Geração de Organoides Hepáticos Endodérmicos Funcionais

Resumo

Este protocolo descreve a geração de organoides hepáticos endodérmicos rápidos e reprodutíveis (eHEPOs). Com este protocolo, os eHEPOs podem ser produzidos em 2 semanas e expandir a longo prazo (mais de 1 ano) sem perder sua diferenciação e funcionalidade.

Resumo

A tecnologia organoide nos permitiu gerar uma variedade de miniestruturas semelhantes a órgãos humanos, como fígado, cérebro e intestino, in vitro. Os notáveis avanços nos modelos organoides abriram recentemente uma nova era experimental para várias aplicações em modelagem de doenças, biologia do desenvolvimento e descoberta de medicamentos. Células-tronco adultas ou organoides hepáticos derivados de células-tronco pluripotentes induzidas (iPSC) governam a geração de hepatócitos a serem usados em diversas aplicações. Aqui, apresentamos um protocolo robusto e reprodutível para geração de organoides hepáticos a partir de células-tronco pluripotentes. Este protocolo é aplicável a células saudáveis e derivadas de pacientes. Para obter organoides hepáticos derivados de endoderme 3D (eHEPOs), as iPSCs foram diretamente diferenciadas primeiro em células endodérmicas e, em seguida, células EpCAM-positivas enriquecidas com FACS (EpCAM +) foram usadas para estabelecer organoides hepáticos usando o meio de expansão. Fornecemos um método rápido e eficiente para gerar organoides hepáticos em 2 semanas. Os organoides gerados imitam as propriedades e funções essenciais dos hepatócitos, como secreção de albumina, armazenamento de glicogênio e atividade da enzima citocromo P450. Além das semelhanças de expressão gênica específicas do fígado, os eHEPOs compreendem células epiteliais polarizadas com canalículos biliares entre eles. Além disso, os eHEPOs podem ser expandidos e passagens seriadas a longo prazo (1 ano) sem perder sua capacidade de se diferenciar em hepatócitos maduros. Assim, os eHEPOs fornecem uma fonte alternativa para produzir hepatócitos funcionais.

Introdução

Organoides são estruturas miniaturizadas semelhantes a órgãos cultivadas em condições de cultura tridimensionais que imitam o microambiente do órgão e incluem os fatores intrínsecos necessários para a auto-organização e auto-renovação no próprio desenvolvimento do órgão. Os organoides podem ser derivados de células-tronco pluripotentes (PSCs) ou células derivadas de tecidos adultos (células-tronco ou progenitoras)¹. Embora sua organização precisa semelhante a um órgão e semelhança funcional com o órgão específico os tornem ferramentas valiosas para a modelagem de doenças, eles ainda precisam de melhorias adicionais em termos de padronização na cultura. Em particular, vários protocolos foram publicados para a geração de organoides hepáticos e diferem em sua complexidade e reprodutibilidade². Por exemplo, os organoides de brotos hepáticos desenvolvidos por Takebe et al. assumem a forma de estruturas densas e multicelulares contendo as seguintes células-tronco pluripotentes induzidas (iPSCs): progenitores endodérmicos hepáticos, células endoteliais da veia umbilical humana (HUVECs) e células-tronco mesenquimais (MSCs). No entanto, esses organoides não têm capacidade de auto-renovação de longo prazo ^3,4.

De uma perspectiva histórica, Huch et al. relataram pela primeira vez a produção de organoides epiteliais hepáticos humanos derivados de tecido adulto, nos quais as células polarizam e se especializam para reproduzir aspectos do epitélio nativo⁵. Em seguida, Guan et al. usaram organoides hepáticos derivados de iPSC para modelar a síndrome de Alagille (ALGS), um distúrbio genético raro associado à redução do ducto biliar no fígado⁶. Ambos os organoides têm capacidade de autorrenovação e podem ganhar funções maduras de hepatócitos, como secreção de bile e albumina, armazenamento de glicogênio e desintoxicação de drogas específicas para o fígado. Em um estudo recente, Ramli et al. introduziram um modelo organoide hepático derivado de PSC contendo redes funcionais de canalículos biliares entre células polarizadas semelhantes a hepatócitos (HLCs) que esvaziam drogas colestáticas em cistos biliares compostos de células semelhantes a colangiócitos (CLCs)⁷.

Este estudo apresenta uma cultura única para a geração de organoides hepáticos endodérmicos derivados de iPSC, chamados eHEPOs. A cultura de iPSC e a diferenciação em endoderme são descritas passo a passo, e a geração de eHEPOs a partir de progenitores enriquecidos de EpCAM+ é demonstrada. Por fim, é descrita a caracterização da funcionalidade e organização estrutural dos eHEPOs, bem como a criopreservação dos organoides.

Protocolo

As permissões relacionadas às etapas experimentais foram obtidas do Comitê de Ética em Pesquisa Clínica local da Faculdade de Medicina da Universidade Dokuz Eylul (2013/25-4, 12 de maio de 2013; 2016/30-29, 24 de novembro de 2016).

