기능성 내배엽 간 오가노이드(endodermal hepatic organoids)의 생성

요약

이 프로토콜은 빠르고 재현 가능한 내배엽 간 오가노이드(eHEPO)의 생성을 설명합니다. 이 프로토콜을 사용하면 eHEPO를 2주 이내에 생산할 수 있으며 차별화와 기능을 잃지 않고 장기(1년 이상)로 확장할 수 있습니다.

초록

오가노이드 기술을 통해 간, 뇌, 장과 같은 다양한 인간 장기와 유사한 미니 구조를 체외에서 생성할 수 있었습니다. 오가노이드 모델의 괄목할 만한 발전은 최근 질병 모델링, 발달 생물학 및 약물 발견의 다양한 응용 분야에 새로운 실험 시대를 열었습니다. 성체 줄기세포 또는 유도만능줄기세포(iPSC) 유래 간 오가노이드는 다양한 응용 분야에 사용하기 위해 간세포의 생성을 조절합니다. 여기에서는 만능 줄기 세포에서 간 오가노이드를 생성하기 위한 강력하고 재현 가능한 프로토콜을 제시합니다. 이 프로토콜은 건강한 환자 유래 세포에 적용할 수 있습니다. 3D 내배엽 유래 간 오가노이드(eHEPO)를 달성하기 위해 iPSC를 먼저 내배엽 세포로 직접 분화한 다음 FACS가 풍부한 EpCAM 양성(EpCAM+) 세포를 사용하여 확장 배지를 사용하여 간 오가노이드를 구축했습니다. 당사는 2주 이내에 간 오가노이드를 생성할 수 있는 빠르고 효율적인 방법을 제공합니다. 생성된 오가노이드는 알부민 분비, 글리코겐 저장 및 시토크롬 P450 효소 활성과 같은 간세포의 필수 특성과 기능을 모방합니다. 간 특이적 유전자 발현의 유사성 외에도, eHEPO는 담즙관(bile canaliculi)이 있는 편광 상피 세포로 구성됩니다. 또한, eHEPO는 성숙한 간세포로 분화하는 능력을 잃지 않고 장기(1년) 확장되고 연속 계대가 될 수 있습니다. 따라서 eHEPO는 기능성 간세포를 생산할 수 있는 대체 공급원을 제공합니다.

서문

오가노이드는 3차원 배양 조건에서 성장한 소형화된 장기와 같은 구조로, 장기 미세환경을 모방하고 장기 발달 자체에서 자기 조직화 및 자기 재생에 필요한 내재적 요인을 포함합니다. 오가노이드는 만능 줄기 세포(PSC) 또는 성체 조직 유래 세포(줄기 세포 또는 전구 세포)에서 유래할 수 있습니다¹. 정확한 장기 유사 조직과 특정 기관과의 기능적 유사성으로 인해 질병 모델링에 유용한 도구가 되지만, 배양의 표준화 측면에서 여전히 추가 개선이 필요합니다. 특히, 간 오가노이드 생성에 대한 여러 프로토콜이 발표되었으며, 이러한 프로토콜은 복잡성과 재현성²에서 차이가 있습니다. 예를 들어, Takebe 등이 개발한 간싹 오가노이드는 유도만능줄기세포(iPSC), 즉 간 내배엽 전구세포, 인간 제대 정맥 내피 세포(HUVEC) 및 중간엽 줄기세포(MSC)를 포함하는 조밀한 다세포 구조의 형태를 취합니다. 그러나 이러한 오가노이드는 장기적인 자가 재생 능력이 없습니다 ^3,4.

역사적 관점에서 Huch 등은 성체 조직에서 유래한 인간 간 상피 오가노이드의 생산을 처음으로 보고했는데, 이 세포는 천연 상피의 측면을 복제하기 위해 분극하고 분화합니다⁵. 그런 다음 Guan 등은 iPSC 유래 간 오가노이드를 사용하여 간 내 담관 감소와 관련된 희귀 유전 질환인 알라질 증후군(ALGS)을 모델링했습니다⁶. 이 두 오가노이드는 모두 자가 재생 능력을 가지고 있으며 담즙 및 알부민 분비, 글리코겐 저장, 간 특이적 약물 해독과 같은 성숙한 간세포 기능을 얻을 수 있습니다. 최근 연구에서 Ramli 등은 담관세포 유사 세포(CLC)로 구성된 담즙 낭종으로 담즙 정체 약물을 비우는 편광 간세포 유사 세포(HLC) 사이의 기능적 담즙관 네트워크를 포함하는 PSC 유래 간 오가노이드 모델을 도입했습니다⁷.

이 연구는 eHEPO라고 하는 iPSC 유래 내배엽 간 오가노이드를 생성하기 위한 고유한 배양을 제시합니다. iPSC 배양 및 내배엽으로의 분화는 단계별로 설명되며, 농축된 EpCAM+ 전구 세포에서 eHEPO가 생성되는 것이 입증됩니다. 마지막으로, eHEPO의 기능 및 구조적 조직의 특성화와 오가노이드의 동결 보존에 대해 설명합니다.

프로토콜

실험 단계와 관련된 허가는 Dokuz Eylul University Medical Faculty의 지역 임상연구 윤리 위원회(2013/25-4, 2013년 5월 12일; 2016/30-29, 2016년 11월 24일)로부터 획득했습니다.

