEPO 还包括极化上皮细胞，两者之间有胆汁小管。此外，eHEPO 可以长期（1 年）扩增和连续传代，而不会失去分化为成熟肝细胞的能力。因此，eHEPO 为产生功能性肝细胞提供了另一种来源。

引言

类器官是在 3 维培养条件下生长的微型器官样结构，模拟器官微环境，并包括器官发育本身的自我组织和自我更新所必需的内在因素。类器官可以来源于多能干细胞 （PSC） 或成体组织来源的细胞（干细胞或祖细胞）¹。尽管它们准确的器官样组织和与特定器官的功能相似性使其成为疾病建模的宝贵工具，但它们在培养标准化方面仍需要进一步改进。特别是，已经发布了几种用于生成肝脏类器官的方案，它们在复杂性和可重复性方面有所不同²。例如，Takebe 等人开发的肝芽类器官采用致密的多细胞结构形式，包含以下诱导多能干细胞 （iPSC）：肝内胚层祖细胞、人脐静脉内皮细胞 （HUVEC） 和间充质干细胞 （MSC）。然而，这些类器官不具有长期的自我更新能力 ^3,4。

从历史角度来看，Huch 等人首先报道了源自成人组织的人肝上皮类器官的产生，其中细胞极化和特化以复制天然上皮的各个方面⁵。然后，Guan 等人使用 iPSC 衍生的肝脏类器官对 Alagille 综合征 （ALGS） 进行建模，这是一种与肝脏内胆管缩小相关的罕见遗传疾病⁶。这两种类器官都具有自我更新能力，可以获得成熟的肝细胞功能，例如胆汁和白蛋白分泌、糖原储存和肝脏特异性药物解毒。在最近的一项研究中，Ramli 等人介绍了一种 PSC 衍生的肝脏类器官模型，该模型包含极化肝细胞样细胞 （HLC） 之间的功能性胆小管网络，这些细胞将胆汁淤积药物排空到由胆管细胞样细胞 （CLC） 组成的胆囊囊中⁷。

本研究提出了一种用于生成 iPSC 衍生的内胚层肝类器官的独特培养物，称为 eHEPO。逐步描述了 iPSC 培养和分化为内胚层，并证明了来自富集的 EpCAM + 祖细胞的 eHEPO 的产生。最后，描述了 eHEPO 的功能和结构组织的表征，以及类器官的冷冻保存。

研究方案

与实验步骤相关的许可是从 Dokuz Eylul 大学医学院的当地临床研究伦理委员会（2013/25-4,2013 年 5 月 12 日;2016/30-29,2016 年 11 月 24 日）获得的。

1. 制备细胞培养溶液

1. 通过在层流罩中混合以下组分来制备内胚层分化培养基：1% B27、100 ng/mL 激活素 A、Wnt3a 或 30% wnt3a-CM 和 R-spo1 或 10% R-spo1-CM（参见 材料表）。
2. 准备具有以下成分的荧光激活细胞分选 （FACS） 缓冲液：PBS、1 mM EDTA、25 mM HEPES、1% FBS。
3. 制备扩增培养基 （EM）：1% N 2、1% B27、1.25 mM N-乙酰-L-半胱氨酸、50 ng/mL EGF、10% R-spo1 条件培养基、100 ng/mL FGF 10、10 mM 烟酰胺、5 μM A8301 和 10 μM 毛喉素 （FSK） 在高级 DMEM/F-12 中。添加 10 nM Y-27632 和 0.3 nM WNT3a（参见 材料表）。
   注意：将完全培养基在 2-8 °C 下最多保存 2 周。
4. 制备分化培养基 （DM）：1% N2、1% B27、10 nM 胃泌素、50 ng/mL EGF、100 ng/mL FGF 10、25 ng/mL HGF、500 nM A8301、10 μM DAPT、25 ng/mL BMP7 和 30 μM 地塞米松在 Ad-DMEM/F-12 中（参见 材料表）。
   注意：将完全培养基在 2-8 °C 下保存 2 周。

