Génération d’organoïdes hépatiques endodermiques fonctionnels

Résumé

Ce protocole décrit la génération d’organoïdes hépatiques endodermiques rapides et reproductibles (eHEPO). Avec ce protocole, les eHEPO peuvent être produits en 2 semaines et se développer à long terme (plus d’un an) sans perdre leur différenciation et leur fonctionnalité.

Résumé

La technologie des organoïdes nous a permis de générer une variété de mini-structures ressemblant à des organes humains, comme pour le foie, le cerveau et l’intestin, in vitro. Les progrès remarquables réalisés dans les modèles d’organoïdes ont récemment ouvert une nouvelle ère expérimentale pour diverses applications dans la modélisation des maladies, la biologie du développement et la découverte de médicaments. Les organoïdes hépatiques dérivés de cellules souches adultes ou de cellules souches pluripotentes induites (iPSC) régissent la génération d’hépatocytes à utiliser pour diverses applications. Ici, nous présentons un protocole robuste et reproductible pour générer des organoïdes hépatiques à partir de cellules souches pluripotentes. Ce protocole est applicable aux cellules saines et dérivées de patients. Pour obtenir des organoïdes hépatiques dérivés de l’endoderme 3D (eHEPO), les iPSC ont d’abord été directement différenciées en cellules endodermiques, puis des cellules EpCAM positives enrichies en FACS (EpCAM+) ont été utilisées pour établir des organoïdes hépatiques à l’aide du milieu d’expansion. Nous fournissons une méthode rapide et efficace pour générer des organoïdes hépatiques en 2 semaines. Les organoïdes générés imitent les propriétés et les fonctions essentielles des hépatocytes, telles que la sécrétion d’albumine, le stockage du glycogène et l’activité enzymatique du cytochrome P450. Outre les similitudes d’expression génique spécifiques au foie, les eHEPO comprennent des cellules épithéliales polarisées avec des canalicules biliaires entre les deux. De plus, les eHEPO peuvent être élargis et des passages en série à long terme (1 an) sans perdre leur capacité à se différencier en hépatocytes matures. Ainsi, les eHEPO fournissent une source alternative pour produire des hépatocytes fonctionnels.

Introduction

Les organoïdes sont des structures miniaturisées ressemblant à des organes cultivées dans des conditions de culture tridimensionnelles qui imitent le microenvironnement de l’organe et incluent les facteurs intrinsèques nécessaires à l’auto-organisation et à l’auto-renouvellement dans le développement de l’organe lui-même. Les organoïdes peuvent être dérivés soit de cellules souches pluripotentes (CSP), soit de cellules dérivées de tissus adultes (cellules souches ou cellules progénitrices⁾¹. Bien que leur organisation précise semblable à celle d’un organe et leur similitude fonctionnelle avec l’organe spécifique en fassent des outils précieux pour la modélisation des maladies, ils doivent encore être améliorés en termes de standardisation en culture. En particulier, plusieurs protocoles ont été publiés pour la génération d’organoïdes hépatiques, et ils diffèrent par leur complexité et leur reproductibilité². Par exemple, les organoïdes des bourgeons hépatiques développés par Takebe et al. prennent la forme de structures denses et multicellulaires contenant les cellules souches pluripotentes induites (iPSC) suivantes : progéniteurs endodermiques hépatiques, cellules endothéliales de la veine ombilicale humaine (HUVEC) et cellules souches mésenchymateuses (MSC). Cependant, ces organoïdes n’ont pas de capacité d’auto-renouvellement à long terme ^3,4.

D’un point de vue historique, Huch et al. ont d’abord rapporté la production d’organoïdes épithéliales hépatiques humains dérivés de tissus adultes, dans lesquels les cellules se polarisent et se spécialisent pour reproduire des aspects de l’épithélium natif⁵. Ensuite, Guan et al. ont utilisé des organoïdes hépatiques dérivés d’iPSC pour modéliser le syndrome d’Alagille (ALGS), une maladie génétique rare associée à une réduction des voies biliaires dans le foie⁶. Ces deux organoïdes ont une capacité d’auto-renouvellement et peuvent acquérir des fonctions hépatocytaires matures, telles que la sécrétion de bile et d’albumine, le stockage du glycogène et la détoxification des médicaments spécifiques au foie. Dans une étude récente, Ramli et al. ont présenté un modèle d’organoïde hépatique dérivé de la CSP contenant des réseaux de canalicules biliaires fonctionnels entre des cellules hépatocytaires polarisées (HLC) qui vident les médicaments cholestatiques dans des kystes biliaires composés de cellules cholangiocytaires (CLC)⁷.

Cette étude présente une culture unique pour générer des organoïdes hépatiques endodermiques dérivés d’iPSC, appelés eHEPO. La culture et la différenciation des iPSC dans l’endoderme sont décrites étape par étape, et la génération d’eHEPO à partir de progéniteurs EpCAM+ enrichis est démontrée. Enfin, la caractérisation de la fonctionnalité et de l’organisation structurale des eHEPOs, ainsi que la cryoconservation des organoïdes, sont décrites.

Protocole

Les autorisations relatives aux étapes expérimentales ont été obtenues auprès du comité local d’éthique de la recherche clinique de la faculté de médecine de l’Université Dokuz Eylul (2013/25-4, 12 mai 2013 ; 2016/30-29, 24 novembre 2016).