1. Preparação de soluções para cultura celular

1. Prepare o meio de diferenciação endoderme misturando os seguintes componentes em uma capela de fluxo laminar: 1% B27, 100 ng/mL de Activina A, Wnt3a ou 30% wnt3a-CM e R-spo1 ou 10% R-spo1-CM (consulte a Tabela de Materiais).
2. Prepare o tampão de classificação de células ativadas por fluorescência (FACS) com a seguinte composição: PBS, EDTA 1 mM, HEPES 25 mM, FBS 1%.
3. Prepare o meio de expansão (EM): 1% N2, 1% B27, 1,25 mM N-acetil-L-cisteína, 50 ng/mL EGF, 10% R-spo1 meio condicionado, 100 ng/mL FGF 10, 10 mM de nicotinamida, 5 μM A8301 e 10 μM de forscolina (FSK) em Advanced DMEM/F-12. Adicione 10 nM Y-27632 e 0.3 nM WNT3a (consulte a Tabela de Materiais).
   NOTA: Mantenha o meio completo por no máximo 2 semanas a 2-8 °C.
4. Prepare o meio de diferenciação (DM): 1% N2, 1% B27, gastrina 10 nM, 50 ng/mL EGF, 100 ng/mL FGF 10, 25 ng/mL HGF, 500 nM A8301, 10 μM DAPT, 25 ng/mL BMP7 e 30 μM dexametasona em Ad-DMEM/F-12 (consulte a Tabela de Materiais).
   NOTA: Mantenha o meio completo por 2 semanas a 2-8 °C.

2. Descongelar os iPSCs na placa sem alimentador

1. Cubra a placa de cultura de células com matriz de membrana basal (BMM).
   1. Descongele um frasco de uma alíquota de BMM durante a noite no gelo ou pelo menos 2 h antes de iniciar o revestimento. Adicione 6 mL de DMEM / F-12 frio em um tubo cônico de 15 mL, adicione imediatamente 80 μL de BMM descongelado e misture bem.
   2. Use placas de poço tratadas com cultura de tecidos, cubra a placa de cultura com solução BMM e dispense-a para cobrir a superfície da placa do poço. Incubar a placa numa incubadora a 37 °C durante, pelo menos, 1 h antes da utilização. Após o tempo de incubação, descarte a solução BMM e adicione imediatamente o meio específico para iPSC.
2. Remova um frasco de iPSCs do armazenamento de nitrogênio líquido usando luvas criogênicas. Coloque imediatamente o frasco para injetáveis num suporte para tubos flutuante e mergulhe o suporte num banho-maria a 37 °C até que os cristais de gelo derretam.
   1. Remova o frasco do banho-maria e limpe bem a parte externa com etanol a 70%. Em seguida, coloque-o na coifa laminar. É importante ser rápido nesta etapa.
   2. Em condições assépticas, em uma coifa laminar, transfira as células descongeladas para um tubo cônico estéril de 15 mL contendo 5 mL de meio específico para iPSC.
      1. Centrifugue as células a 200 × g (à temperatura ambiente) durante 3 min. Rejeitar lentamente o sobrenadante, ressuspender as células em 2 ml de meio específico para iPSC pipetando muito suavemente algumas vezes com uma pipeta serológica de 5 ml e semear as células nos alvéolos revestidos.
   3. Mova a placa rapidamente para dispersar as células por toda a superfície do poço. Incubar a placa na incubadora a 37 °C, 5% de CO₂ .
   4. Atualize o meio de cultura todos os dias.

3. Diferenciação da endoderme

1. Cubra uma nova placa de poço com BMM 1 h antes de dividir as iPSCs, conforme mencionado na seção 2.
2. Controle a integridade e viabilidade das iPSCs sob microscopia de luz. As iPSCs indiferenciadas são células com núcleos grandes, citoplasma pequeno e colônias de células compactas com bordas distintas.
   NOTA: Existem duas soluções enzimáticas para dividir células. No caso de uso de dispase (1 U/mL), áreas de células diferenciadas devem ser removidas. Se uma enzima específica for usada, não há necessidade de diferenciar manualmente as regiões com raspagem ou sucção. Mantenha a enzima específica à temperatura ambiente.
3. Aqueça o iPSC em temperatura média a ambiente. Aspire o meio e lave a placa iPSC com DMEM/F-12 ou D-PBS. Adicione 1 mL da enzima específica a um poço de uma placa de 6 poços, incube por 1 min à temperatura ambiente e, em seguida, aspire a enzima específica e incube a placa a 37 ° C por 5-7 min.
   NOTA: O tempo ideal de tratamento com enzimas deve ser otimizado com base na linha iPSC usada.
4. Após o tempo de incubação, adicione 1 mL de meio iPSC pré-aquecido e bata suavemente na lateral da placa para separar os agregados de colônias indiferenciadas da superfície da placa. O tamanho ideal dos agregados é de 50-200 μM.
   1. Com uma pipeta sorológica de 5 mL, misture suavemente a suspensão e, em seguida, semeie a suspensão celular na densidade desejada no poço revestido com BMM. Incubar as células a 37 °C durante 3-5 dias para atingir uma confluência de 70%.
5. Antes de iniciar a diferenciação, substitua o meio iPSC pelo meio endoderme (etapa 1.1). Atualize o meio todos os dias. Controle as mudanças morfológicas das células durante as etapas de diferenciação. As interações célula-célula começam a aparecer após a diferenciação e as células ganham uma forma pontiaguda.