1. 세포 배양을 위한 용액 준비

1. 층류 후드에서 1% B27, 100ng/mL Activin A, Wnt3a 또는 30% Wnt3a-CM 및 R-spo1 또는 10% R-spo1-CM 성분을 혼합하여 내배엽 분화 배지를 준비합니다( 재료 표 참조).
2. PBS, 1 mM EDTA, 25 mM HEPES, 1% FBS 조성으로 형광 활성화 세포 분류(FACS) 완충액을 준비합니다.
3. 팽창 배지(EM)를 준비합니다: Advanced DMEM/F-12에서 1% N2, 1% B27, 1.25mM N-acetyl-L-cysteine, 50ng/mL EGF, 10% R-spo1 조절 배지, 100ng/mL FGF 10, 10mM 니코틴아미드, 5μM A8301 및 10μM 포스콜린(FSK). 10nM Y-27632 및 0.3nM WNT3a를 추가합니다( 재료 표 참조).
   알림: 전체 배지를 2-2 ° C에서 최대 8 주 동안 보관하십시오.
4. Ad-DMEM/F-12에서 1% N2, 1% B27, 10 nM gastrin, 50 ng/mL EGF, 100 ng/mL FGF 10, 25 ng/mL HGF, 500 nM A8301, 10 μM DAPT, 25 ng/mL BMP7 및 30 μM 덱사메타손을 분화 매체(DM)를 준비합니다( 재료표 참조).
   알림: 전체 배지를 2-2 ° C에서 8 주 동안 보관하십시오.

2. 피더가 없는 플레이트에서 iPSC를 해동합니다.

1. 세포 배양 플레이트를 기저막 매트릭스(BMM)로 코팅합니다.
   1. BMM 분취액 한 바이알 한 바이알을 얼음에서 밤새 또는 코팅을 시작하기 최소 2시간 전에 해동합니다. 15mL 코니컬 튜브에 6mL의 차가운 DMEM/F-12를 넣고 즉시 80μL의 해동된 BMM을 첨가한 후 잘 섞습니다.
   2. 조직 배양 처리된 웰 플레이트를 사용하고, 배양 플레이트를 BMM 용액으로 코팅하고, 웰 플레이트 표면을 덮도록 분배합니다. 사용하기 전에 최소 1시간 동안 37°C 인큐베이터에서 플레이트를 배양하십시오. 배양 시간이 지나면 BMM 용액을 버리고 즉시 iPSC 특이적 배지를 추가합니다.
2. 극저온 장갑을 사용하여 액체 질소 저장소에서 iPSC 1바이알을 제거합니다. 즉시 바이알을 플로팅 튜브 랙에 놓고 얼음 결정이 녹을 때까지 랙을 37°C 수조에 담그십시오.
   1. 수조에서 바이알을 제거하고 70% 에탄올로 외부를 철저히 닦습니다. 그런 다음 층류 후드에 놓습니다. 이 단계에서 빠르게 수행하는 것이 중요합니다.
   2. 무균 조건의 층류 후드에서 해동된 세포를 5mL의 iPSC 특이적 배지가 들어 있는 멸균 15mL 원뿔형 튜브로 옮깁니다.
      1. 200 × g (실온에서)에서 3분 동안 셀을 원심분리합니다. 상층액을 천천히 버리고, 5mL 혈청학적 피펫으로 매우 부드럽게 몇 차례 피펫팅하여 2mL의 iPSC 특이적 배지에 세포를 재현탁시킨 다음, 코팅된 웰에 세포를 시딩합니다.
   3. 플레이트를 빠르게 움직여 웰 표면 전체에 세포를 분산시킵니다. 플레이트를 37 ° C, 5 % CO₂ 인큐베이터에 배양합니다.
   4. 매일 문화 매체를 새로 고칩니다.

3. 내배엽 분화

1. 섹션 2에서 언급한 대로 iPSC를 분리하기 1시간 전에 새 웰 플레이트를 BMM 2로 코팅합니다.
2. 광학 현미경 검사에서 iPSC의 무결성과 생존력을 제어합니다. 미분화 iPSC는 큰 핵, 작은 세포질, 뚜렷한 가장자리를 가진 조밀한 세포 콜로니를 가진 세포입니다.
   참고: 세포 분할을 위한 두 가지 효소 용액이 있습니다. dispase (1 U/mL)를 사용하는 경우, 분화된 세포 영역을 제거해야 합니다. 특정 효소를 사용하는 경우 스크래핑 또는 흡입으로 영역을 수동으로 구별할 필요가 없습니다. 특정 효소를 실온에서 보관하십시오.
3. iPSC 배지를 실온으로 데웁니다. 배지를 흡입하고 DMEM/F-12 또는 D-PBS로 iPSC 플레이트를 헹굽니다. 1mL의 특정 효소를 6-well 플레이트의 한 well에 첨가하고 실온에서 1분 동안 배양한 다음 특정 효소를 흡인하고 37°C에서 5-7분 동안 플레이트를 배양합니다.
   참고: 효소를 사용한 최적의 치료 시간은 사용된 iPSC 라인에 따라 최적화되어야 합니다.
4. 배양 시간 후, 예열된 iPSC 배지 1mL를 추가하고 플레이트 측면을 가볍게 두드려 플레이트 표면에서 미분화 콜로니 응집체를 분리합니다. 응집체의 최적 크기는 50-200 μM입니다.
   1. 5mL 혈청학적 피펫을 사용하여 현탁액을 부드럽게 혼합한 다음 원하는 밀도로 세포 현탁액을 BMM 코팅된 웰에 파종합니다. 37 ° C에서 3-5 일 동안 세포를 배양하여 70 %의 포화도에 도달합니다.
5. 분화를 시작하기 전에 iPSC 배지를 내배엽 배지로 교체합니다(1.1단계). 매일 매체를 새로 고칩니다. 분화 단계에서 세포의 형태학적 변화를 제어합니다. 세포-세포 상호 작용은 분화 후에 나타나기 시작하고 세포는 뾰족한 모양을 얻습니다.