1. Préparation de solutions pour la culture cellulaire

1. Préparez le milieu de différenciation de l’endoderme en mélangeant les composants suivants dans une hotte à flux laminaire : 1 % B27, 100 ng/mL d’Activine A, Wnt3a ou 30 % wnt3a-CM, et R-spo1 ou 10 % R-spo1-CM (voir le tableau des matériaux).
2. Préparez le tampon de tri cellulaire activé par fluorescence (FACS) avec la composition suivante : PBS, 1 mM EDTA, 25 mM HEPES, 1 % FBS.
3. Préparez le milieu d’expansion (EM) : 1 % de N2, 1 % de B27, 1,25 mM de N-acétyl-L-cystéine, 50 ng/mL d’EGF, 10 % de milieu conditionné R-spo1, 100 ng/mL de FGF 10, 10 mM de nicotinamide, 5 μM d’A8301 et 10 μM de forskoline (FSK) dans Advanced DMEM/F-12. Ajouter 10 nM Y-27632 et 0,3 nM WNT3a (voir le tableau des matériaux).
   REMARQUE : Conservez le milieu complet pendant un maximum de 2 semaines à 2-8 °C.
4. Préparez le milieu de différenciation (DM) : 1 % N2, 1 % B27, 10 nM de gastrine, 50 ng/mL d’EGF, 100 ng/mL de FGF 10, 25 ng/mL de HGF, 500 nM d’A8301, 10 μM de DAPT, 25 ng/mL de BMP7 et 30 μM de dexaméthasone dans Ad-DMEM/F-12 (voir le tableau des matériaux).
   REMARQUE : Conservez le milieu complet pendant 2 semaines à 2-8 °C.

2. Décongélation des iPSC sur la plaque sans chargeur

1. Enduisez la plaque de culture cellulaire d’une matrice à membrane basale (BMM).
   1. Décongeler un flacon d’une aliquote de BMM pendant la nuit sur de la glace ou au moins 2 h avant de commencer l’enrobage. Ajouter 6 ml de DMEM/F-12 froid dans un tube conique de 15 ml, ajouter immédiatement 80 μL de BMM décongelé et bien mélanger.
   2. Utilisez des plaques de puits traitées pour la culture tissulaire, enduisez la plaque de culture de solution BMM et distribuez-la pour couvrir la surface de la plaque de puits. Incuber la plaque dans un incubateur à 37 °C pendant au moins 1 h avant de l’utiliser. Après le temps d’incubation, jetez la solution BMM et ajoutez immédiatement le milieu spécifique à l’iPSC.
2. Retirer un flacon d’iPSC du stockage de l’azote liquide à l’aide de gants cryogéniques. Placez immédiatement le flacon sur un support à tube flottant et plongez-le dans un bain-marie à 37 °C jusqu’à ce que les cristaux de glace aient fondu.
   1. Retirez le flacon du bain-marie et essuyez soigneusement l’extérieur avec de l’éthanol à 70 %. Ensuite, placez-le dans le capot laminaire. Il est important d’être rapide à cette étape.
   2. Dans des conditions aseptiques, dans un capuchon laminaire, transférez les cellules décongelées dans un tube conique stérile de 15 mL contenant 5 mL de milieu spécifique aux iPSC.
      1. Centrifuger les cellules à 200 × g (à température ambiante) pendant 3 min. Jetez lentement le surnageant, remettez les cellules en suspension dans 2 mL de milieu spécifique des iPSC en pipetant très doucement à quelques reprises avec une pipette sérologique de 5 mL, et ensemencez les cellules dans les puits enrobés.
   3. Déplacez rapidement la plaque pour disperser les cellules sur toute la surface du puits. Incuber la plaque dans l’incubateur à 37 °C, 5 % de CO₂ .
   4. Rafraîchissez le milieu de culture tous les jours.

3. Différenciation de l’endoderme

1. Enduire une nouvelle plaque de puits de BMM 1 h avant de fendre les iPSC, comme mentionné dans la section 2.
2. Contrôler l’intégrité et la viabilité des CSPi sous microscopie optique. Les iPSC indifférenciées sont des cellules avec de gros noyaux, un cytoplasme petit et des colonies cellulaires compactes avec des bords distincts.
   REMARQUE : Il existe deux solutions enzymatiques pour diviser les cellules. Dans le cas de l’utilisation de la dispase (1 U/mL), les zones de cellules différenciées doivent être éliminées. Si une enzyme spécifique est utilisée, il n’est pas nécessaire de différencier manuellement les régions par grattage ou aspiration. Conservez l’enzyme spécifique à température ambiante.
3. Réchauffez le milieu iPSC à température ambiante. Aspirez le fluide et rincez la plaque iPSC avec DMEM/F-12 ou D-PBS. Ajouter 1 mL de l’enzyme spécifique dans un puits d’une plaque à 6 puits, incuber pendant 1 min à température ambiante, puis aspirer l’enzyme spécifique et incuber la plaque à 37 °C pendant 5 à 7 min.
   REMARQUE : Le temps de traitement optimal avec des enzymes doit être optimisé en fonction de la ligne iPSC utilisée.
4. Après le temps d’incubation, ajoutez 1 mL de milieu iPSC préchauffé et tapotez doucement le côté de la plaque pour détacher les agrégats de colonies indifférenciés de la surface de la plaque. La taille optimale des agrégats est de 50 à 200 μM.
   1. À l’aide d’une pipette sérologique de 5 mL, mélangez délicatement la suspension, puis ensemencez la suspension cellulaire à la densité souhaitée dans le puits enrobé de BMM. Incuber les cellules à 37 °C pendant 3 à 5 jours pour atteindre une confluence de 70 %.
5. Avant de commencer la différenciation, remplacez le milieu iPSC par le milieu endodermique (étape 1.1). Rafraîchissez le support tous les jours. Contrôler les changements morphologiques des cellules pendant les étapes de différenciation. Les interactions cellule-cellule commencent à apparaître après la différenciation, et les cellules acquièrent une forme hérissée.