2. 解冻无饲养层板上的 iPSC

1. 用基底膜基质 （BMM） 包被细胞培养板。
   1. 将一小瓶等分试样的 BMM 在冰上解冻过夜或至少在开始涂层前 2 小时解冻。将 6 mL 冷 DMEM/F-12 加入 15 mL 锥形管中，立即加入 80 μL 解冻的 BMM，并充分混合。
   2. 使用经组织培养处理的孔板，用 BMM 溶液包被培养板，然后分配以覆盖孔板表面。使用前将板在 37 °C 培养箱中孵育至少 1 小时。孵育时间后，丢弃 BMM 溶液，并立即添加 iPSC 特异性培养基。
2. 使用低温手套从液氮储存中取出一小瓶 iPSC。立即将样品瓶放在浮动管架上，并将样品架浸入 37 °C 水浴中，直到冰晶融化。
   1. 从水浴中取出样品瓶，然后用 70% 乙醇彻底擦拭其外部。然后，将其放入层流罩中。在此步骤中快速作很重要。
   2. 在无菌条件下，在层流罩中，将解冻的细胞转移到含有 5 mL iPSC 特异性培养基的无菌 15 mL 锥形管中。
      1. 将细胞在 200 × g （室温下）离心 3 分钟。缓慢弃去上清液，用 5 mL 血清移液管轻轻移液几次，将细胞重悬于 2 mL iPSC 特异性培养基中，然后将细胞接种到包被的孔上。
   3. 快速移动板以将细胞分散在整个孔表面。将板放入 37 °C、5% CO₂ 培养箱中孵育。
   4. 每天刷新培养基。

3. 内胚层分化

1. 如第 2 节所述，在分裂 iPSC 前 1 小时用 BMM 涂覆新孔板。
2. 在光学显微镜下控制 iPSC 的完整性和活力。未分化的 iPSC 是具有大细胞核、小细胞质和具有明显边缘的致密细胞集落的细胞。
   注：有两种用于分裂细胞的酶溶液。在使用分散酶 （1 U/mL） 的情况下，必须去除分化细胞的区域。如果使用特定的酶，则无需通过刮擦或抽吸手动区分区域。将特定酶保存在室温下。
3. 将 iPSC 培养基加热至室温。吸出培养基，并用 DMEM/F-12 或 D-PBS 冲洗 iPSC 板。将 1 mL 特异性酶加入 6 孔板的一个孔中，在室温下孵育 1 分钟，然后吸出特异性酶，并在 37 °C 下孵育板 5-7 分钟。
   注：应根据所使用的 iPSC 细胞系优化酶的最佳处理时间。
4. 孵育时间后，加入 1 mL 预热的 iPSC 培养基，轻轻敲击板的侧面，从板表面分离未分化的集落聚集体。聚集体的最佳大小为 50-200 μM。
   1. 使用 5 mL 血清移液管，轻轻混合悬浮液，然后将所需密度的细胞悬液接种到 BMM 包被的孔上。将细胞在 37 °C 下孵育 3-5 天以达到 70% 的汇合度。
5. 在开始分化之前，用内胚层培养基替换 iPSC 培养基（步骤 1.1）。每天刷新培养基。在分化步骤中控制细胞的形态变化。分化后细胞间相互作用开始出现，细胞形成尖刺形状。