4. eHEPO 설립

1. FACS를 사용하여 EpCAM+ 내배엽 세포를 농축합니다.
   1. 세포 분류 실험 전에 오가노이드 특이적 BMM 바이알 1개( 재료 표 참조)를 얼음 위에서 해동합니다. 세포 분류 실험 전에 조직 배양 플레이트를 37°C에서 밤새 예열합니다.
   2. 내배엽 세포를 1x PBS로 헹굽니다. 트립신 300μL를 넣고 인큐베이터에서 5분 동안 배양합니다. 3mL의 차가운 DMEM-F12를 추가하고 1,000μL 필터 팁이 있는 피펫을 추가하여 단일 세포를 생성합니다.
   3. 15mL 원뿔형 튜브에 세포 현탁액을 수집합니다. 300 x g (실온에서)에서 5분 동안 셀을 원심분리합니다. 상등액을 버리고 펠릿을 10mL의 FACS 완충액으로 세척합니다(단계 1.2).
   4. 단일 셀 현탁액을 만들려면 먼저 100μm 메쉬 스트레이너로 셀을 여과한 다음 40μm 메쉬 스트레이너로 셀을 필터링합니다.
      참고: 스트레이너를 사용하기 전에 1mL의 FACS 버퍼로 스트레이너 표면을 헹굽니다.
   5. 셀 현탁액을 300 x g (실온에서)에서 5분 동안 원심분리합니다. Trypan Blue⁸로 셀 번호를 세십시오.
   6. 염색 비율은 1:11입니다. 예를 들어, 105μL의 FACS 완충액으로 15 x 10⁶ 세포를 재현탁하고 45μL의 FcR과 15μL의 EpCAM을 추가합니다( 재료 표 참조). 40°C에서 10분 동안 세포를 배양하고 튜브를 빛으로부터 보호합니다. 배양 후 500μL의 FACS 완충액을 첨가하여 세포 현탁액을 세척합니다. 300 x g (실온에서)에서 5분 동안 셀을 원심분리합니다.
   7. 펠릿을 500μL의 FACS 완충액에 재현탁합니다. 세포 현탁액에 DAPI(0.5μM/1mL, 최종 농도)를 추가하여 죽은 세포를 정량화합니다. 세포 분류 단계를 시작할 때까지 세포를 얼음 위에 두십시오.
2. EpCAM 및 정렬된 셀을 BMM에 포함합니다. 세포 분류 후 300 x g 에서 5분 동안 세포를 원심분리하여 FACS 완충액을 회수합니다. 상층액을 제거하고 20μL의 BMM에 3,000-5,000개의 세포를 재현탁합니다.
   1. 각 48웰 플레이트의 중앙에 BMM 방울을 추가하여 세포를 파종합니다. BMM이 응고될 때까지 37°C에서 2분 동안 세포를 배양합니다. 플레이트를 조심스럽게 되돌리고 인큐베이터에 10분 더 보관합니다. 액적을 팽창 매체(48웰 플레이트의 경우 웰당 250μL)로 오버레이합니다.
   2. 3일마다 오가노이드 배지를 새로 고칩니다. 10-11일째에는 오가노이드 크기가 100μm보다 커집니다.
3. eHEPO 기계적 해리 및 미분을 수행합니다.
   1. 각 오가노이드 액적을 1:4 비율로 분할합니다. 분리하려면 오가노이드 배지를 버리고 500μL의 차가운 Ad-DMEM/F12를 첨가합니다. 1,000 μL 필터 팁으로 BMM 방울을 격렬하게 피펫팅합니다.
   2. 15mL 코니컬 튜브에 최대 10BMM 방울을 모으고 5mL의 차가운 Ad-DMEM/F12를 추가합니다. 튜브를 얼음 위에 3-5분 동안 두십시오.
   3. 200 x g 에서 4°C에서 5분 동안 셀을 원심분리합니다. 1mL가 남을 때까지 상층액을 폐기합니다. 200 μL 필터 팁을 사용하여 셀 펠릿을 30-40회 격렬하게 피펫팅합니다. 광학 현미경 검사에서 오가노이드 크기를 확인하고 단일 세포 현탁액이 형성되지 않도록 주의합니다.
   4. 기계적 해리 후 5mL의 차가운 Ad-DMEM/F12를 첨가하고 4°C에서 5분 동안 200 x g 의 세포를 원심분리합니다.
   5. 상등액을 버리고 세포가 파종될 때까지 현탁액을 얼음 위에 두십시오.
   6. 50μL BMM 액적(24웰 플레이트의 경우 웰당 35μL BMM + 15μL 세포 및 Ad-DMEM/F-12 포함)을 시딩합니다.
   7. EM 배지에 BMP7(25ng/mL, 재료 표 참조)을 추가하고 3일 동안 배양합니다. 4일차에 배지를 분화 배지로 교체합니다(단계 1.4). 3일마다 배지를 새로 고치고 최소 14일 동안 세포를 배양합니다.