4. Etablissement eHEPO

1. Effectuer l’enrichissement des cellules endodermiques EpCAM+ avec FACS.
   1. Décongelez un flacon de BMM spécifique à l’organoïde (voir le tableau des matériaux) sur de la glace avant l’expérience de tri cellulaire. Préchauffez les plaques de culture tissulaire à 37 °C pendant la nuit avant l’expérience de tri cellulaire.
   2. Rincez les cellules de l’endoderme avec 1x PBS. Ajouter 300 μL de trypsine et incuber pendant 5 min dans l’incubateur. Ajouter 3 ml de DMEM-F12 froid et pipeter avec des pointes filtrantes de 1 000 μL pour générer des cellules uniques.
   3. Recueillir la suspension cellulaire dans un tube conique de 15 ml. Centrifuger les cellules à 300 x g (à température ambiante) pendant 5 min. Jetez le surnageant et lavez la pastille avec 10 ml de tampon FACS (étape 1.2).
   4. Pour fabriquer une suspension unicellulaire, filtrez d’abord les cellules à l’aide d’une crépine à mailles de 100 μm, puis d’une crépine à mailles de 40 μm.
      REMARQUE : Avant d’utiliser la passoire, rincez la surface de la passoire avec 1 mL de tampon FACS.
   5. Centrifuger la suspension cellulaire à 300 x g (à température ambiante) pendant 5 min. Comptez le numéro de portable avec Trypan Blue⁸.
   6. Le rapport de coloration est de 1:11. Par exemple, mettez en suspension 15 x 10⁶ cellules avec 105 μL de tampon FACS, et ajoutez 45 μL de FcR et 15 μL d’EpCAM (voir le tableau des matériaux). Incuber les cellules pendant 10 min à 40 °C, et protéger le tube de la lumière. Après l’incubation, ajoutez 500 μL de tampon FACS pour laver la suspension cellulaire. Centrifuger les cellules à 300 x g (à température ambiante) pendant 5 min.
   7. Remettre la pastille en suspension dans 500 μL de tampon FACS. Ajouter du DAPI (0,5 μM/1 mL, concentration finale) à la suspension cellulaire pour quantifier les cellules mortes. Gardez les cellules sur de la glace jusqu’au début de l’étape de tri des cellules.
2. Intégrez l’EpCAM et les cellules triées dans BMM. Après le tri des cellules, centrifugez les cellules à 300 x g pendant 5 min pour prélever le tampon FACS. Retirez le surnageant et remettez en suspension 3 000 à 5 000 cellules dans 20 μL de BMM.
   1. Ensemencez les cellules en ajoutant une gouttelette de BMM au centre de chaque plaque de 48 puits. Incuber les cellules pendant 2 min à 37 °C jusqu’à ce que le BMM soit solidifié. Retournez soigneusement la plaque et conservez-la dans l’incubateur pendant encore 10 min. Superposez la gouttelette avec le milieu d’expansion (250 μL par puits pour une plaque de 48 puits).
   2. Rafraîchissez le milieu organoïde tous les 3 jours. Aux jours 10-11, la taille de l’organoïde sera supérieure à 100 μm.
3. Effectuer la dissociation mécanique et la différenciation eHEPO.
   1. Divisez chaque gouttelette d’organoïde dans un rapport de 1:4. Pour fendre, jeter le milieu organoïde et ajouter 500 μL d’Ad-DMEM/F12 froid. Avec des pointes filtrantes de 1 000 μL, pipetez vigoureusement les gouttelettes de BMM.
   2. Prélever un maximum de 10 gouttelettes de BMM dans des tubes coniques de 15 mL et ajouter 5 mL d’Ad-DMEM/F12 froid. Gardez le tube sur de la glace pendant 3 à 5 min.
   3. Centrifuger les cellules à 200 x g pendant 5 min à 4 °C. Jeter le surnageant jusqu’à ce qu’il reste 1 ml. Pipetez vigoureusement la pastille de cellule 30 à 40 fois à l’aide d’embouts filtrants de 200 μL. Vérifiez la taille de l’organoïde au microscope optique, en évitant soigneusement la formation d’une suspension unicellulaire.
   4. Après dissociation mécanique, ajouter 5 mL d’Ad-DMEM/F12 froid, et centrifuger les cellules à 200 x g pendant 5 min à 4 °C.
   5. Jetez le surnageant et maintenez la suspension sur la glace jusqu’à l’ensemencement des cellules.
   6. Ensemencer une gouttelette de 50 μL de BMM (contenant 35 μL de BMM + 15 μL de cellules et Ad-DMEM/F-12 par puits pour une plaque de 24 puits).
   7. Ajouter du BMP7 (25 ng/mL, voir le tableau des matériaux) au milieu EM et cultiver pendant 3 jours. Le jour 4, remplacez le milieu par le milieu de différenciation (étape 1.4). Rafraîchissez le milieu tous les 3 jours et cultivez les cellules pendant au moins 14 jours.