4. eHEPO 建立

1. 用 FACS 富集 EpCAM + 内胚层细胞。
   1. 在细胞分选实验之前，在冰上解冻一小瓶类器官特异性 BMM（参见 材料表）。在细胞分选实验之前，将组织培养板在 37 °C 下预热过夜。
   2. 用 1x PBS 冲洗内胚层细胞。加入 300 μL 胰蛋白酶，并在培养箱中孵育 5 分钟。加入 3 mL 冷 DMEM-F12，用 1,000 μL 滤嘴吸液以生成单细胞。
   3. 将细胞悬液收集在 15 mL 锥形管中。将细胞以 300 x g （室温）离心 5 分钟。弃去上清液，用 10 mL FACS 缓冲液洗涤沉淀（步骤 1.2）。
   4. 要制备单细胞悬液，首先用 100 μm 筛网过滤细胞，然后用 40 μm 筛网过滤。
      注意：在使用过滤器之前，请用 1 mL FACS 缓冲液冲洗过滤器表面。
   5. 将细胞悬液以 300 x g （室温）离心 5 分钟。用台盼蓝⁸ 计数细胞数。
   6. 染色比例为 1：11。例如，用 105 μL FACS 缓冲液重悬 15 x 10⁶ 个细胞，并添加 45 μL 的 FcR 和 15 μL 的 EpCAM（参见 材料表）。将细胞在 40 °C 下孵育 10 分钟，并保护试管避光。孵育后，加入 500 μL FACS 缓冲液洗涤细胞悬液。将细胞以 300 x g （室温）离心 5 分钟。
   7. 将沉淀重悬于 500 μL FACS 缓冲液中。向细胞悬液中加入 DAPI（0.5 μM/1 mL，终浓度）以定量死细胞。将细胞保持在冰上，直到开始细胞分选步骤。
2. 将 EpCAM 和分选的细胞嵌入 BMM 中。细胞分选后，将细胞以 300 x g 离心 5 分钟以提取 FACS 缓冲液。去除上清液，并将 3,000-5,000 个细胞重悬于 20 μL BMM 中。
   1. 通过向每个 48 孔板的中心添加一滴 BMM 来接种细胞。将细胞在 37 °C 下孵育 2 分钟，直到 BMM 凝固。小心地将板倒过来，并在培养箱中再放置 10 分钟。用扩增培养基覆盖液滴（48 孔板每孔 250 μL）。
   2. 每 3 天刷新一次类器官培养基。在第 10-11 天，类器官大小将大于 100 μm。
3. 进行 eHEPO 机械解离和分化。
   1. 以 1：4 的比例分割每个类器官液滴。要进行拆分，丢弃类器官培养基并加入 500 μL 冷 Ad-DMEM/F12。使用 1,000 μL 过滤嘴，用力移液 BMM 液滴。
   2. 将最多 10 个 BMM 液滴收集到 15 mL 锥形管中，并加入 5 mL 冷 Ad-DMEM/F12。将试管在冰上放置 3-5 分钟。
   3. 将细胞在 4 °C 下以 200 x g 离心 5 分钟。 丢弃上清液，直到剩余 1 mL。使用 200 μL 过滤吸头用力吸取细胞沉淀 30-40 次。在光学显微镜下检查类器官大小，小心避免形成单细胞悬液。
   4. 机械解离后，加入 5 mL 冷 Ad-DMEM/F12，并在 4 °C 下以 200 x g 离心细胞 5 分钟。
   5. 弃去上清液，将悬浮液保持在冰上，直到接种细胞。
   6. 接种 50 μL BMM 液滴（对于 24 孔板，每孔含有 35 μL BMM + 15 μL 细胞和 Ad-DMEM/F-12）。
   7. 将 BMP7（25 ng/mL，参见 材料表）添加到 EM 培养基中，并培养 3 天。第 4 天，用分化培养基替换培养基（步骤 1.4）。每 3 天刷新一次培养基，并将细胞培养至少 14 天。