5. eHEPO의 특성화

1. 조직학적 검사를 수행합니다.
   1. 파라핀 임베딩을 수행합니다.
      1. 매체를 제거하고 차가운 1x PBS 1-2mL를 첨가한 다음 차가운 1x PBS에 BMM을 부드럽게 재현탁합니다. 오가노이드를 15mL 원심분리 튜브에 조심스럽게 옮깁니다. 오가노이드가 중력 하에서 가라앉도록 한 다음 PBS를 조심스럽게 흡인합니다. 세탁 단계를 세 번 반복합니다.
      2. 오가노이드에 10mL의 신선한 고정제(10% 중성 완충 포르말린)를 첨가하고 30분 동안 배양합니다. 정착액을 부드럽게 제거하고 차가운 1x PBS 10mL를 첨가한 다음 10분 동안 배양합니다. PBS를 조심스럽게 흡인합니다.
      3. 실온에서 96% 에탄올에 용해된 0.5% 에신( 재료 표 참조) 용액에 오가노이드를 30분 동안 염색합니다.
         참고: 면역 염색을 해야 하는 경우 에오신으로 염색하지 마십시오.
      4. 실온에서 알코올 계열(70% 에탄올, 80% 에탄올 및 96% 에탄올)을 사용하여 각각 5분 동안 세척하여 오가노이드를 탈수합니다. 오가노이드를 100% 에탄올(앱솔루트 에탄올)에 30분 동안 담급니다.
      5. 자일렌( 재료표 참조)을 사용하여 오가노이드를 20분 동안 3회 세척합니다⁹.
         주의 : 크실렌은 독성이 매우 강하고 인화성이 있는 화합물이므로 적절한 안전 장비를 사용하여 취급하십시오. 많은 양의 작업을 피하십시오.
      6. 플라스틱 피펫을 사용하여 용융된 파라핀과 함께 예열된 금속 베이스 몰드( 재료 표 참조)에 오가노이드를 부드럽게 옮깁니다. 65°C 인큐베이터에서 각각 30분 동안 용융된 파라핀에 오가노이드를 3회 보관합니다(변경할 때마다 새로 녹은 파라핀으로 교체).
      7. 그런 다음 오가노이드를 새로운 새 파라핀에 삽입합니다. 오가노이드를 금속 베이스 몰드의 중앙으로 부드럽게 이동합니다.
         참고: 이 단계에서는 파라핀이 실온에서 응고되기 때문에 빠르게 작업하는 것이 중요합니다.
      8. 금속 베이스 몰드를 10-20초 동안 냉각판으로 옮겨 오가노이드를 안정화합니다. 그런 다음 용융된 파라핀을 부어 금속 베이스 몰드를 덮고 라벨링을 위해 금속 베이스 몰드 상단에 티슈 카세트( 재료 표 참조)를 추가합니다. 금형에 파라핀이 충분한지 확인한 다음 냉각판에서 응고시키십시오. 금속 베이스 몰드를 제거합니다.
      9. 표준 마이크로톰을 사용하여 5-7μm 두께의 절편을 절단합니다( 재료 표 참조). 연속 파라핀 절편을 접착 현미경 슬라이드에 놓습니다. 슬라이드를 밤새 말리십시오.
   2. 헤마톡실린 및 에오신(H&E) 및 주기적 산-시프(PAS) 염색을 수행합니다.
      1. 파라핀이 함유된 슬라이드를 63°C 인큐베이터에 하룻밤 동안 넣어 파라핀화를 제거합니다. 다음 날, 슬라이드를 자일렌에 20분 동안 세 번 넣습니다. 슬라이드가 마르지 않도록 하십시오.
      2. 등급이 매겨진 알코올 시리즈(100% 에탄올, 96% 에탄올, 80% 에탄올 및 70% 에탄올)로 슬라이드를 2분 동안 재수화합니다. 그런 다음 슬라이드를 증류수에 1분 동안 넣습니다.
      3. H&E 염색의 경우 다음 단계를 수행하십시오.
      4. 슬라이드를 헤마톡실린 용액에 5분 동안 넣습니다. 흐르는 수돗물에 슬라이드를 5분 동안 헹굽니다. 1% eosin Y 용액( 재료 표 참조)으로 슬라이드를 10초 동안 염색합니다.
      5. 일련의 80% 에탄올, 96% 에탄올, 100% 에탄올을 각각 30초 동안 두 번 변경하여 섹션을 탈수합니다.
      6. 매번 20 분 동안 세 번 지우기를 위해 슬라이드를 자일렌에 넣으십시오.
      7. 장착 매체를 사용하여 유리 슬라이드의 섹션에 커버슬립을 조심스럽게 장착합니다( 재료 표 참조). 거품이 남아 있지 않은지 확인하십시오.
      8. PAS 염색의 경우 5.1.2.4-5.1.2.6 단계를 수행한 다음 Akbari et ^al.10이 보고한 PAS 염색 절차를 수행합니다. 그런 다음 장착 매체를 사용하여 유리 슬라이드의 섹션에 커버 슬립을 조심스럽게 장착합니다. 거품이 남아 있지 않은지 확인하십시오.
   3. 면역조직화학(IHC) 염색을 수행합니다.
      1. H&E 염색 프로토콜에서 5.1.2.1 단계 및 5.1.2.2 단계를 수행합니다.
      2. 전자레인지에서 0.1M 구연산염 완충액(pH 6.0)의 슬라이드를 10분 동안 가열합니다.
      3. 슬라이드가 실온(약 20분)으로 식을 때까지 기다렸다가 슬라이드를 증류수로 헹굽니다.
      4. 슬라이드를 실온에서 10분 동안 메탄올에 넣고 갓 준비한 3% H₂O₂ 에 넣습니다. 그런 다음 슬라이드를 증류수로 1분 동안 헹굽니다.
      5. 실온에서 1시간 동안 차단 용액(2% serum + 0.1% Triton X-100 + 0.1% BSA)으로 절편을 배양하여 primer 항체의 비특이적 결합을 차단합니다.
      6. 차단 용액을 부드럽게 제거하고 차단 용액에 희석된 1차 항체(E-CAD, ALB, EpCAM, A1AT, CK19)( 재료 표 참조)를 4°C에서 밤새 추가합니다.
      7. 다음 날에는 슬라이드를 10분 동안 두 번 조심스럽게 헹굽니다(.