5. Caractérisation des eHEPO

1. Effectuer des examens histologiques.
   1. Effectuez l’enrobage de paraffine.
      1. Retirez le fluide, ajoutez 1 à 2 ml de PBS froid et remettez doucement le BMM en suspension dans le froid 1x PBS. Transférez délicatement les organoïdes dans un tube à centrifuger de 15 ml. Laissez les organoïdes se déposer sous l’effet de la gravité, puis aspirez soigneusement le PBS. Répétez l’étape de lavage trois fois.
      2. Ajouter 10 ml de fixateur frais (10 % de formol tamponné neutre) aux organoïdes et incuber pendant 30 min. Retirez délicatement le fixateur, ajoutez 10 ml de PBS froid et incubez pendant 10 min. Aspirez soigneusement le PBS.
      3. Colorer les organoïdes dans une solution d’éosine à 0,5 % (voir tableau des matériaux) dissoute dans de l’éthanol à 96 % pendant 30 min à température ambiante.
         REMARQUE : Si une immunocoloration doit être effectuée, ne pas colorer avec de l’éosine.
      4. Déshydratez les organoïdes en les lavant à l’aide d’une série d’alcool (70 % d’éthanol, 80 % d’éthanol et 96 % d’éthanol) pendant 5 minutes chacun à température ambiante. Faites tremper les organoïdes dans de l’éthanol à 100 % (éthanol absolu) pendant 30 min.
      5. Nettoyez les organoïdes à l’aide de xylène (voir le tableau des matériaux) trois fois pendant 20 min à chaque fois⁹.
         ATTENTION : Le xylène est un composé très toxique et inflammable, alors manipulez-le à l’aide d’un équipement de sécurité approprié. Évitez de travailler en grande quantité.
      6. Transférez délicatement les organoïdes dans un moule à base métallique préchauffé (voir le tableau des matériaux) avec de la paraffine fondue à l’aide d’une pipette en plastique. Maintenez les organoïdes dans de la paraffine fondue trois fois pendant 30 minutes chacune dans un incubateur à 65 °C (remplacez-le par de la paraffine fraîche fondue à chaque changement).
      7. Ensuite, incorporez les organoïdes dans de la nouvelle paraffine fraîche. Déplacez doucement les organoïdes au milieu du moule de base métallique.
         REMARQUE : Pour cette étape, il est crucial de travailler rapidement car la paraffine se solidifie à température ambiante.
      8. Transférez le moule de base métallique sur la plaque froide pendant 10 à 20 s pour stabiliser les organoïdes. Ensuite, versez de la paraffine fondue pour couvrir le moule à base métallique et ajoutez une cassette de tissu (voir le tableau des matériaux) sur le dessus du moule à base métallique pour l’étiquetage. Assurez-vous qu’il y a suffisamment de paraffine dans le moule, puis laissez-les se solidifier sur la plaque froide. Retirez le moule de base en métal.
      9. Coupez des sections de 5 à 7 m d’épaisseur à l’aide d’un microtome standard (voir le tableau des matériaux). Placez des coupes de paraffine en série sur des lames de microscope adhésives. Laissez sécher les lames pendant la nuit.
   2. Effectuer une coloration à l’hématoxyline et à l’éosine (H&E) et à l’acide périodique (PAS).
      1. Placez les lames enrobées de paraffine dans un incubateur à 63 °C pendant la nuit pour la déparaffinisation. Le lendemain, placez les lames dans du xylène trois fois pendant 20 minutes à chaque fois. Ne laissez pas les lames se dessécher.
      2. Réhydratez les lames avec une série d’alcool gradué (100 % d’éthanol, 96 % d’éthanol, 80 % d’éthanol et 70 % d’éthanol) pendant 2 min. Ensuite, placez les lames dans l’eau distillée pendant 1 min.
      3. Pour la coloration H&E, effectuez les étapes suivantes.
      4. Mettez les lames dans une solution d’hématoxyline pendant 5 min. Rincez les lames à l’eau courante du robinet pendant 5 min. Teintez les lames avec une solution d’éosine Y à 1 % (voir le tableau des matériaux) pendant 10 s.
      5. Déshydratez les sections avec une série de 80 % d’éthanol, 96 % d’éthanol et deux changements de 100 % d’éthanol pendant 30 s chacun.
      6. Mettez les lames dans le xylène pour le dégagement trois fois pendant 20 minutes à chaque fois.
      7. Montez soigneusement les lamelles sur les sections des lames de verre à l’aide d’un support de montage (voir le tableau des matériaux). Assurez-vous qu’il n’y a plus de bulles.
      8. Pour la coloration au PAS, effectuer les étapes 5.1.2.4 à 5.1.2.6, suivies des procédures de coloration au PAS rapportées par Akbari et ^coll.10. Montez ensuite soigneusement les lamelles sur les sections des lames de verre avec le support de montage. Assurez-vous qu’il n’y a plus de bulles.
   3. Effectuer une coloration immunohistochimique (IHC).
      1. Effectuez les étapes 5.1.2.1 et 5.1.2.2 dans le protocole de coloration H&E.
      2. Chauffer les lames dans un tampon de citrate de 0,1 M (pH 6,0) au micro-ondes pendant 10 min.
      3. Maintenez jusqu’à ce que les lames refroidissent à température ambiante (environ 20 min) et rincez les lames à l’eau distillée.
      4. Mettez les lames dans du méthanol à 3 %_{H 2}O₂ fraîchement préparées pendant 10 min à température ambiante. Ensuite, rincez les lames à l’eau distillée pendant 1 min.
      5. Bloquer la liaison non spécifique des anticorps d’amorce en incubant les sections avec une solution bloquante (2 % de sérum + 0,1 % de Triton X-100 + 0,1 % de BSA) à température ambiante pendant 1 h.
      6. Retirez délicatement la solution bloquante et ajoutez les anticorps primaires (E-CAD, ALB, EpCAM, A1AT, CK19) (voir le tableau des matériaux) dilués dans la solution bloquante à 4 °C pendant la nuit.
      7. Le lendemain, rincez soigneusement les lames deux fois pendant 10 min (.
