Generación de organoides hepáticos endodérmicos funcionales

Resumen

Este protocolo describe la generación de organoides hepáticos endodérmicos (eHEPOs) rápidos y reproducibles. Con este protocolo, los eHEPOs pueden producirse en 2 semanas y expandirse a largo plazo (más de 1 año) sin perder su diferenciación y funcionalidad.

Resumen

La tecnología de organoides nos ha permitido generar una variedad de miniestructuras similares a órganos humanos, como para el hígado, el cerebro y el intestino, in vitro. Los notables avances en los modelos de organoides han abierto recientemente una nueva era experimental para diversas aplicaciones en el modelado de enfermedades, la biología del desarrollo y el descubrimiento de fármacos. Las células madre adultas o los organoides hepáticos derivados de células madre pluripotentes inducidas (iPSC) gobiernan la generación de hepatocitos para su uso en diversas aplicaciones. Aquí, presentamos un protocolo robusto y reproducible para generar organoides hepáticos a partir de células madre pluripotentes. Este protocolo es aplicable a células sanas y derivadas del paciente. Para lograr organoides hepáticos derivados del endodermo 3D (eHEPO), las iPSC se diferenciaron primero directamente en células endodérmicas y, a continuación, se utilizaron células EpCAM positivas (EpCAM+) enriquecidas con FACS para establecer organoides hepáticos utilizando el medio de expansión. Proporcionamos un método rápido y eficiente para generar organoides hepáticos en 2 semanas. Los organoides generados imitan las propiedades y funciones esenciales de los hepatocitos, como la secreción de albúmina, el almacenamiento de glucógeno y la actividad de la enzima citocromo P450. Además de las similitudes en la expresión génica específica del hígado, los eHEPO comprenden células epiteliales polarizadas con canalículos biliares en el medio. Además, las eHEPOs pueden expandirse y pasar en serie a largo plazo (1 año) sin perder su capacidad de diferenciarse en hepatocitos maduros. Por lo tanto, los eHEPO proporcionan una fuente alternativa para producir hepatocitos funcionales.

Introducción

Los organoides son estructuras miniaturizadas similares a órganos que crecen en condiciones de cultivo tridimensionales que imitan el microambiente del órgano e incluyen los factores intrínsecos necesarios para la autoorganización y la autorrenovación en el propio desarrollo del órgano. Los organoides pueden derivarse de células madre pluripotentes (PSC) o de células adultas derivadas de tejidos (células madre o progenitoras)¹. Aunque su organización precisa similar a la de un órgano y su similitud funcional con el órgano específico los convierten en herramientas valiosas para el modelado de enfermedades, aún necesitan más mejoras en términos de estandarización en el cultivo. En particular, se han publicado varios protocolos para la generación de organoides hepáticos, que difieren en su complejidad y reproducibilidad². Por ejemplo, los organoides de las yemas hepáticas desarrollados por Takebe et al. toman la forma de estructuras densas y multicelulares que contienen las siguientes células madre pluripotentes inducidas (iPSC): progenitores endodérmicos hepáticos, células endoteliales de la vena umbilical humana (HUVEC) y células madre mesenquimales (MSC). Sin embargo, estos organoides no tienen capacidad de autorrenovación a largo plazo ^3,4.

Desde una perspectiva histórica, Huch et al. informaron por primera vez de la producción de organoides epiteliales hepáticos humanos derivados de tejido adulto, en los que las células se polarizan y se especializan para reproducir aspectos del epitelio nativo⁵. Luego, Guan et al. utilizaron organoides hepáticos derivados de iPSC para modelar el síndrome de Alagille (ALGS), un trastorno genético raro asociado con la reducción del conducto biliar dentro del hígado⁶. Ambos organoides tienen capacidad de autorrenovación y pueden adquirir funciones de hepatocitos maduros, como la secreción de bilis y albúmina, el almacenamiento de glucógeno y la desintoxicación de fármacos específicos del hígado. En un estudio reciente, Ramli et al. introdujeron un modelo de organoide hepático derivado de PSC que contiene redes funcionales de canalículos biliares entre células polarizadas similares a los hepatocitos (HLC) que vacían los fármacos colestásicos en quistes biliares compuestos por células similares a los colangiocitos (CLC)⁷.