      8. 실온에서 1시간 동안 2차 항체(Goat Anti-Rabbit, Goat Anti-Mouse)( 재료표 참조)를 추가하고 슬라이드를 증류수로 5분(3회) 헹굽니다.
      9. 3'3 디아미노벤지딘 테트라하이드로클로라이드(DAB, 재료표 참조) 용액을 준비합니다(사용 30분 전에 준비해야 함).
      10. DAB 용액을 슬라이드에 1-5분 동안 바르고 슬라이드를 증류수로 5분(3회) 헹굽니다.
      11. 헤마톡실린으로 섹션을 1분 동안 카운터 염색하고 슬라이드를 흐르는 수돗물로 1분 동안 헹굽니다.
      12. 일련의 80% 에탄올, 96% 에탄올, 100% 에탄올을 각각 30초 동안 두 번 변경하여 섹션을 탈수합니다.
      13. 슬라이드를 자일렌에 20분 동안 넣습니다(3회).
      14. 장착 매체를 사용하여 커버 슬립을 유리 슬라이드의 섹션에 조심스럽게 장착합니다. 거품이 남아 있지 않은지 확인하십시오.
   4. OCT 포함을 수행합니다.
      1. 갓 준비한 차가운 4% PFA를 사용하여 4°C에서 밤새 오가노이드를 고정합니다. 정착액을 조심스럽게 제거하고 1x PBS로 15분(3회) 동안 세척합니다.
      2. 증류수를 사용하여 30% 자당 용액(w/v)을 준비합니다. 1x PBS를 제거하고 30% 자당을 첨가하여 오가노이드를 탈수시킵니다.
      3. 오가노이드를 4°C에서 하룻밤 동안 배양합니다. 처음에는 대부분의 조직이 30% 자당으로 떠다니고 투과가 완료되면 가라앉습니다. 이 시점에서 극저온 보호는 완료된 것으로 간주될 수 있습니다.
      4. 포매 공정을 위해 드라이 아이스 또는 액체 질소를 준비합니다.
      5. 2-3방울의 OCT( 재료 표 참조)를 플라스틱 cryomold에 넣습니다. 절단을 위해 오가노이드를 올바른 방향으로 위에 놓습니다.
      6. 천천히 조심스럽게 오가노이드 위에 OCT를 붓습니다. 거품이 생기지 않도록 주의하세요. 오가노이드가 실온에서 10-15분 동안 중력 하에 가라앉도록 합니다.
      7. 동결 단계 전에 cryomolds에 레이블을 지정합니다. 급속 냉동을 위해 드라이 아이스 또는 액체 질소에 곰팡이를 놓습니다. cryomolds를 -80°C로 옮기고 절편 공정이 진행될 때까지 보관합니다.
   5. 면역형광(IF) 염색을 수행합니다.
      1. 동결 단면 염색을 수행합니다.
         1. 실온에서 20-30분 동안 극저온 절편을 자연 건조합니다. 증류수로 슬라이드를 5분(3회) 동안 재수화합니다. pap-pen을 사용하여 조직을 소수성 장벽으로 둘러쌉니다( 재료 표 참조).
         2. 섹션당 200-300 μL의 0.2 % Triton X-100을 추가합니다. 슬라이드를 5분(3회) 동안 조심스럽게 세척합니다. 세탁 단계에서 섹션이 슬라이드에서 떨어지지 않도록 하십시오.
         3. 블로킹 용액(2% 세럼 + 0.1% Triton X-100 + 0.1% BSA)을 실온에서 1시간 동안 첨가합니다.
         4. 온화하게 막는 해결책을 제거하고, 막는 해결책에서 묽게 된 1 차적인 항체 (E-CAD, A1AT, HNF4α)를 추가하십시오 ( 물자 표를 보십시오), 4 °C.On에 밤새 활주를 10 분 동안 (2회) 조심스럽게 헹굽니다.
         5. 적절한 2차 항체(Alexa Fluor 488[마우스], Alexa Fluor 594[마우스], Alexa Fluor 594[토끼])를 실온에서 1시간 동안( 재료 표 참조) 추가하고 슬라이드를 증류수로 5분(3회) 헹굽니다.
         6. 섹션당 100-200μL의 Hoechst 또는 DAPI 핵 염료를 3분 동안 추가하고 1x PBS로 슬라이드를 세척한 다음 세척 단계를 3회 반복합니다.
         7. 페이드 방지 장착 매체를 사용하여 유리 슬라이드의 섹션에 커버 슬립을 장착합니다. 슬라이드를 4°C에서 밤새 보관하고 이미징 프로세스가 진행될 때까지 빛으로부터 보호하십시오.
      2. 전체 마운트 염색을 수행합니다.
         1. 파라핀 임베딩 절차에서 5.1.1.1 단계 및 5.1.1.2 단계를 수행합니다.
         2. 블로킹 용액(1x PBS에 0.1%-1% Triton X-100, 1% DMSO, 1% BSA 및 1% 염소 혈청, 재료 표 참조)을 추가하고 실온에서 2-3시간 동안 블로킹 용액으로 오가노이드를 배양합니다.
         3. 차단액을 부드럽게 제거하고 차단액에 희석한 1차 항체(CK18, CK18, ZO-1, ALB)를 4°C에서 하룻밤 동안 첨가합니다( 재료표 참조).
         4. 다음 날, 용액을 부드럽게 제거하고 1x PBS를 첨가하십시오. 오가노이드가 최대 10분 동안 중력 하에 가라앉도록 합니다. 용액을 조심스럽게 제거하고 세척 단계를 세 번 반복합니다.
         5. 실온에서 최소 1시간 동안 2차 항체(Alexa Fluor 594[마우스], Alexa Fluor 488[토끼], Alexa Fluor 488[마우스])와 함께 오가노이드를 배양합니다. 용액을 조심스럽게 제거하고 세척 단계를 4회 반복합니다.
         6. 핵 염색의 경우 Hoechst 또는 DAPI 핵 염료로 오가노이드를 10분 동안 배양합니다. 1x PBS를 첨가하여 오가노이드를 세척하고 세척 단계를 3회 반복합니다. 오가노이드가 튜브 바닥에 가라앉도록 합니다.