5. eHEPO 的表征

1. 进行组织学检查。
   1. 进行石蜡包埋。
      1. 去除培养基，加入 1-2 mL 冷的 1x PBS，然后将 BMM 轻轻重悬于冷的 1x PBS 中。小心地将类器官转移到 15 mL 离心管中。让类器官在重力下沉降，然后小心吸出 PBS。重复洗涤步骤三次。
      2. 向类器官中加入 10 mL 新鲜固定剂（10% 中性缓冲福尔马林），并孵育 30 分钟。轻轻去除固定剂，加入 10 mL 冷的 1x PBS，孵育 10 分钟。小心吸出 PBS。
      3. 在室温下，在溶解在 96% 乙醇中的 0.5% 伊红（参见 材料表）溶液中对类器官染色 30 分钟。
         注：如果要进行免疫染色，请勿使用伊红染色。
      4. 通过在室温下使用酒精系列（70% 乙醇、80% 乙醇和 96% 乙醇）洗涤 5 分钟来脱水类器官。将类器官浸泡在 100% 乙醇（无水乙醇）中 30 分钟。
      5. 使用二甲苯（参见 材料表）清除类器官 3 次，每次 20 分钟⁹.
         注意：二甲苯是一种剧毒且易燃的化合物，因此请使用适当的安全装备进行处理。避免大量工作。
      6. 使用塑料移液管将类器官轻轻转移到带有熔融石蜡的预热金属基础模具（参见 材料表）中。将类器官在65°C培养箱中熔融石蜡中保存3次，每次30分钟（每次更换时用新的新鲜熔化石蜡替换）。
      7. 然后，将类器官嵌入新的新鲜石蜡中。将类器官轻轻移动到金属基础模具的中间。
         注：对于此步骤，快速工作至关重要，因为石蜡在室温下会凝固。
      8. 将金属基模转移到冷板上 10-20 秒以稳定类器官。然后，倒入熔融石蜡以覆盖金属基模，并在金属基模顶部添加纸巾盒（见 材料表）进行标记。确保模具中有足够的石蜡，然后让它们在冷板上凝固。拆下金属基模。
      9. 使用标准切片机切割 5-7 μm 厚的切片（参见 材料表）。将连续石蜡切片放在粘性显微镜载玻片上。让载玻片干燥过夜。
   2. 进行苏木精和伊红 （H&E） 和高碘酸 Shiff （PAS） 染色。
      1. 将石蜡包埋的载玻片在 63 °C 培养箱中过夜以进行脱蜡。第二天，将载玻片放入二甲苯中 3 次，每次 20 分钟。不要让载玻片变干。
      2. 用分级醇系列（100% 乙醇、96% 乙醇、80% 乙醇和 70% 乙醇）对载玻片再水化 2 分钟。然后，将载玻片放入蒸馏水中 1 分钟。
      3. 对于 H&E 染色，请执行以下步骤。
      4. 将载玻片放入苏木精溶液中 5 分钟。用流动的自来水冲洗玻片 5 分钟。用 1% 伊红 Y 溶液（参见 材料表）对载玻片染色 10 秒。
      5. 用一系列 80% 乙醇、96% 乙醇和两次 100% 乙醇变化脱水切片，每次 30 秒。
      6. 将载玻片放入二甲苯中清除 3 次，每次 20 分钟。
      7. 用安装介质小心地将盖玻片安装到载玻片上的切片上（参见 材料表）。确保没有气泡。
      8. 对于 PAS 染色，执行步骤 5.1.2.4-5.1.2.6，然后执行 Akbari 等人 ¹⁰ 报告的 PAS 染色程序。然后用封固剂小心地将盖玻片安装到载玻片上的切片上。确保没有气泡。
   3. 进行免疫组织化学 （IHC） 染色。
      1. 在 H&E 染色方案中执行步骤 5.1.2.1 和步骤 5.1.2.2。
      2. 在微波炉中将载玻片放入 0.1 M 柠檬酸盐缓冲液 （pH 6.0） 中加热 10 分钟。
      3. 保持直到载玻片冷却至室温（约 20 分钟），然后用蒸馏水冲洗载玻片。
      4. 将玻片放入新鲜制备的 3% H₂O₂ 甲醇溶液中，在室温下放置 10 分钟。然后，用蒸馏水冲洗载玻片 1 分钟。
      5. 通过在室温下将切片与封闭溶液（2% 血清 + 0.1% Triton X-100 + 0.1% BSA）孵育 1 小时来阻断引物抗体的非特异性结合。
      6. 轻轻去除封闭溶液，并加入在 4 °C 封闭溶液中稀释的一抗（E-CAD、ALB、EpCAM、A1AT、CK19）（参见 材料表）过夜。
      7. 第二天，仔细冲洗载玻片两次，持续 10 分钟 （.