      8. Ajouter les anticorps secondaires (Anti-Lapin de Chèvre, Anti-Souris de Chèvre) (voir le Tableau des Matières) pendant 1 h à température ambiante, et rincer les lames à l’eau distillée pendant 5 min (trois fois).
      9. Préparez une solution de tétrachlorhydrate de diaminobenzidine 3'3 (DAB, voir le tableau des matériaux) (celle-ci doit être préparée 30 min avant utilisation).
      10. Appliquez la solution DAB sur les lames pendant 1 à 5 minutes et rincez les lames à l’eau distillée pendant 5 minutes (trois fois).
      11. Contre-tachez les sections avec de l’hématoxyline pendant 1 min, et rincez les lames à l’eau courante du robinet pendant 1 min.
      12. Déshydratez les sections avec une série de 80 % d’éthanol, 96 % d’éthanol et deux changements de 100 % d’éthanol pendant 30 s chacun.
      13. Mettez les lames dans du xylène pendant 20 minutes (trois fois).
      14. Montez soigneusement la lamelle sur la section de la glissière de verre à l’aide d’un support de montage. Assurez-vous qu’il n’y a plus de bulles.
   4. Effectuez l’intégration OCT.
      1. Fixez les organoïdes à l’aide d’un froid à 4 % de PFA fraîchement préparé pendant la nuit à 4 °C. Retirez délicatement le fixateur et lavez-le avec 1x PBS pendant 15 minutes (trois fois).
      2. Préparez une solution de saccharose à 30 % (p/v) avec de l’eau distillée. Retirez le 1x PBS et ajoutez les 30 % de saccharose pour déshydrater les organoïdes.
      3. Incuber les organoïdes à 4 °C pendant la nuit. Au départ, la plupart des tissus flottent dans 30 % de saccharose et coulent une fois la perméation terminée. La cryoprotection peut être considérée comme complète à ce stade.
      4. Préparez de la glace sèche ou de l’azote liquide pour le processus d’enrobage.
      5. Mettez deux à trois gouttes d’OCT (voir le tableau des matériaux) dans des cryomoules en plastique. Placez les organoïdes sur le dessus dans le bon sens pour la coupe.
      6. Versez lentement et soigneusement l’OCT sur les organoïdes. Attention à éviter les bulles. Laissez les organoïdes se déposer sous l’effet de la gravité pendant 10 à 15 minutes à température ambiante.
      7. Étiquetez les cryomoules avant l’étape de congélation. Placez les moules sur de la glace carbonique ou de l’azote liquide pour une congélation rapide. Transférez les cryomoules à -80 °C et stockez-les là-bas jusqu’au processus de sectionnement.
   5. Effectuer une coloration par immunofluorescence (FI).
      1. Effectuer la coloration de la section congelée.
         1. Faites sécher les sections cryogéniques à l’air libre pendant 20 à 30 minutes à température ambiante. Réhydratez les lames avec de l’eau distillée pendant 5 minutes (trois fois). Entourez le tissu d’une barrière hydrophobe à l’aide d’un stylo (voir le tableau des matériaux).
         2. Ajouter 200 à 300 μL de Triton X-100 à 0,2 % par section. Lavez soigneusement les lames pendant 5 minutes (trois fois). Assurez-vous que les sections ne tombent pas des glissières pendant les étapes de lavage.
         3. Ajouter une solution bloquante (2 % de sérum + 0,1 % de Triton X-100 + 0,1 % de BSA) pendant 1 h à température ambiante.
         4. Retirer délicatement la solution bloquante, ajouter les anticorps primaires (E-CAD, A1AT, HNF4α) dilués dans la solution bloquante (voir le tableau des matières), et incuber les lames pendant une nuit à 4 °C.Le lendemain, rincer soigneusement les lames pendant 10 min (deux fois).
         5. Ajoutez des anticorps secondaires appropriés (Alexa Fluor 488 [souris], Alexa Fluor 594 [souris], Alexa Fluor 594 [lapin]) pendant 1 h à température ambiante (voir le tableau des matériaux), et rincez les lames à l’eau distillée pendant 5 minutes (trois fois).
         6. Ajoutez 100 à 200 μL de colorant nucléaire Hoechst ou DAPI par section pendant 3 min, lavez les lames avec 1x PBS et répétez l’étape de lavage trois fois.
         7. Montez les lamelles sur les sections sur des lames de verre à l’aide d’un support de montage anti-décoloration. Conservez les lames pendant la nuit à 4 °C et protégez-les de la lumière jusqu’au processus d’imagerie.
      2. Effectuez une coloration sur l’ensemble du montage.
         1. Effectuez les étapes 5.1.1.1 et 5.1.1.2 de la procédure d’enrobage de paraffine.
         2. Ajoutez une solution bloquante (0,1 % à 1 % de Triton X-100, 1 % de DMSO, 1 % de BSA et 1 % de sérum de chèvre dans 1x PBS, voir le tableau des matériaux), et incubez les organoïdes avec une solution de blocage pendant 2-3 h à température ambiante.
         3. Retirez délicatement la solution bloquante et ajoutez les anticorps primaires (CK19, CK18, ZO-1, ALB) dilués dans la solution bloquante pendant une nuit à 4 °C (voir le tableau des matières).
         4. Le lendemain, retirez délicatement la solution et ajoutez 1x PBS. Laissez les organoïdes se déposer sous gravité jusqu’à 10 min. Retirez la solution avec précaution et répétez l’étape de lavage trois fois.
         5. Incuber les organoïdes avec les anticorps secondaires (Alexa Fluor 594 [souris], Alexa Fluor 488 [lapin], Alexa Fluor 488 [souris]) pendant au moins 1 h à température ambiante. Retirez la solution avec précaution et répétez l’étape de lavage quatre fois.
         6. Pour la coloration nucléaire, incubez les organoïdes avec un colorant nucléaire Hoechst ou DAPI pendant 10 min. Lavez les organoïdes en ajoutant 1x PBS et répétez l’étape de lavage trois fois. Laissez les organoïdes se déposer au fond du tube.