         7. 플라스틱 파스퇴르 피펫을 사용하여 튜브에서 오가노이드를 제거하고 유리 슬라이드에 놓습니다. 오가노이드에 대한 손상을 최소화하면서 수행해야 합니다.
         8. 여분의 PBS를 제거하고 장착 매체의 양(1-2방울)을 추가합니다. 장착 매체를 사용하여 유리 슬라이드의 오가노이드에 커버 슬립을 조심스럽게 장착합니다. 슬라이드를 4°C로 유지하고 이미징 프로세스가 진행될 때까지 빛으로부터 보호하십시오.
2. 전자 현미경을 수행합니다.
   1. 카르노프스키 용액(0.1M 인산나트륨 완충액[소렌센 완충액] 중 2% 완충 글루타르알데히드 + 2% 파라포름알데히드), pH 7.4, 재료 표 참조)을 사용하여 4°C에서 밤새 오가노이드를 고정합니다.
   2. 0.1M Sorenson's buffer + 0.1M sucrose(1:1)로 오가노이드를 15분(3회) 세척합니다. 그런 다음 오가노이드를 2% 인산나트륨 완충 오스뮴 테트록사이드( 재료 표 참조)에 90분 동안 접미사합니다.
   3. 오가노이드를 2%의 따뜻한 한천에 넣습니다. 란셋을 사용하여 오가노이드 주변의 과도한 한천을 잘라냅니다. Sorensen의 완충액에서 오가노이드를 15분(3회) 세척합니다.
   4. 50% 아세톤을 사용하여 15분(2회) 동안 탈수합니다.
   5. 4°C에서 70% 아세톤 + 1% 포스포텅스트산 + 0.5% 우라닐 아세테이트( 재료 표 참조)를 사용하여 밤새 대비합니다.
   6. 다음 날에는 아세톤 시리즈(80% 아세톤, 90% 아세톤, 96% 아세톤, 100% 아세톤)를 사용하여 15분(2회) 동안 오가노이드를 탈수합니다.
   7. 프로필렌 옥사이드를 사용하여 오가노이드를 10분(2회) 동안 세척한 다음 오가노이드를 실온에서 30분 동안 epon:propylene oxide( 재료 표 참조) 혼합물에 넣습니다.
   8. 오가노이드에 새로운 에폰 용액을 첨가하고 4°C에서 밤새 배양합니다.
   9. 다음 날, 새로운 새 에폰 용액을 기본 틀에 넣은 다음 오가노이드를 삽입합니다. 중합을 위해 65°C에서 48시간 동안 인큐베이터에 넣습니다.
   10. 50-100 nm의 단면 두께로 설정된 초박 절편기로 오가노이드 에폰 블록을 자릅니다. 단면을 formvar로 덮인 그리드에 넣습니다.
3. CYP3A4 효소 활성을 측정합니다.
   1. 제조업체의 지침에 따라 시중에서 판매되는 키트( 재료 표 참조)를 사용하여 CYP 활성을 측정합니다.
      참고: CYP 효소는 기질을 검출 가능한 중간 산물 11,12,13으로 변환합니다. CYP 효소 활성을 측정하기 위한 두 가지 옵션(세포 용해성 및 비용해성)이 있습니다. 이 키트는 화합물 처리 후 기초 CYP 활성과 유도된 CYP 활성을 분석하기 위한 애플리케이션을 제공합니다.
   2. 실험을 세 번 실행합니다. 광도계로 발광을 읽고 신호를 계산합니다. 정규화를 위해 오가노이드를 트립신화하고 세포 수를 계산합니다.
4. 인간 알부민 정량화를 수행합니다.
   1. ELISA 검사 24시간 전에 세포 배양 배지를 새 배지로 교체합니다. 24시간 배양 후 세포 배양 배지(300-500μL)를 수집하고 500 x g (4°C)에서 2분 동안 원심분리하여 세포 파편과 입자를 제거합니다. 상층액을 분취하고 샘플을 -80°C(최대 3개월)에서 보관합니다.
   2. 표준 및 샘플을 복제하여 실행합니다. 성숙된 오가노이드는 알부민을 배양 배지로 분비합니다. ELISA 정량 분석 키트로 이 알부민을 정량화합니다( 재료 표 참조). 용액 첨가를 중단한 후 30분 이내에 450nm에서 ELISA 플레이트 리더로 흡광도를 측정합니다. 오가노이드를 트립신화하고 정상화할 세포의 수를 계산합니다.
5. 암모니아 제거 분석을 수행합니다.
   1. 제조업체의 지침에 따라 암모니아 제거 분석을 수행합니다( 재료 표 참조). 간단히 말해서, 1.5 mM NH₄Cl을 배양 배지에 첨가하고 24 시간 동안 배양한다.
   2. 배양 후 암모니아 분석 키트로 암모니아 농도를 측정합니다( 재료 표 참조). 다중 모드 다중 플레이트 리더를 사용하여 측정값을 계산하고 값을 셀 번호로 정규화합니다.
6. 콜릴글리실아미도-플루오레세인(CLF) 분석을 수행합니다.
   1. 간단히 말해서, 오가노이드를 10 μmol/L CLF로 처리하고( 재료 표 참조) 37 °C 인큐베이터에서 1시간 동안 배양합니다. 배양 후 1x PBS로 오가노이드를 세척합니다. 형광 현미경을 사용하여 이미징을 수행합니다.
7. 유전자 발현 분석을 수행합니다.
   1. RNeasy 키트( 재료 표 참조) 지침에 따라 eHEPO에서 총 RNA를 분리합니다.
   2. 제조업체의 지침에 따라 시판되는 마스터 믹스( 재료 표 참조)를 사용하여 PCR 반응을 설정합니다. 각 프라이머 세트에 대한 PCR 혼합물을 준비한 후 각 샘플 10μL를 96웰 qPCR 플레이트에 넣습니다(표 1).
   3. 접착 밀봉기로 플레이트를 밀봉한 다음 실온에서 1,000 x g 에서 2분 동안 플레이트를 원심분리합니다. 플레이트를 PCR 기계에 넣습니다. 상대 유전자 발현을 내부 대조군(RPL41, 표 1)으로 정규화하고 2-ΔΔCt 방법 ¹⁴을 사용하여 분석합니다.