      8. 在室温下加入二抗（山羊抗兔、山羊抗小鼠）（参见 材料表）1 小时，然后用蒸馏水冲洗载玻片 5 分钟（三次）。
      9. 准备 3'3 二氨基联苯胺四盐酸盐（DAB，参见 材料表）溶液（必须在使用前 30 分钟准备好）。
      10. 将 DAB 溶液涂抹在载玻片上 1-5 分钟，然后用蒸馏水冲洗载玻片 5 分钟（3 次）。
      11. 用苏木精对切片复染 1 分钟，然后在流动的自来水中冲洗载玻片 1 分钟。
      12. 用一系列 80% 乙醇、96% 乙醇和两次 100% 乙醇变化脱水切片，每次 30 秒。
      13. 将载玻片放入二甲苯中 20 分钟（3 次）。
      14. 用安装介质小心地将盖玻片安装到载玻片上的切片上。确保没有气泡。
   4. 执行 OCT 嵌入。
      1. 使用新鲜制备的冷 4% PFA 在 4 °C 下固定类器官过夜。 小心地取出固定剂，并用 1x PBS 洗涤 15 分钟（3 次）。
      2. 使用蒸馏水制备 30% 蔗糖溶液 （w/v）。去除 1x PBS，并加入 30% 蔗糖以使类器官脱水。
      3. 将类器官在 4 °C 下孵育过夜。最初，大多数组织会漂浮在 30% 蔗糖中，并在渗透完成后下沉。此时，可以认为冷冻保护已完成。
      4. 为包埋过程准备干冰或液氮。
      5. 将两到三滴 OCT（参见 材料表）放入塑料低温模具中。将类器官以正确的切割方向放在顶部。
      6. 缓慢而小心地将 OCT 倒在类器官的顶部。小心避免气泡。让类器官在室温下在重力下沉降 10-15 分钟。
      7. 在冷冻步骤之前标记冷冻模具。将模具放在干冰或液氮上快速冷冻。将冷冻模具转移到 -80 °C，并将它们储存在那里直到切片过程。
   5. 进行免疫荧光 （IF） 染色。
      1. 进行冰冻切片染色。
         1. 在室温下将冷冻切片风干 20-30 分钟。用蒸馏水将载玻片再水化 5 分钟（3 次）。使用巴氏笔用疏水屏障包围组织（参见 材料表）。
         2. 每个切片添加 200-300 μL 0.2% Triton X-100。小心洗涤载玻片 5 分钟（3 次）。确保在洗涤步骤中切片不会从载玻片上脱落。
         3. 在室温下加入封闭溶液（2% 血清 + 0.1% Triton X-100 + 0.1% BSA）1 小时。
         4. 轻轻去除封闭溶液，加入在封闭溶液中稀释的一抗（E-CAD、A1AT、HNF4α）（参见 材料表），并将载玻片在 4 °C 下孵育过夜。
         5. 在室温下加入合适的二抗（Alexa Fluor 488 [小鼠]、Alexa Fluor 594 [小鼠]、Alexa Fluor 594 [兔]）1 小时（参见 材料表），并在蒸馏水中冲洗载玻片 5 分钟（3 次）。
         6. 每个切片加入 100-200 μL Hoechst 或 DAPI 核染料 3 分钟，用 1x PBS 洗涤载玻片，然后重复洗涤步骤 3 次。
         7. 使用防褪色封固剂将盖玻片安装到载玻片上的切片上。将载玻片在 4 °C 下放置过夜，并在成像过程之前避光保存它们。
      2. 进行整体安装染色。
         1. 执行石蜡包埋程序中的步骤 5.1.1.1 和步骤 5.1.1.2。
         2. 加入封闭溶液（0.1%-1% Triton X-100、1% DMSO、1% BSA 和 1% 山羊血清在 1x PBS 中，参见 材料表），并将类器官与封闭溶液在室温下孵育 2-3 小时。
         3. 轻轻去除封闭溶液，并加入在 4 °C 下在封闭溶液中稀释过夜的一抗（CK19、CK18、ZO-1、ALB）（参见 材料表）。
         4. 第二天，轻轻去除溶液，并加入 1x PBS。让类器官在重力下沉降长达 10 分钟。小心地取出溶液，然后重复洗涤步骤三次。
         5. 将类器官与二抗（Alexa Fluor 594 [小鼠]、Alexa Fluor 488 [兔]、Alexa Fluor 488 [小鼠]）在室温下孵育至少 1 小时。小心地取出溶液，然后重复洗涤步骤四次。
         6. 对于核染色，将类器官与 Hoechst 或 DAPI 核染料孵育 10 分钟。通过添加 1x PBS 洗涤类器官，并重复洗涤步骤三次。让类器官沉降到管的底部。