4. Estabelecimento eHEPO

1. Realizar o enriquecimento das células endodérmicas EpCAM+ com FACS.
   1. Descongele um frasco de BMM específico para organoides (consulte a Tabela de Materiais) em gelo antes do experimento de classificação de células. Pré-aqueça as placas de cultura de tecidos a 37 °C durante a noite antes do experimento de classificação de células.
   2. Enxágue as células endodérmicas com 1x PBS. Adicione 300 μL de tripsina e incube por 5 min na incubadora. Adicione 3 mL de DMEM-F12 frio e pipete com pontas de filtro de 1.000 μL para gerar células individuais.
   3. Recolha a suspensão celular num tubo cónico de 15 ml. Centrifugue as células a 300 x g (à temperatura ambiente) por 5 min. Descarte o sobrenadante e lave o pellet com 10 mL de tampão FACS (etapa 1.2).
   4. Para fazer uma suspensão unicelular, filtre as células primeiro com um filtro de malha de 100 μm e depois com um filtro de malha de 40 μm.
      NOTA: Antes de usar o filtro, enxágue a superfície do filtro com 1 mL de tampão FACS.
   5. Centrifugue a suspensão da célula a 300 x g (à temperatura ambiente) por 5 min. Conte o número da célula com Trypan Blue⁸.
   6. A proporção para coloração é de 1:11. Por exemplo, ressuspenda 15 x 10⁶ células com 105 μL de tampão FACS e adicione 45 μL de FcR e 15 μL de EpCAM (consulte a Tabela de Materiais). Incubar as células durante 10 min a 40 °C e proteger o tubo da luz. Após a incubação, adicione 500 μL de tampão FACS para lavar a suspensão celular. Centrifugue as células a 300 x g (à temperatura ambiente) por 5 min.
   7. Ressuspenda o pellet em 500 μL de tampão FACS. Adicione DAPI (0,5 μM / 1 mL, concentração final) à suspensão celular para quantificar as células mortas. Mantenha as células no gelo até iniciar a etapa de classificação das células.
2. Incorpore o EpCAM e classifique as células no BMM. Após a classificação das células, centrifugue as células a 300 x g por 5 min para retirar o tampão FACS. Remova o sobrenadante e ressuspenda 3.000-5.000 células em 20 μL de BMM.
   1. Semeie as células adicionando uma gota de BMM ao centro de cada placa de 48 poços. Incubar as células durante 2 min a 37 °C até que o BMM esteja solidificado. Reverta cuidadosamente a placa e mantenha-a na incubadora por mais 10 min. Cubra a gota com o meio de expansão (250 μL por poço para uma placa de 48 poços).
   2. Atualize o meio organoide a cada 3 dias. Nos dias 10-11, o tamanho do organoide será maior que 100 μm.
3. Realize a dissociação e diferenciação mecânica do eHEPO.
   1. Divida cada gotícula organoide na proporção de 1:4. Para dividir, descarte o meio organoide e adicione 500 μL de Ad-DMEM/F12 frio. Com pontas de filtro de 1.000 μL, pipete vigorosamente as gotículas de BMM.
   2. Colete no máximo 10 gotículas de BMM em tubos cônicos de 15 mL e adicione 5 mL de Ad-DMEM / F12 frio. Mantenha o tubo no gelo por 3-5 min.
   3. Centrifugar as células a 200 x g durante 5 min a 4 °C. Descarte o sobrenadante até restar 1 mL. Pipetar vigorosamente o pellet celular 30-40 vezes utilizando pontas de filtro de 200 μL. Verifique o tamanho do organoide sob microscopia de luz, evitando cuidadosamente a formação de uma suspensão unicelular.
   4. Após dissociação mecânica, adicione 5 mL de Ad-DMEM / F12 frio e centrifugue as células a 200 x g por 5 min a 4 ° C.
   5. Descarte o sobrenadante e mantenha a suspensão no gelo até semear as células.
   6. Semeie uma gota de 50 μL de BMM (contendo 35 μL de BMM + 15 μL de células e Ad-DMEM/F-12 por poço para uma placa de 24 poços).
   7. Adicione BMP7 (25 ng/mL, consulte a Tabela de Materiais) ao meio EM e cultive por 3 dias. No dia 4, substitua o meio pelo meio de diferenciação (etapa 1.4). Atualize o meio a cada 3 dias e cultive as células por pelo menos 14 dias.