6. eHEPO의 동결 보존

1. 질소 내성 마커로 cryovials를 표시합니다. 냉동 용기의 이소프로판올 수치를 확인하고 실험을 시작하기 전에 15-30분 동안 4°C로 유지하십시오.
2. 1회의 극저온에서 50μL BMM 방울 1개를 동결합니다. 4.3단계에 설명된 대로 오가노이드 역학 해리를 진행합니다. 해리 후 세포 응집체를 500μL의 냉냉 동결 매체에 재현탁시킨 다음 현탁액을 냉동 용기에 부드럽게 옮기고 냉동 용기에 보관합니다.
3. 세포 동결 용기를 -80°C로 옮기고 24시간 후에 장기 보관을 위해 냉동 용기를 액체 질소로 옮깁니다.

7. eHEPO의 해동

1. 수조와 Ad-DMEM/F12를 37°C로 예열합니다.
2. 극저온 장갑을 사용하여 액체 질소 저장소에서 eHEPO 한 바이알을 제거합니다. 얼음 결정이 녹을 때까지 바이알을 37°C 수조에 넣습니다. 세포 현탁액을 15mL 코니컬 튜브로 옮기고 200 x g 에서 4°C에서 5분 동안 원심분리합니다.
3. 상층액을 흡인하고 섹션 4에 설명된 대로 eHEPO를 파종합니다. BMM 액적을 10μM Y-27632가 추가된 팽창 매체로 오버레이합니다( 재료 표 참조). 3일마다 배지를 새로 고치고 3일 후에 ROCK 억제제를 제거합니다.

결과

먼저, 인간 섬유아세포 또는 말초혈액 단핵세포(PBMC) 세포를 배양하고 에피솜 재프로그래밍 을 통해 iPSC로 전환했습니다. 신선한 녹아웃 세럼은 건강한 iPSC를 얻는 데 필수적이었습니다. 그런 다음 iPSC를 50%-60% 포화도로 BMM 코팅된 배양 플레이트에 파종했습니다. 중소형 iPSC 콜로니가 있으면 분화 효율이 향상되었습니다. 그런 다음, iPSC를 5일 동안 Activin A, Wnt3a 및 R-s...