         7. 使用塑料巴斯德移液器，从管中取出类器官，并将它们放在载玻片上。确保在对类器官的损害最小的情况下进行。
         8. 去除多余的 PBS，并加入一定量（一到两滴）封固剂。使用封固剂小心地将盖玻片安装到载玻片上的类器官上。将载玻片保持在 4 °C，并在成像过程之前避光保存它们。
2. 进行电子显微镜检查。
   1. 使用 Karnovsky 溶液（2.5% 缓冲戊二醛 + 2% 多聚甲醛在 0.1 M 磷酸钠缓冲液 [Sorensen 缓冲液]中，pH 7.4，参见 材料表）在 4 °C 下固定类器官过夜。
   2. 用 0.1 M Sorenson 缓冲液 + 0.1 M 蔗糖 （1：1） 洗涤类器官 15 分钟（3 次）。然后，将类器官后固定在 2% 磷酸钠缓冲的四氧化锇（参见 材料表）中 90 分钟。
   3. 将类器官包埋在 2% 温琼脂中。使用柳叶刀切掉类器官周围多余的琼脂。在 Sorensen 缓冲液中洗涤类器官 15 分钟（3 次）。
   4. 使用 50% 丙酮脱水 15 分钟（两次）。
   5. 在 4 °C 下使用 70% 丙酮 + 1% 磷钨酸 + 0.5% 乙酸铀酰（参见 材料表）进行过夜对比。
   6. 第二天，使用丙酮系列（80% 丙酮、90% 丙酮、96% 丙酮和 100% 丙酮）脱水类器官 15 分钟（两次）。
   7. 使用环氧丙烷清除类器官 10 分钟（两次），然后将类器官在室温下放入 epon：环氧丙烷（参见 材料表）混合物中 30 分钟。
   8. 向类器官中加入新的 epon 溶液，并在 4 °C 下孵育过夜。
   9. 第二天，将新的新鲜 epon 溶液放入基模中，然后嵌入类器官。放入 65 °C 培养箱中 48 小时进行聚合。
   10. 用设置为50-100 nm切片厚度的超薄切片机切割类器官内膜块。将部分放入 formvar 覆盖的网格中。
3. 测量 CYP3A4 酶活性。
   1. 按照制造商的说明使用市售试剂盒（参见 材料表）测量 CYP 活性。
      注意：CYP 酶将底物转化为可检测的中间产物 11,12,13。有两种选择（细胞裂解和非裂解）可用于测量 CYP 酶活性。该试剂盒提供了分析化合物处理后基础 CYP 活性和诱导 CYP 活性的应用程序。
   2. 一式三份运行实验。用光度计读取发光，并计算信号。为了正常化，用胰蛋白酶消化类器官，并计算细胞数。
4. 进行人白蛋白定量。
   1. 在 ELISA 检测前 24 小时用新鲜培养基替换细胞培养基。孵育 24 小时后，收集细胞培养基 （300-500 μL），并以 500 x g （4 °C） 离心 2 分钟以去除细胞碎片和颗粒。分装上清液，并将样品储存在 -80 °C（长达 3 个月）。
   2. 一式两份运行标准品和样品。成熟的类器官将白蛋白分泌到培养基中;用 ELISA 定量试剂盒定量该白蛋白（参见 材料表）。停止溶液添加后 30 分钟内，用 ELISA 读板器在 450 nm 处测量吸光度。胰蛋白酶消化类器官，并计算要标准化的细胞数量。
5. 进行氨消除测定。
   1. 按照制造商的说明进行氨消除测定（参见 材料表）。简而言之，向培养基中加入 1.5 mM NH₄Cl，并孵育 24 小时。
   2. 孵育后，用氨测定试剂盒测定氨浓度（参见 材料表）。使用多功能多板读数仪计算测量值，并将值标准化为细胞数。
6. 进行胆基甘氨酰胺-荧光素 （CLF） 测定。
   1. 简而言之，用 10 μmol/L CLF 处理类器官（参见 材料表），并在 37 °C 培养箱中孵育 1 小时。孵育后，用 1x PBS 洗涤类器官。使用荧光显微镜进行成像。
7. 进行基因表达分析。
   1. 按照 RNeasy 试剂盒（参见 材料表）的说明从 eHEPO 中分离总 RNA。
   2. 按照制造商的说明，使用市售预混液（参见 材料表）构建 PCR 反应。为每个引物组制备 PCR 混合物后，将每个样品的 10 μL 放入 96 孔 qPCR 板中（表 1）。
   3. 用胶粘剂密封剂密封板，然后在室温下以 1,000 x g 离心板 2 分钟。将板加载到 PCR 机中。将相对基因表达标准化为内部对照（RPL41， 表 1），并使用 2-ΔΔCt 方法 ¹⁴ 进行分析。