5. Caracterização de eHEPOs

1. Realize exames histológicos.
   1. Execute a incorporação de parafina.
      1. Remova o meio, adicione 1-2 mL de PBS 1x frio e ressuspenda suavemente o BMM no PBS 1x frio. Transfira cuidadosamente os organoides para um tubo de centrífuga de 15 mL. Deixe os organoides assentarem sob a gravidade e, em seguida, aspire cuidadosamente o PBS. Repita a etapa de lavagem três vezes.
      2. Adicione 10 mL de fixador fresco (10% de formalina tamponada neutra) aos organoides e incube por 30 min. Remova suavemente o fixador, adicione 10 mL de PBS 1x frio e incube por 10 min. Aspire cuidadosamente o PBS.
      3. Manchar os organoides em solução de eosina a 0,5% (ver Tabela de Materiais) dissolvida em etanol a 96% por 30 min à temperatura ambiente.
         NOTA: Se a imunocoloração for feita, não cove com eosina.
      4. Desidrate os organoides lavando com uma série de álcool (70% de etanol, 80% de etanol e 96% de etanol) por 5 min cada em temperatura ambiente. Mergulhe os organoides em etanol 100% (etanol absoluto) por 30 min.
      5. Limpe os organoides usando xileno (consulte a Tabela de Materiais) três vezes por 20 minutos de cada vez⁹.
         CUIDADO: O xileno é um composto muito tóxico e inflamável, portanto, manuseie-o usando equipamentos de segurança apropriados. Evite trabalhar em grandes quantidades.
      6. Transfira suavemente os organoides para um molde de base de metal pré-aquecido (consulte a Tabela de Materiais) com parafina derretida usando uma pipeta de plástico. Manter os organoides em parafina derretida três vezes durante 30 minutos cada numa incubadora a 65 °C (substituí-la por uma nova parafina fresca derretida a cada mudança).
      7. Em seguida, incorpore os organoides em uma nova parafina fresca. Mova os organoides suavemente para o meio do molde da base de metal.
         NOTA: Para esta etapa, é crucial trabalhar rapidamente porque a parafina solidifica à temperatura ambiente.
      8. Transfira o molde da base de metal para a placa fria por 10-20 s para estabilizar os organoides. Em seguida, despeje parafina derretida para cobrir o molde de base de metal e adicione um de tecido (consulte a Tabela de Materiais) na parte superior do molde de base de metal para rotulagem. Certifique-se de que haja parafina suficiente no molde e deixe-os solidificar na placa fria. Remova o molde da base de metal.
      9. Corte seções de 5-7 μm de espessura usando um micrótomo padrão (consulte a Tabela de Materiais). Coloque seções de parafina em série em lâminas adesivas de microscópio. Deixe as lâminas secarem durante a noite.
   2. Realize a coloração de hematoxilina e eosina (H & E) e ácido periódico de Shiff (PAS).
      1. Coloque as lâminas embebidas em parafina em uma incubadora a 63 ° C durante a noite para desparafinização. No dia seguinte, coloque as lâminas em xileno três vezes por 20 minutos de cada vez. Não deixe as lâminas secarem.
      2. Reidrate as lâminas com uma série de álcool graduado (100% etanol, 96% etanol, 80% etanol e 70% etanol) por 2 min. Em seguida, coloque as lâminas na água destilada por 1 min.
      3. Para coloração H&E, execute as etapas a seguir.
      4. Coloque as lâminas em solução de hematoxilina por 5 min. Enxágue as lâminas em água corrente da torneira por 5 min. Manchar as lâminas com solução de eosina Y a 1% (ver Tabela de Materiais) durante 10 s.
      5. Desidrate as seções com uma série de etanol a 80%, etanol a 96% e duas trocas de etanol a 100% por 30 s cada.
      6. Coloque as lâminas no xileno para limpar três vezes por 20 minutos de cada vez.
      7. Monte cuidadosamente as lamínulas nas seções das lâminas de vidro com um meio de montagem (consulte a Tabela de Materiais). Certifique-se de que não haja mais bolhas.
      8. Para a coloração PAS, execute as etapas 5.1.2.4-5.1.2.6, seguidas dos procedimentos para a coloração PAS conforme relatado por Akbari et ^al.10. Em seguida, monte cuidadosamente as lamínulas nas seções das lâminas de vidro com o meio de montagem. Certifique-se de que não haja mais bolhas.
   3. Realize a coloração imuno-histoquímica (IHQ).
      1. Execute a etapa 5.1.2.1 e a etapa 5.1.2.2 no protocolo de coloração H&E.
      2. Aqueça as lâminas em tampão citrato 0,1 M (pH 6,0) no micro-ondas por 10 min.
      3. Segure até que as lâminas esfriem até a temperatura ambiente (aproximadamente 20 min) e enxágue as lâminas com água destilada.
      4. Coloque as lâminas em 3% H₂O₂ recém-preparadas em metanol por 10 min em temperatura ambiente. Em seguida, enxágue as lâminas em água destilada por 1 min.
      5. Bloqueie a ligação não específica de anticorpos primer incubando as seções com uma solução de bloqueio (soro a 2% + Triton X-100 a 0,1% + BSA a 0,1%) à temperatura ambiente por 1 h.
      6. Remova cuidadosamente a solução de bloqueio e adicione os anticorpos primários (E-CAD, ALB, EpCAM, A1AT, CK19) (consulte a Tabela de Materiais) diluídos na solução de bloqueio a 4 ° C durante a noite.
      7. No dia seguinte, enxágue cuidadosamente as lâminas duas vezes por 10 min (.