토론

본 프로토콜은 iPSC에서 시작하여 간 오가노이드를 생성, 확장 및 동결/해동하는 포괄적인 방법을 설명합니다. 이 프로토콜은 피더 및 피더 없는 배양에서 iPSC를 배양하고, 2차원 내배엽 분화, FACS 및 오가노이드 형성을 통한 전구 세포 농축, 기능 획득 오가노이드 생성을 포함한 모든 단계를 다룹니다. 또한 오가노이드를 검증하고 특성화하기 위한 자세한 지침도 제공됩니?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
15 mL conical centrifuge tubes	Corning	430052
37 °C water bath	Nüve	210.NB9
37 °C, 5 % CO2 incubator	Memmert	INCO 153
50 mL conical centrifuge tubes	Corning	430290
70 µm and 40 µm Cell strainer	Falcon	352350/ 352340
70% Ethanol	Sigma	1009832511
A1AT	Abcam	ab166610	Dilution: 1/500 (IF), 1/50 (IHC)
A-83.01 (TGF-β inhibitor)	Tocris Biosciene	2939
Acetone	Isolab	9,01,026
Adhesive Microscope Slide	Histobond	C981040
Advanced DMEM-F12	Gibco	12634-010
AFP	Abcam	ab3980	Dilution: 1/25 (IHC)
Agar	EMS	10200
ALB	Abcam	ab10241	Dilution: 1/100 (IF), 1/20 (IHC)
Alexa Flour 488 (Mouse)	Invitrogen	A11001	Dilution: 1/1000 (IF)
Alexa Flour 488 (Rabbit)	Invitrogen	A110034	Dilution: 1/1000 (IF)
Alexa Flour 594 (Mouse)	Invitrogen	A11005	Dilution: 1/1000 (IF)
Alexa flour 594 (Rabbit)	Invitrogen	A11037	Dilution: 1/1000 (IF)
Ammonia Assay Kit	Sigma-Aldrich	MAK-310
Ammonium cloride	Santa Cruz	sc-202936
B27 Supplement 50x	Gibco	12587010
Base mold	Sakura	4216
b-FGF	Peprotech	100-18B
Biosafety, CLASS II,SAFETY CABINET	Thermo	SAFE 2020
Calibrated pipettes	Gilson	F167380
Centrifuge	Eppendorf	5702
Cholylglycylamido-fluorescein	Corning	451041
Citrate Buffer pH 6.0	Bio-optica	15-M103
CK-18	Santa Cruz	sc-51582	Dilution: 1/100 (IF), 1/20 (IHC)
CK-19	Santa Cruz	sc-6278	Dilution: 1/100 (IF), 1/20 (IHC)
Confocal Microscope	Zeiss	LSM880
Cryogenic handling gloves and eye protection	Cryokit	5274
Cryostat	Leica	CM 1950
Cryovial tubes	Corning	430659
DAB	Roche	11718096001
DAPT	Sigma-Aldrich	a5942
Dexamethasone	Sigma-Aldrich	D4902
Dispase	Stem Cell Technologies	7923
DMEM F12	Gibco	31330038
E-CAD	Santa Cruz	sc-8426	Dilution: 1/100 (IF), 1/20 (IHC)
EDTA	Invitrogen	15575-020
Electron Microscope	Zeiss	Sigma500
ELISA kit	Fortis life sciences bethyl	E88-129
Embed 812 Embedding Kit	EMS	14121
Entellan	Merck	107961
Eosin Y %1	Sigma-Aldrich	HT110332
EpCAM	Miltenyi Biotec	130-059-901	Dilution: 1/11 (FACS)
Ethanol	Merck	1,00,98,32,511
Fetal Bovine Serum (FBS)	Gibco	26010066
Forskolin (FSK)	Tocris Biosciene	1099
Freezing container (Mr. Frosty)	Thermo	5100-0001
Freezing Medium	Gibco	12648010
Glass Pasteur pipette	Isolab	084.01.001
Glutamax 100x	Gibco	35050-068
Gluteraldehyde %25, EM grade	EMS	16210-1L
Goat Anti-Mouse HRP	Thermo Fisher	62-6520	Dilution: 1/1000 (IHC)
Goat Anti-Rabbit HRP	Thermo Fisher	31460	Dilution: 1/1000 (IHC)
Goat Serum	Gibco	162-10-072
H2O2	Merck	107209
Hematoxylin	Millipore	HX86017674
HEPES, 1 M	Gibco	15630-056
HNF-4α	Abcam	ab55223	Dilution: 1/50 (IHC)
Ice and dry ice	homemade	homemade
Incubator (65 °C)	Nüve	EN 400
Isopropanol	Sigma-Aldrich	24137
Leu15 Gastrin I human	Sigma-Aldrich	G9145
Luminometer	Berthold Tech	LB 960
Master mix	Applied Biosystems	43676659
Matrigel matrix, hESC-Qualified	Corning	354277
Matrigel matrix, phenol-red-free	Corning	356231
Methanol	Merck	179337
Microcentrifuge tubes	Axygen	321-02-501
Microscope	Zeiss	AXIO VERT A1
Microtome blade	Feather	S35, C35
mTeSR1	Stem Cell Technologies	sc-05850
Multi well suspension culture plates	Sarstedt	83,39,21,500
N2 supplement 100x	Gibco	17502048
N-Acetylcysteine	Sigma-Aldrich	A9165
Neutral Buffered Formalin %10	Tekkim	TK.60161.05001
Nicotinamide	Sigma-Aldrich	N0636
Non-essential Amino Acide (NEAA)	Gibco	11140050
OCT	Tissue-Tek	4583
Osmium tetroxide	EMS	19110
P450-Glo Assays kit	Promega	V9001
Pap-pen	Sigma	Z377821-1EA
Paraffin	Tekkim	TK.200661.01002
PAS stain kit	Abcam	ab150680
PBS	Lonza	be17-516
Penicillin/Streptomycin	Gibco	15630-056
Phosphotungustic acid	Ted Pella	19402
Pipette aid	Axygen	Motopet-1
Plate reader varioskan flash	Thermo	5250040
Prolong Antifade Mountant	Invitrogen	P36980
Propylene Oxide, EM grade	EMS	20401
Real Time PCR system	Applied Biosystems	7500 Fast
Recombinant human Activin A	R&D	338-Ac-050
Recombinant human BMP7	Peprotech	120-03
Recombinant human EGF	Peprotech	af-100-15
Recombinant human FGF10	Peprotech	100-26
Recombinant human FGF19	Peprotech	100-32
Recombinant human HGF	Peprotech	100-39
Rho kinase inhibitor, Y-27632 dihydrochloride	Sigma-Aldrich	Y0503
RNase/DNase free 1.5 mL tube	Axygen	31108101
RNase/DNase free filter tips	Sarstedt	703031255
Rotary Microtome	Leica	RM 2245
RPMI 1640 Medium	Gibco	61870010
Rspo1-conditioned medium	Homemade
Slide master	Bio-optica	15-MEQ001
Sorenson’s Phosphate Buffer	EMS	11600-10
Spinner	Thermo	MY SPIN 6
Sterile serological pipettes	Falcon	357543
Tissue Casette	Leica	3802240
Trimmer	Leica	EM TRIM2
Triton X-100	Thermo Scientific	28314
TrypLE Express Enzyme	Gibco	12605010
Trypsin-EDTA	Gibco	25200-056
Ultramicrotome	Leica	EM UC7
Uranylacetate	EMS	22400
Vortex	Thermo	88880018
Wnt Surrogate-Fc Fusion Protein	ImmunoPrecise	N001
Xylene	Sigma	16446
ZO-1	Invitrogen	40-2200	Dilution: 1/400 (IF)