6. eHEPO 的冷冻保存

1. 用耐氮标记物标记冻存管。检查冷冻容器的异丙醇液位，并在开始实验前将其在 4 °C 下保持 15-30 分钟。
2. 在一个冻存管中冷冻一个 50 μL BMM 液滴。按照步骤 4.3 中的说明进行类器官机械解离。解离后，将细胞聚集体重悬于 500 μL 冷冻存培养基中，然后轻轻将悬液转移到冻存管中，并保存在冻存管中。
3. 将细胞冷冻容器转移至 -80 °C，24 小时后，将冻存管转移到液氮中长期储存。

7. eHEPO 的解冻

1. 预热水浴和 Ad-DMEM/F12 至 37 °C。
2. 使用低温手套从液氮储存中取出一小瓶 eHEPO。将样品瓶置于 37 °C 水浴中，直到冰晶融化。将细胞悬液转移至 15 mL 锥形管中，并在 4°C 下以 200 x g 离心 5 分钟。
3. 吸出上清液，然后按照第 4 节所述继续接种 eHEPO。用补充有 10 μM Y-27632 的扩增培养基覆盖 BMM 液滴（参见 材料表）。每 3 天刷新一次培养基，3 天后去除 ROCK 抑制剂。

结果

首先，培养人成纤维细胞或外周血单核细胞 （PBMC） 细胞， 并通过 游离型重编程转化为 iPSC。新鲜的基因敲除血清对于获得健康的 iPSC 至关重要。然后，将 iPSC 接种到 BMM 包被的培养板中，汇合度为 50%-60%。具有小/中等大小的 iPSC 集落提高了分化效率。然后，用含有激活素 A 、 Wnt3a 和 R-spo1 因子的培养基将 iPSCs 分化为最终内胚层 5 d。在分化过程中，细胞的数量和?...