Este estudio presenta un cultivo único para generar organoides hepáticos endodérmicos derivados de iPSC, llamados eHEPOs. Se describe paso a paso el cultivo y la diferenciación en iPSC en endodermo, y se demuestra la generación de eHEPOs a partir de progenitores de EpCAM+ enriquecidos. Finalmente, se describe la caracterización de la funcionalidad y organización estructural de los eHEPOs, así como la criopreservación de los organoides.

Protocolo

Los permisos relacionados con los pasos experimentales se obtuvieron del Comité de Ética de Investigación Clínica local de la Facultad de Medicina de la Universidad Dokuz Eylul (2013/25-4, 12 de mayo de 2013; 2016/30-29, 24 de noviembre de 2016).

1. Preparación de soluciones para el cultivo celular

1. Prepare el medio de diferenciación del endodermo mezclando los siguientes componentes en una campana de flujo laminar: 1% B27, 100 ng/mL de Activina A, Wnt3a o 30% de wnt3a-CM y R-spo1 o 10% de R-spo1-CM (ver la Tabla de Materiales).
2. Prepare el tampón de clasificación celular activado por fluorescencia (FACS) con la siguiente composición: PBS, 1 mM EDTA, 25 mM HEPES, 1% FBS.
3. Prepare el medio de expansión (EM): 1% N2, 1% B27, 1,25 mM N-acetil-L-cisteína, 50 ng/mL de EGF, 10% de medio acondicionado R-spo1, 100 ng/mL de FGF 10, 10 mM de nicotinamida, 5 μM de A8301 y 10 μM de forskolina (FSK) en Advanced DMEM/F-12. Agregue 10 nM Y-27632 y 0.3 nM WNT3a (ver la Tabla de Materiales).
   NOTA: Mantener el medio completo durante un máximo de 2 semanas a 2-8 °C.
4. Prepare el medio de diferenciación (MS): 1% N2, 1% B27, 10 nM gastrina, 50 ng/mL EGF, 100 ng/mL FGF 10, 25 ng/mL HGF, 500 nM A8301, 10 μM DAPT, 25 ng/mL BMP7 y 30 μM de dexametasona en Ad-DMEM/F-12 (ver la Tabla de Materiales).
   NOTA: Mantener el medio completo durante 2 semanas a 2-8 °C.

2. Descongelación de las iPSC en la placa sin alimentador

1. Cubra la placa de cultivo celular con matriz de membrana basal (BMM).
   1. Descongele un vial de una alícuota de BMM durante la noche sobre hielo o al menos 2 horas antes de comenzar el recubrimiento. Agregue 6 mL de DMEM/F-12 frío en un tubo cónico de 15 mL, agregue inmediatamente 80 μL de BMM descongelado y mezcle bien.
   2. Utilice placas de pocillos tratadas con cultivo de tejidos, cubra la placa de cultivo con una solución de BMM y dispense para cubrir la superficie de la placa de pocillos. Incubar la placa en una incubadora a 37 °C durante al menos 1 h antes de su uso. Después del tiempo de incubación, deseche la solución de BMM e inmediatamente agregue el medio específico de iPSC.
2. Retire un vial de iPSC del almacenamiento de nitrógeno líquido con guantes criogénicos. Coloque inmediatamente el vial en una rejilla de tubos flotantes y sumerja la rejilla en un baño de agua a 37 °C hasta que los cristales de hielo se hayan derretido.
   1. Retire el vial del baño de agua y limpie a fondo el exterior con etanol al 70%. A continuación, colócalo en la campana laminar. Es importante ser rápido en este paso.
   2. En condiciones asépticas, en una campana laminar, transfiera las células descongeladas a un tubo cónico estéril de 15 mL que contenga 5 mL de medio específico para iPSC.
      1. Centrifugar las células a 200 × g (a temperatura ambiente) durante 3 min. Deseche el sobrenadante lentamente, vuelva a suspender las células en 2 mL de medio específico para iPSC pipeteando muy suavemente unas cuantas veces con una pipeta serológica de 5 mL y siembre las células en los pocillos recubiertos.
   3. Mueva la placa rápidamente para dispersar las celdas por toda la superficie del pocillo. Incubar la placa en la incubadora a 37 °C, 5% de CO₂ .
   4. Refresque el medio de cultivo todos los días.