         7. À l’aide d’une pipette Pasteur en plastique, retirez les organoïdes du tube et placez-les sur des lames de verre. Assurez-vous de le faire avec un minimum de dommages aux organoïdes.
         8. Retirez l’excès de PBS et ajoutez une quantité (une à deux gouttes) de support de montage. Montez soigneusement les lamelles sur les organoïdes des lames de verre avec le support de montage. Maintenez les lames à 4 °C et protégez-les de la lumière jusqu’au processus d’imagerie.
2. Effectuer la microscopie électronique.
   1. Fixer les organoïdes à l’aide d’une solution de Karnovsky (glutaraldéhyde tamponné à 2,5 % + paraformaldéhyde à 2 % dans un tampon de phosphate de sodium à 0,1 M [tampon de Sorensen], pH 7,4, voir le tableau des matériaux) pendant une nuit à 4 °C.
   2. Lavez les organoïdes avec 0,1 M de tampon de Sorenson + 0,1 M de saccharose (1:1) pendant 15 min (trois fois). Ensuite, postfixer les organoïdes dans du tétroxyde d’osmium tamponné au phosphate de sodium à 2 % (voir le tableau des matières) pendant 90 min.
   3. Incorporez les organoïdes dans de l’agar chaud à 2 %. Coupez l’excès de gélose autour des organoïdes à l’aide d’une lancette. Lavez les organoïdes dans le tampon de Sorensen pendant 15 minutes (trois fois).
   4. Déshydrater avec de l’acétone à 50 % pendant 15 min (deux fois).
   5. Contraste pendant la nuit avec 70 % d’acétone + 1 % d’acide phosphotungstique + 0,5 % d’acétate d’uranyle (voir le tableau des matières) à 4 °C.
   6. Le lendemain, déshydratez les organoïdes à l’aide d’une série d’acétones (80 % d’acétone, 90 % d’acétone, 96 % d’acétone et 100 % d’acétone) pendant 15 minutes (deux fois).
   7. Éliminez les organoïdes à l’aide d’oxyde de propylène pendant 10 min (deux fois), puis mettez les organoïdes dans un mélange épon : oxyde de propylène (voir le tableau des matériaux) pendant 30 min à température ambiante.
   8. Ajoutez une nouvelle solution d’épon aux organoïdes et incubez une nuit à 4 °C.
   9. Le lendemain, mettez une nouvelle solution d’épon fraîche dans le moule de base, puis incorporez les organoïdes. Mettre dans un incubateur pendant 48 h à 65 °C pour la polymérisation.
   10. Coupez les blocs d’épon organoïde à l’aide d’un ultramicrotome réglé sur une épaisseur de section de 50 à 100 nm. Mettez les sections pour former des grilles couvertes.
3. Mesurez l’activité de l’enzyme CYP3A4.
   1. Mesurez l’activité du CYP à l’aide d’une trousse disponible dans le commerce (voir le tableau des matériaux) en suivant les instructions du fabricant.
      REMARQUE : Les enzymes CYP convertissent le substrat en un produit intermédiaire détectable 11,12,13. Il existe deux options (lytique cellulaire et non lytique) pour mesurer l’activité de l’enzyme CYP. Le kit fournit une application pour analyser les activités basales du CYP et les activités induites du CYP après un traitement composé.
   2. Exécutez l’expérience en trois exemplaires. Lire la luminescence à l’aide d’un luminomètre et calculer le signal. Pour normaliser, essayez de tester les organoïdes et comptez le nombre de cellules.
4. Effectuer la quantification de l’albumine humaine.
   1. Remplacez le milieu de culture cellulaire par un milieu frais 24 h avant le test ELISA. Après 24 h d’incubation, prélever le milieu de culture cellulaire (300-500 μL) et centrifuger à 500 x g (à 4 °C) pendant 2 min pour éliminer les débris et les particules cellulaires. Aliquote le surnageant et conservez les échantillons à −80 °C (jusqu’à 3 mois).
   2. Exécutez la norme et l’exemple en double. Les organoïdes matures sécrètent de l’albumine dans le milieu de culture ; quantifier cette albumine à l’aide d’un kit de quantification ELISA (voir la Table des matières). Mesurez l’absorbance à l’aide d’un lecteur de plaques ELISA à 450 nm dans les 30 minutes suivant l’arrêt de l’ajout de solution. Trypsinisez les organoïdes, et comptez le nombre de cellules à normaliser.
5. Effectuez le test d’élimination de l’ammoniac.
   1. Effectuez le test d’élimination de l’ammoniac en suivant les instructions du fabricant (voir le tableau des matériaux). En bref, ajouter 1,5 mM de NH₄Cl dans le milieu de culture et incuber pendant 24 h.
   2. Après l’incubation, déterminez la concentration d’ammoniac à l’aide d’un kit de dosage de l’ammoniac (voir le tableau des matériaux). Calculez les mesures à l’aide d’un lecteur multimode multiplaques et normalisez les valeurs en fonction des numéros de cellule.
6. Effectuez le dosage de la cholylglycylamido-fluorescéine (CLF).
   1. Traiter brièvement les organoïdes avec 10 μmol/L de CLF (voir le Tableau des matières), et incuber pendant 1 h dans un incubateur à 37 °C. Après l’incubation, lavez les organoïdes avec 1x PBS. Effectuer l’imagerie à l’aide de la microscopie à fluorescence.
7. Effectuer une analyse de l’expression génique.
   1. Suivez les instructions du kit RNeasy (voir la table des matériaux) pour isoler l’ARN total des eHEPO.
   2. Mettre en place la réaction PCR à l’aide d’un mélange maître disponible dans le commerce (voir le tableau des matériaux), en suivant les instructions du fabricant. Après avoir préparé le mélange de PCR pour chaque ensemble d’amorces, placez 10 μL de chaque échantillon dans les plaques de qPCR à 96 puits (tableau 1).
   3. Scellez les plaques avec un scellant adhésif, puis centrifugez-les à 1 000 x g pendant 2 min à température ambiante. Chargez les plaques dans une machine PCR. Normaliser l’expression génique relative à un contrôle interne (RPL41, Tableau 1) et analyser à l’aide de la méthode 2−ΔΔCt ¹⁴.