      8. Adicione os anticorpos secundários (Goat Anti-Rabbit, Goat Anti-Mouse) (consulte a Tabela de Materiais) por 1 h em temperatura ambiente e enxágue as lâminas em água destilada por 5 min (três vezes).
      9. Prepare a solução de tetracloridrato de diaminobenzidina 3'3 (DAB, consulte a Tabela de Materiais) (deve ser preparada 30 minutos antes do uso).
      10. Aplique a solução DAB nas lâminas por 1-5 min e enxágue as lâminas em água destilada por 5 min (três vezes).
      11. Contra-corar as secções com hematoxilina durante 1 min e enxaguar as lâminas em água corrente da torneira durante 1 min.
      12. Desidrate as seções com uma série de etanol a 80%, etanol a 96% e duas trocas de etanol a 100% por 30 s cada.
      13. Coloque as lâminas em xileno por 20 min (três vezes).
      14. Monte cuidadosamente a lamínula na seção da corrediça de vidro com um meio de montagem. Certifique-se de que não haja mais bolhas.
   4. Execute a incorporação de OCT.
      1. Fixe os organoides usando PFA a 4% frio recém-preparado durante a noite a 4 °C. Remova cuidadosamente o fixador e lave com 1x PBS por 15 min (três vezes).
      2. Prepare uma solução de sacarose a 30% (p / v) usando água destilada. Remova o 1x PBS e adicione a sacarose a 30% para desidratar os organoides.
      3. Incubar os organoides a 4 °C durante a noite. Inicialmente, a maioria dos tecidos flutua em sacarose a 30% e afunda assim que a permeação estiver completa. A crioproteção pode ser considerada completa neste momento.
      4. Prepare gelo seco ou nitrogênio líquido para o processo de incorporação.
      5. Coloque duas a três gotas de OCT (consulte a Tabela de Materiais) em criomoldes de plástico. Coloque os organoides em cima na orientação correta para o corte.
      6. Despeje lenta e cuidadosamente o OCT em cima dos organoides. Tenha cuidado para evitar bolhas. Deixe os organoides assentarem sob gravidade por 10-15 min em temperatura ambiente.
      7. Rotule os criomoldes antes da etapa de congelamento. Coloque os moldes em gelo seco ou nitrogênio líquido para congelamento rápido. Transfira os criomoldes para −80 °C e armazene-os lá até o processo de seccionamento.
   5. Realize a coloração por imunofluorescência (IF).
      1. Execute a coloração da seção congelada.
         1. Seque ao ar as seções criogênicas por 20-30 min em temperatura ambiente. Reidrate as lâminas com água destilada por 5 min (três vezes). Cerque o tecido com uma barreira hidrofóbica usando uma caneta de papanicolau (consulte a Tabela de Materiais).
         2. Adicione 200-300 μL de Triton X-100 a 0,2% por seção. Lave cuidadosamente as lâminas por 5 min (três vezes). Certifique-se de que as seções não caiam das corrediças durante as etapas de lavagem.
         3. Adicione solução de bloqueio (soro a 2% + Triton X-100 a 0,1% + BSA a 0,1%) por 1 h em temperatura ambiente.
         4. Remova suavemente a solução de bloqueio, adicione os anticorpos primários (E-CAD, A1AT, HNF4α) diluídos na solução de bloqueio (consulte a Tabela de Materiais) e incube as lâminas durante a noite a 4 °C. No dia seguinte, lave cuidadosamente as lâminas por 10 min (duas vezes).
         5. Adicione anticorpos secundários adequados (Alexa Fluor 488 [Mouse], Alexa Fluor 594 [Mouse], Alexa Fluor 594 [Rabbit]) por 1 h em temperatura ambiente (consulte a Tabela de Materiais) e enxágue as lâminas em água destilada por 5 min (três vezes).
         6. Adicione 100-200 μL de corante nuclear Hoechst ou DAPI por seção por 3 min, lave as lâminas com 1x PBS e repita a etapa de lavagem três vezes.
         7. Monte as lamínulas nas seções em lâminas de vidro com um meio de montagem anti-desbotamento. Mantenha as lâminas durante a noite a 4 °C e proteja-as da luz até o processo de imagem.
      2. Execute a coloração de montagem inteira.
         1. Execute as etapas 5.1.1.1 e 5.1.1.2 no procedimento de incorporação de parafina.
         2. Adicione solução de bloqueio (0,1% -1% Triton X-100, 1% DMSO, 1% BSA e 1% de soro de cabra em 1x PBS, consulte a Tabela de Materiais) e incube os organoides com solução de bloqueio por 2-3 h em temperatura ambiente.
         3. Remova cuidadosamente a solução de bloqueio e adicione os anticorpos primários (CK19, CK18, ZO-1, ALB) diluídos na solução de bloqueio durante a noite a 4 ° C (consulte a Tabela de Materiais).
         4. No dia seguinte, remova suavemente a solução e adicione 1x PBS. Deixe os organoides assentarem sob gravidade por até 10 min. Remova a solução com cuidado e repita a etapa de lavagem três vezes.
         5. Incube os organoides com os anticorpos secundários (Alexa Fluor 594 [Mouse], Alexa Fluor 488 [Rabbit], Alexa Fluor 488 [Mouse]) por pelo menos 1 h em temperatura ambiente. Remova a solução com cuidado e repita a etapa de lavagem quatro vezes.
         6. Para coloração nuclear, incubar os organoides com corante nuclear Hoechst ou DAPI durante 10 min. Lave os organoides adicionando 1x PBS e repita a etapa de lavagem três vezes. Deixe os organoides assentarem no fundo do tubo.