讨论

本方案描述了一种从 iPSC 开始生成、扩增和冷冻/解冻肝脏类器官的综合方法。该方案涵盖了所有步骤，包括在饲养层和无饲养层培养物上培养 iPSC、二维内胚层分化、用 FACS 和类器官形成富集祖细胞，以及产生功能获得性的类器官。此外，还提供了验证和表征类器官的详细说明。成熟和功能肝细胞广泛应用的主要障碍是原代肝细胞来源有限、无法长期扩增肝细胞以及细胞...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
15 mL conical centrifuge tubes	Corning	430052
37 °C water bath	Nüve	210.NB9
37 °C, 5 % CO2 incubator	Memmert	INCO 153
50 mL conical centrifuge tubes	Corning	430290
70 µm and 40 µm Cell strainer	Falcon	352350/ 352340
70% Ethanol	Sigma	1009832511
A1AT	Abcam	ab166610	Dilution: 1/500 (IF), 1/50 (IHC)
A-83.01 (TGF-β inhibitor)	Tocris Biosciene	2939
Acetone	Isolab	9,01,026
Adhesive Microscope Slide	Histobond	C981040
Advanced DMEM-F12	Gibco	12634-010
AFP	Abcam	ab3980	Dilution: 1/25 (IHC)
Agar	EMS	10200
ALB	Abcam	ab10241	Dilution: 1/100 (IF), 1/20 (IHC)
Alexa Flour 488 (Mouse)	Invitrogen	A11001	Dilution: 1/1000 (IF)
Alexa Flour 488 (Rabbit)	Invitrogen	A110034	Dilution: 1/1000 (IF)
Alexa Flour 594 (Mouse)	Invitrogen	A11005	Dilution: 1/1000 (IF)
Alexa flour 594 (Rabbit)	Invitrogen	A11037	Dilution: 1/1000 (IF)
Ammonia Assay Kit	Sigma-Aldrich	MAK-310
Ammonium cloride	Santa Cruz	sc-202936
B27 Supplement 50x	Gibco	12587010
Base mold	Sakura	4216
b-FGF	Peprotech	100-18B
Biosafety, CLASS II,SAFETY CABINET	Thermo	SAFE 2020
Calibrated pipettes	Gilson	F167380
Centrifuge	Eppendorf	5702
Cholylglycylamido-fluorescein	Corning	451041
Citrate Buffer pH 6.0	Bio-optica	15-M103
CK-18	Santa Cruz	sc-51582	Dilution: 1/100 (IF), 1/20 (IHC)
CK-19	Santa Cruz	sc-6278	Dilution: 1/100 (IF), 1/20 (IHC)
Confocal Microscope	Zeiss	LSM880
Cryogenic handling gloves and eye protection	Cryokit	5274
Cryostat	Leica	CM 1950
Cryovial tubes	Corning	430659
DAB	Roche	11718096001
DAPT	Sigma-Aldrich	a5942
Dexamethasone	Sigma-Aldrich	D4902
Dispase	Stem Cell Technologies	7923
DMEM F12	Gibco	31330038
E-CAD	Santa Cruz	sc-8426	Dilution: 1/100 (IF), 1/20 (IHC)
EDTA	Invitrogen	15575-020
Electron Microscope	Zeiss	Sigma500
ELISA kit	Fortis life sciences bethyl	E88-129
Embed 812 Embedding Kit	EMS	14121
Entellan	Merck	107961
Eosin Y %1	Sigma-Aldrich	HT110332
EpCAM	Miltenyi Biotec	130-059-901	Dilution: 1/11 (FACS)
Ethanol	Merck	1,00,98,32,511
Fetal Bovine Serum (FBS)	Gibco	26010066
Forskolin (FSK)	Tocris Biosciene	1099
Freezing container (Mr. Frosty)	Thermo	5100-0001
Freezing Medium	Gibco	12648010
Glass Pasteur pipette	Isolab	084.01.001
Glutamax 100x	Gibco	35050-068
Gluteraldehyde %25, EM grade	EMS	16210-1L
Goat Anti-Mouse HRP	Thermo Fisher	62-6520	Dilution: 1/1000 (IHC)
Goat Anti-Rabbit HRP	Thermo Fisher	31460	Dilution: 1/1000 (IHC)
Goat Serum	Gibco	162-10-072
H2O2	Merck	107209
Hematoxylin	Millipore	HX86017674
HEPES, 1 M	Gibco	15630-056
HNF-4α	Abcam	ab55223	Dilution: 1/50 (IHC)
Ice and dry ice	homemade	homemade
Incubator (65 °C)	Nüve	EN 400
Isopropanol	Sigma-Aldrich	24137
Leu15 Gastrin I human	Sigma-Aldrich	G9145
Luminometer	Berthold Tech	LB 960
Master mix	Applied Biosystems	43676659
Matrigel matrix, hESC-Qualified	Corning	354277
Matrigel matrix, phenol-red-free	Corning	356231
Methanol	Merck	179337
Microcentrifuge tubes	Axygen	321-02-501
Microscope	Zeiss	AXIO VERT A1
Microtome blade	Feather	S35, C35
mTeSR1	Stem Cell Technologies	sc-05850
Multi well suspension culture plates	Sarstedt	83,39,21,500
N2 supplement 100x	Gibco	17502048
N-Acetylcysteine	Sigma-Aldrich	A9165
Neutral Buffered Formalin %10	Tekkim	TK.60161.05001
Nicotinamide	Sigma-Aldrich	N0636
Non-essential Amino Acide (NEAA)	Gibco	11140050
OCT	Tissue-Tek	4583
Osmium tetroxide	EMS	19110
P450-Glo Assays kit	Promega	V9001
Pap-pen	Sigma	Z377821-1EA
Paraffin	Tekkim	TK.200661.01002
PAS stain kit	Abcam	ab150680
PBS	Lonza	be17-516
Penicillin/Streptomycin	Gibco	15630-056
Phosphotungustic acid	Ted Pella	19402
Pipette aid	Axygen	Motopet-1
Plate reader varioskan flash	Thermo	5250040
Prolong Antifade Mountant	Invitrogen	P36980
Propylene Oxide, EM grade	EMS	20401
Real Time PCR system	Applied Biosystems	7500 Fast
Recombinant human Activin A	R&D	338-Ac-050
Recombinant human BMP7	Peprotech	120-03
Recombinant human EGF	Peprotech	af-100-15
Recombinant human FGF10	Peprotech	100-26
Recombinant human FGF19	Peprotech	100-32
Recombinant human HGF	Peprotech	100-39
Rho kinase inhibitor, Y-27632 dihydrochloride	Sigma-Aldrich	Y0503
RNase/DNase free 1.5 mL tube	Axygen	31108101
RNase/DNase free filter tips	Sarstedt	703031255
Rotary Microtome	Leica	RM 2245
RPMI 1640 Medium	Gibco	61870010
Rspo1-conditioned medium	Homemade
Slide master	Bio-optica	15-MEQ001
Sorenson’s Phosphate Buffer	EMS	11600-10
Spinner	Thermo	MY SPIN 6
Sterile serological pipettes	Falcon	357543
Tissue Casette	Leica	3802240
Trimmer	Leica	EM TRIM2
Triton X-100	Thermo Scientific	28314
TrypLE Express Enzyme	Gibco	12605010
Trypsin-EDTA	Gibco	25200-056
Ultramicrotome	Leica	EM UC7
Uranylacetate	EMS	22400
Vortex	Thermo	88880018
Wnt Surrogate-Fc Fusion Protein	ImmunoPrecise	N001
Xylene	Sigma	16446
ZO-1	Invitrogen	40-2200	Dilution: 1/400 (IF)