6. Cryoconservation des eHEPO

1. Étiquetez les cryoflacons avec un marqueur résistant à l’azote. Vérifiez le niveau d’isopropanol du récipient de congélation et maintenez-le à 4 °C pendant 15 à 30 minutes avant de commencer l’expérience.
2. Congelez une gouttelette de 50 μL de BMM dans un flacon cryogénique. Procéder à la dissociation mécanique des organoïdes comme décrit à l’étape 4.3. Après dissociation, remettre en suspension l’agrégat cellulaire dans 500 μL de fluide de congélation à froid, puis transférer doucement la suspension dans des cryoflacons et les conserver dans le récipient de congélation.
3. Transférez le récipient de congélation cellulaire à −80 °C et, après 24 h, transférez les cryoflacons dans de l’azote liquide pour un stockage à long terme.

7. Dégel des eHEPO

1. Préchauffez un bain-marie et Ad-DMEM/F12 à 37 °C.
2. Retirez un flacon d’eHEPO du stockage d’azote liquide à l’aide de gants cryogéniques. Placez le flacon dans un bain-marie à 37 °C jusqu’à ce que les cristaux de glace aient fondu. Transférez la suspension cellulaire dans un tube conique de 15 mL et centrifugez à 200 x g pendant 5 min à 4 °C.
3. Aspirez le surnageant et procédez à l’ensemencement des eHEPO comme décrit à la section 4. Superposez la gouttelette BMM avec le milieu d’expansion complété par 10 μM Y-27632 (voir le tableau des matériaux). Rafraîchissez le milieu tous les 3 jours et retirez l’inhibiteur de ROCK après 3 jours.

Résultats

Tout d’abord, des cellules de fibroblastes humains ou de cellules mononucléées du sang périphérique (PBMC) ont été cultivées et converties en iPSC par reprogrammation épisomale. Le sérum frais était essentiel pour obtenir des iPSC saines. Ensuite, les iPSC ont été ensemencés dans les plaques de culture recouvertes de BMM avec une confluence de 50 à 60 %. Le fait d’avoir des colonies d’iPSC de taille petite à moyenne a amélioré l’efficacité de la différ...