         7. Usando uma pipeta Pasteur de plástico, remova os organoides do tubo e coloque-os em lâminas de vidro. Certifique-se de fazê-lo com o mínimo de danos aos organoides.
         8. Remova o excesso de PBS e adicione uma quantidade (uma a duas gotas) de meio de montagem. Monte cuidadosamente as lamínulas nos organoides nas lâminas de vidro com o meio de montagem. Mantenha as lâminas a 4 °C e proteja-as da luz até o processo de imagem.
2. Realize microscopia eletrônica.
   1. Fixe os organoides usando solução de Karnovsky (glutaraldeído tamponado a 2,5% + paraformaldeído a 2% em tampão fosfato de sódio 0,1 M [tampão de Sorensen], pH 7,4, consulte a Tabela de Materiais) durante a noite a 4 ° C.
   2. Lave os organoides com tampão de Sorenson 0,1 M + sacarose 0,1 M (1:1) por 15 min (três vezes). Em seguida, fixe os organoides em tetróxido de ósmio tamponado com fosfato de sódio a 2% (consulte a Tabela de Materiais) por 90 min.
   3. Incorpore os organoides em ágar quente a 2%. Corte o excesso de ágar ao redor dos organoides usando uma lanceta. Lave os organoides no tampão de Sorensen por 15 min (três vezes).
   4. Desidratar com acetona a 50% por 15 min (duas vezes).
   5. Contraste durante a noite usando acetona a 70% + ácido fosfotúngstico a 1% + acetato de uranila a 0,5% (consulte a Tabela de Materiais) a 4 ° C.
   6. No dia seguinte, desidrate os organoides usando uma série de acetona (80% de acetona, 90% de acetona, 96% de acetona e 100% de acetona) por 15 min (duas vezes).
   7. Limpe os organoides usando óxido de propileno por 10 min (duas vezes) e, em seguida, coloque os organoides em uma mistura de óxido de propileno (consulte a Tabela de Materiais) por 30 min em temperatura ambiente.
   8. Adicione uma nova solução de epon aos organoides e incube durante a noite a 4 °C.
   9. No dia seguinte, coloque uma nova solução de epon fresca no molde de base e, em seguida, incorpore os organoides. Colocar numa incubadora durante 48 h a 65 °C para polimerização.
   10. Corte os blocos de epon organoide com um ultramicrótomo ajustado para uma espessura de seção de 50-100 nm. Coloque as seções em grades cobertas de formvar.
3. Meça a atividade enzimática do CYP3A4.
   1. Meça a atividade do CYP usando um kit disponível comercialmente (consulte a Tabela de Materiais) seguindo as instruções do fabricante.
      NOTA: As enzimas CYP convertem o substrato em um produto intermediário detectável 11,12,13. Existem duas opções (lítica celular e não lítica) para medir a atividade da enzima CYP. O kit fornece um aplicativo para analisar as atividades basais do CYP e as atividades induzidas do CYP após o tratamento com compostos.
   2. Execute o experimento em triplicado. Leia a luminescência com um luminômetro e calcule o sinal. Para normalizar, tripsinize os organoides e conte o número de células.
4. Realize a quantificação da albumina humana.
   1. Substituir o meio de cultura celular por um meio novo 24 h antes do teste ELISA. Após 24 h de incubação, recolher o meio de cultura celular (300-500 μl) e centrifugar a 500 x g (a 4 °C) durante 2 minutos para remover os restos celulares e as partículas. Aliquotar o sobrenadante e armazenar as amostras a -80 °C (até 3 meses).
   2. Execute o padrão e a amostra em duplicata. Organoides amadurecidos secretam albumina no meio de cultura; quantificar esta albumina com um kit de quantificação ELISA (ver Tabela de Materiais). Medir a absorvância com um leitor de placas ELISA a 450 nm no prazo de 30 minutos após a interrupção da adição da solução. Tripsinize os organoides e conte o número de células a serem normalizadas.
5. Realizar o ensaio de eliminação do amoníaco.
   1. Realize o ensaio de eliminação de amônia seguindo as instruções do fabricante (consulte a Tabela de Materiais). Resumidamente, adicione 1,5 mM NH₄Cl ao meio de cultura e incube por 24 h.
   2. Após a incubação, determine a concentração de amônia com um kit de ensaio de amônia (consulte a Tabela de Materiais). Calcule as medições usando um leitor multimodo de várias placas e normalize os valores para os números das células.
6. Realize o ensaio de colilgilglicilamido-fluoresceína (CLF).
   1. Resumidamente, trate os organoides com 10 μmol/L CLF (consulte a Tabela de Materiais) e incube por 1 h em uma incubadora a 37 °C. Após a incubação, lave os organoides com 1x PBS. Realize imagens usando microscopia de fluorescência.
7. Realize a análise da expressão gênica.
   1. Siga as instruções do kit RNeasy (consulte a Tabela de Materiais) para isolar o RNA total dos eHEPOs.
   2. Configure a reação de PCR usando uma mistura principal disponível comercialmente (consulte a Tabela de Materiais), seguindo as instruções do fabricante. Depois de preparar a mistura de PCR para cada conjunto de primers, coloque 10 μL de cada amostra nas placas de qPCR de 96 poços (Tabela 1).
   3. Sele as placas com selante adesivo e, em seguida, centrifugue as placas a 1.000 x g por 2 min em temperatura ambiente. Carregue as placas em uma máquina de PCR. Normalize a expressão gênica relativa a um controle interno (RPL41, Tabela 1) e analise usando o método 2−ΔΔCt ¹⁴.

6. Criopreservação dos eHEPOs

1. Rotule os criotubos com um marcador resistente ao nitrogênio. Verificar o nível de isopropanol do recipiente de congelação e mantê-lo a 4 °C durante 15-30 minutos antes de iniciar a experiência.
2. Congele uma gota de 50 μL de BMM em uma criogenia. Prossiga com a dissociação mecânica organoide conforme descrito na etapa 4.3. Após a dissociação, ressuspenda o agregado celular em 500 μL de meio de congelamento frio, depois transfira suavemente a suspensão para criogeniais e mantenha-os no recipiente de congelamento.
3. Transfira o recipiente de congelamento da célula para -80 ° C e, após 24 h, transfira os criogenianos para nitrogênio líquido para armazenamento de longo prazo.

7. Descongelamento dos eHEPOs

1. Pré-aqueça um banho-maria e Ad-DMEM/F12 a 37 °C.
2. Remova um frasco de eHEPOs do armazenamento de nitrogênio líquido usando luvas criogênicas. Colocar o frasco para injetáveis num banho-maria a 37 °C até os cristais de gelo derreterem. Transfira a suspensão celular para um tubo cônico de 15 mL e centrifugue a 200 x g por 5 min a 4 ° C.
3. Aspire o sobrenadante e prossiga para a semeadura dos eHEPOs conforme descrito na seção 4. Cubra a gota BMM com o meio de expansão suplementado com 10 μM Y-27632 (consulte a Tabela de Materiais). Atualize o meio a cada 3 dias e remova o inibidor de ROCK após 3 dias.

Resultados

Em primeiro lugar, células de fibroblastos humanos ou células mononucleares do sangue periférico (PBMC) foram cultivadas e convertidas em iPSCs por meio de reprogramação epissómica. O soro nocaute fresco foi essencial para a obtenção de iPSCs saudáveis. Em seguida, as iPSCs foram semeadas nas placas de cultura revestidas com BMM com 50%-60% de confluência. Ter colônias de iPSC de tamanho pequeno/médio melhorou a eficiência de diferenciação. Em seguida, as iPSCs fo...