Discussion

Le présent protocole décrit une méthode complète de génération, d’expansion et de congélation/décongélation d’organoïdes hépatiques à partir d’iPSC. Ce protocole couvre toutes les étapes, y compris la culture des iPSC sur la culture nourricière et sans nourricière, la différenciation bidimensionnelle de l’endoderme, l’enrichissement des cellules progénitrices avec le FACS et la formation d’organoïdes, et la génération d’organoïdes qui gagnent en fonctio...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
15 mL conical centrifuge tubes	Corning	430052
37 °C water bath	Nüve	210.NB9
37 °C, 5 % CO2 incubator	Memmert	INCO 153
50 mL conical centrifuge tubes	Corning	430290
70 µm and 40 µm Cell strainer	Falcon	352350/ 352340
70% Ethanol	Sigma	1009832511
A1AT	Abcam	ab166610	Dilution: 1/500 (IF), 1/50 (IHC)
A-83.01 (TGF-β inhibitor)	Tocris Biosciene	2939
Acetone	Isolab	9,01,026
Adhesive Microscope Slide	Histobond	C981040
Advanced DMEM-F12	Gibco	12634-010
AFP	Abcam	ab3980	Dilution: 1/25 (IHC)
Agar	EMS	10200
ALB	Abcam	ab10241	Dilution: 1/100 (IF), 1/20 (IHC)
Alexa Flour 488 (Mouse)	Invitrogen	A11001	Dilution: 1/1000 (IF)
Alexa Flour 488 (Rabbit)	Invitrogen	A110034	Dilution: 1/1000 (IF)
Alexa Flour 594 (Mouse)	Invitrogen	A11005	Dilution: 1/1000 (IF)
Alexa flour 594 (Rabbit)	Invitrogen	A11037	Dilution: 1/1000 (IF)
Ammonia Assay Kit	Sigma-Aldrich	MAK-310
Ammonium cloride	Santa Cruz	sc-202936
B27 Supplement 50x	Gibco	12587010
Base mold	Sakura	4216
b-FGF	Peprotech	100-18B
Biosafety, CLASS II,SAFETY CABINET	Thermo	SAFE 2020
Calibrated pipettes	Gilson	F167380
Centrifuge	Eppendorf	5702
Cholylglycylamido-fluorescein	Corning	451041
Citrate Buffer pH 6.0	Bio-optica	15-M103
CK-18	Santa Cruz	sc-51582	Dilution: 1/100 (IF), 1/20 (IHC)
CK-19	Santa Cruz	sc-6278	Dilution: 1/100 (IF), 1/20 (IHC)
Confocal Microscope	Zeiss	LSM880
Cryogenic handling gloves and eye protection	Cryokit	5274
Cryostat	Leica	CM 1950
Cryovial tubes	Corning	430659
DAB	Roche	11718096001
DAPT	Sigma-Aldrich	a5942
Dexamethasone	Sigma-Aldrich	D4902
Dispase	Stem Cell Technologies	7923
DMEM F12	Gibco	31330038
E-CAD	Santa Cruz	sc-8426	Dilution: 1/100 (IF), 1/20 (IHC)
EDTA	Invitrogen	15575-020
Electron Microscope	Zeiss	Sigma500
ELISA kit	Fortis life sciences bethyl	E88-129
Embed 812 Embedding Kit	EMS	14121
Entellan	Merck	107961
Eosin Y %1	Sigma-Aldrich	HT110332
EpCAM	Miltenyi Biotec	130-059-901	Dilution: 1/11 (FACS)
Ethanol	Merck	1,00,98,32,511
Fetal Bovine Serum (FBS)	Gibco	26010066
Forskolin (FSK)	Tocris Biosciene	1099
Freezing container (Mr. Frosty)	Thermo	5100-0001
Freezing Medium	Gibco	12648010
Glass Pasteur pipette	Isolab	084.01.001
Glutamax 100x	Gibco	35050-068
Gluteraldehyde %25, EM grade	EMS	16210-1L
Goat Anti-Mouse HRP	Thermo Fisher	62-6520	Dilution: 1/1000 (IHC)
Goat Anti-Rabbit HRP	Thermo Fisher	31460	Dilution: 1/1000 (IHC)
Goat Serum	Gibco	162-10-072
H2O2	Merck	107209
Hematoxylin	Millipore	HX86017674
HEPES, 1 M	Gibco	15630-056
HNF-4α	Abcam	ab55223	Dilution: 1/50 (IHC)
Ice and dry ice	homemade	homemade
Incubator (65 °C)	Nüve	EN 400
Isopropanol	Sigma-Aldrich	24137
Leu15 Gastrin I human	Sigma-Aldrich	G9145
Luminometer	Berthold Tech	LB 960
Master mix	Applied Biosystems	43676659
Matrigel matrix, hESC-Qualified	Corning	354277
Matrigel matrix, phenol-red-free	Corning	356231
Methanol	Merck	179337
Microcentrifuge tubes	Axygen	321-02-501
Microscope	Zeiss	AXIO VERT A1
Microtome blade	Feather	S35, C35
mTeSR1	Stem Cell Technologies	sc-05850
Multi well suspension culture plates	Sarstedt	83,39,21,500
N2 supplement 100x	Gibco	17502048
N-Acetylcysteine	Sigma-Aldrich	A9165
Neutral Buffered Formalin %10	Tekkim	TK.60161.05001
Nicotinamide	Sigma-Aldrich	N0636
Non-essential Amino Acide (NEAA)	Gibco	11140050
OCT	Tissue-Tek	4583
Osmium tetroxide	EMS	19110
P450-Glo Assays kit	Promega	V9001
Pap-pen	Sigma	Z377821-1EA
Paraffin	Tekkim	TK.200661.01002
PAS stain kit	Abcam	ab150680
PBS	Lonza	be17-516
Penicillin/Streptomycin	Gibco	15630-056
Phosphotungustic acid	Ted Pella	19402
Pipette aid	Axygen	Motopet-1
Plate reader varioskan flash	Thermo	5250040
Prolong Antifade Mountant	Invitrogen	P36980
Propylene Oxide, EM grade	EMS	20401
Real Time PCR system	Applied Biosystems	7500 Fast
Recombinant human Activin A	R&D	338-Ac-050
Recombinant human BMP7	Peprotech	120-03
Recombinant human EGF	Peprotech	af-100-15
Recombinant human FGF10	Peprotech	100-26
Recombinant human FGF19	Peprotech	100-32
Recombinant human HGF	Peprotech	100-39
Rho kinase inhibitor, Y-27632 dihydrochloride	Sigma-Aldrich	Y0503
RNase/DNase free 1.5 mL tube	Axygen	31108101
RNase/DNase free filter tips	Sarstedt	703031255
Rotary Microtome	Leica	RM 2245
RPMI 1640 Medium	Gibco	61870010
Rspo1-conditioned medium	Homemade
Slide master	Bio-optica	15-MEQ001
Sorenson’s Phosphate Buffer	EMS	11600-10
Spinner	Thermo	MY SPIN 6
Sterile serological pipettes	Falcon	357543
Tissue Casette	Leica	3802240
Trimmer	Leica	EM TRIM2
Triton X-100	Thermo Scientific	28314
TrypLE Express Enzyme	Gibco	12605010
Trypsin-EDTA	Gibco	25200-056
Ultramicrotome	Leica	EM UC7
Uranylacetate	EMS	22400
Vortex	Thermo	88880018
Wnt Surrogate-Fc Fusion Protein	ImmunoPrecise	N001
Xylene	Sigma	16446
ZO-1	Invitrogen	40-2200	Dilution: 1/400 (IF)