Discussão

O presente protocolo descreve um método abrangente para gerar, expandir e congelar/descongelar organoides hepáticos a partir de iPSCs. Este protocolo abrange todas as etapas, incluindo a cultura das iPSCs na cultura alimentadora e livre de alimentador, diferenciação de endoderma bidimensional, enriquecimento das células progenitoras com FACS e formação de organoides e geração de organoides que ganham função. Além disso, também são fornecidas instruções detalhadas para val...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
15 mL conical centrifuge tubes	Corning	430052
37 °C water bath	Nüve	210.NB9
37 °C, 5 % CO2 incubator	Memmert	INCO 153
50 mL conical centrifuge tubes	Corning	430290
70 µm and 40 µm Cell strainer	Falcon	352350/ 352340
70% Ethanol	Sigma	1009832511
A1AT	Abcam	ab166610	Dilution: 1/500 (IF), 1/50 (IHC)
A-83.01 (TGF-β inhibitor)	Tocris Biosciene	2939
Acetone	Isolab	9,01,026
Adhesive Microscope Slide	Histobond	C981040
Advanced DMEM-F12	Gibco	12634-010
AFP	Abcam	ab3980	Dilution: 1/25 (IHC)
Agar	EMS	10200
ALB	Abcam	ab10241	Dilution: 1/100 (IF), 1/20 (IHC)
Alexa Flour 488 (Mouse)	Invitrogen	A11001	Dilution: 1/1000 (IF)
Alexa Flour 488 (Rabbit)	Invitrogen	A110034	Dilution: 1/1000 (IF)
Alexa Flour 594 (Mouse)	Invitrogen	A11005	Dilution: 1/1000 (IF)
Alexa flour 594 (Rabbit)	Invitrogen	A11037	Dilution: 1/1000 (IF)
Ammonia Assay Kit	Sigma-Aldrich	MAK-310
Ammonium cloride	Santa Cruz	sc-202936
B27 Supplement 50x	Gibco	12587010
Base mold	Sakura	4216
b-FGF	Peprotech	100-18B
Biosafety, CLASS II,SAFETY CABINET	Thermo	SAFE 2020
Calibrated pipettes	Gilson	F167380
Centrifuge	Eppendorf	5702
Cholylglycylamido-fluorescein	Corning	451041
Citrate Buffer pH 6.0	Bio-optica	15-M103
CK-18	Santa Cruz	sc-51582	Dilution: 1/100 (IF), 1/20 (IHC)
CK-19	Santa Cruz	sc-6278	Dilution: 1/100 (IF), 1/20 (IHC)
Confocal Microscope	Zeiss	LSM880
Cryogenic handling gloves and eye protection	Cryokit	5274
Cryostat	Leica	CM 1950
Cryovial tubes	Corning	430659
DAB	Roche	11718096001
DAPT	Sigma-Aldrich	a5942
Dexamethasone	Sigma-Aldrich	D4902
Dispase	Stem Cell Technologies	7923
DMEM F12	Gibco	31330038
E-CAD	Santa Cruz	sc-8426	Dilution: 1/100 (IF), 1/20 (IHC)
EDTA	Invitrogen	15575-020
Electron Microscope	Zeiss	Sigma500
ELISA kit	Fortis life sciences bethyl	E88-129
Embed 812 Embedding Kit	EMS	14121
Entellan	Merck	107961
Eosin Y %1	Sigma-Aldrich	HT110332
EpCAM	Miltenyi Biotec	130-059-901	Dilution: 1/11 (FACS)
Ethanol	Merck	1,00,98,32,511
Fetal Bovine Serum (FBS)	Gibco	26010066
Forskolin (FSK)	Tocris Biosciene	1099
Freezing container (Mr. Frosty)	Thermo	5100-0001
Freezing Medium	Gibco	12648010
Glass Pasteur pipette	Isolab	084.01.001
Glutamax 100x	Gibco	35050-068
Gluteraldehyde %25, EM grade	EMS	16210-1L
Goat Anti-Mouse HRP	Thermo Fisher	62-6520	Dilution: 1/1000 (IHC)
Goat Anti-Rabbit HRP	Thermo Fisher	31460	Dilution: 1/1000 (IHC)
Goat Serum	Gibco	162-10-072
H2O2	Merck	107209
Hematoxylin	Millipore	HX86017674
HEPES, 1 M	Gibco	15630-056
HNF-4α	Abcam	ab55223	Dilution: 1/50 (IHC)
Ice and dry ice	homemade	homemade
Incubator (65 °C)	Nüve	EN 400
Isopropanol	Sigma-Aldrich	24137
Leu15 Gastrin I human	Sigma-Aldrich	G9145
Luminometer	Berthold Tech	LB 960
Master mix	Applied Biosystems	43676659
Matrigel matrix, hESC-Qualified	Corning	354277
Matrigel matrix, phenol-red-free	Corning	356231
Methanol	Merck	179337
Microcentrifuge tubes	Axygen	321-02-501
Microscope	Zeiss	AXIO VERT A1
Microtome blade	Feather	S35, C35
mTeSR1	Stem Cell Technologies	sc-05850
Multi well suspension culture plates	Sarstedt	83,39,21,500
N2 supplement 100x	Gibco	17502048
N-Acetylcysteine	Sigma-Aldrich	A9165
Neutral Buffered Formalin %10	Tekkim	TK.60161.05001
Nicotinamide	Sigma-Aldrich	N0636
Non-essential Amino Acide (NEAA)	Gibco	11140050
OCT	Tissue-Tek	4583
Osmium tetroxide	EMS	19110
P450-Glo Assays kit	Promega	V9001
Pap-pen	Sigma	Z377821-1EA
Paraffin	Tekkim	TK.200661.01002
PAS stain kit	Abcam	ab150680
PBS	Lonza	be17-516
Penicillin/Streptomycin	Gibco	15630-056
Phosphotungustic acid	Ted Pella	19402
Pipette aid	Axygen	Motopet-1
Plate reader varioskan flash	Thermo	5250040
Prolong Antifade Mountant	Invitrogen	P36980
Propylene Oxide, EM grade	EMS	20401
Real Time PCR system	Applied Biosystems	7500 Fast
Recombinant human Activin A	R&D	338-Ac-050
Recombinant human BMP7	Peprotech	120-03
Recombinant human EGF	Peprotech	af-100-15
Recombinant human FGF10	Peprotech	100-26
Recombinant human FGF19	Peprotech	100-32
Recombinant human HGF	Peprotech	100-39
Rho kinase inhibitor, Y-27632 dihydrochloride	Sigma-Aldrich	Y0503
RNase/DNase free 1.5 mL tube	Axygen	31108101
RNase/DNase free filter tips	Sarstedt	703031255
Rotary Microtome	Leica	RM 2245
RPMI 1640 Medium	Gibco	61870010
Rspo1-conditioned medium	Homemade
Slide master	Bio-optica	15-MEQ001
Sorenson’s Phosphate Buffer	EMS	11600-10
Spinner	Thermo	MY SPIN 6
Sterile serological pipettes	Falcon	357543
Tissue Casette	Leica	3802240
Trimmer	Leica	EM TRIM2
Triton X-100	Thermo Scientific	28314
TrypLE Express Enzyme	Gibco	12605010
Trypsin-EDTA	Gibco	25200-056
Ultramicrotome	Leica	EM UC7
Uranylacetate	EMS	22400
Vortex	Thermo	88880018
Wnt Surrogate-Fc Fusion Protein	ImmunoPrecise	N001
Xylene	Sigma	16446
ZO-1	Invitrogen	40-2200	Dilution: 1/400 (IF)