3. Diferenciación del endodermo

1. Cubra una nueva placa de pocillo con BMM 1 h antes de dividir las iPSC, como se mencionó en la sección 2.
2. Controlar la integridad y viabilidad de las iPSCs bajo microscopía óptica. Las iPSC indiferenciadas son células con núcleos grandes, citoplasma pequeño y colonias celulares compactas con bordes distintos.
   NOTA: Hay dos soluciones enzimáticas para dividir las células. En el caso de utilizar dispasa (1 U/mL), se deben eliminar áreas de células diferenciadas. Si se utiliza una enzima específica, no es necesario diferenciar manualmente las regiones con raspado o succión. Mantenga la enzima específica a temperatura ambiente.
3. Caliente el medio iPSC a temperatura ambiente. Aspire el medio y enjuague la placa iPSC con DMEM/F-12 o D-PBS. Agregue 1 mL de la enzima específica a un pocillo de una placa de 6 pocillos, incube durante 1 min a temperatura ambiente y luego aspire la enzima específica, e incube la placa a 37 °C durante 5-7 min.
   NOTA: El tiempo óptimo de tratamiento con enzimas debe optimizarse en función de la línea iPSC utilizada.
4. Después del tiempo de incubación, agregue 1 mL de medio iPSC precalentado y golpee suavemente el costado de la placa para separar los agregados de colonias indiferenciadas de la superficie de la placa. El tamaño óptimo de los agregados es de 50-200 μM.
   1. Con una pipeta serológica de 5 mL, mezcle suavemente la suspensión y, a continuación, siembre la suspensión celular a la densidad deseada en el pocillo recubierto de BMM. Incubar las células a 37 °C durante 3-5 días para alcanzar una confluencia del 70%.
5. Antes de iniciar la diferenciación, sustituya el medio iPSC por el medio endodermo (paso 1.1). Refresca el medio todos los días. Controlar los cambios morfológicos de las células durante las etapas de diferenciación. Las interacciones célula-célula comienzan a aparecer después de la diferenciación, y las células adquieren una forma puntiaguda.

4. Establecimiento de eHEPO

1. Realizar el enriquecimiento de las células endodérmicas EpCAM+ con FACS.
   1. Descongele un vial de BMM específico de organoide (consulte la Tabla de materiales) en hielo antes del experimento de clasificación de células. Precalentar las placas de cultivo de tejidos a 37 °C durante la noche antes del experimento de clasificación de células.
   2. Enjuague las células del endodermo con 1x PBS. Añadir 300 μL de tripsina e incubar durante 5 min en la incubadora. Agregue 3 mL de DMEM-F12 frío y pipetee con puntas de filtro de 1.000 μL para generar celdas individuales.
   3. Recoja la suspensión celular en un tubo cónico de 15 mL. Centrifugar las celdas a 300 x g (a temperatura ambiente) durante 5 min. Deseche el sobrenadante y lave el pellet con 10 mL de tampón FACS (paso 1.2).
   4. Para hacer una suspensión de una sola célula, filtre las células primero con un colador de malla de 100 μm y luego con un filtro de malla de 40 μm.
      NOTA: Antes de usar el colador, enjuague la superficie del colador con 1 mL de tampón FACS.
   5. Centrifugar la suspensión de la célula a 300 x g (a temperatura ambiente) durante 5 min. Cuente el número de celda con Trypan Blue⁸.
   6. La proporción de tinción es de 1:11. Por ejemplo, vuelva a suspender 15 x 10⁶ celdas con 105 μL de tampón FACS y agregue 45 μL de FcR y 15 μL de EpCAM (consulte la Tabla de materiales). Incubar las células durante 10 minutos a 40 °C y proteger el tubo de la luz. Después de la incubación, añadir 500 μL de tampón FACS para lavar la suspensión celular. Centrifugar las celdas a 300 x g (a temperatura ambiente) durante 5 min.
   7. Vuelva a suspender el pellet en 500 μL de tampón FACS. Añadir DAPI (0,5 μM/1 mL, concentración final) a la suspensión celular para cuantificar las células muertas. Mantenga las celdas en hielo hasta que comience el paso de clasificación de celdas.
2. Incruste la EpCAM y las celdas ordenadas en BMM. Después de la clasificación de las células, centrifugar las células a 300 x g durante 5 minutos para extraer el tampón FACS. Retire el sobrenadante y vuelva a suspender 3.000-5.000 células en 20 μL de BMM.
   1. Siembre las células agregando una gota de BMM al centro de cada placa de 48 pocillos. Incubar las células durante 2 min a 37 °C hasta que el BMM se solidifique. Vuelva a colocar la placa con cuidado y manténgala en la incubadora durante otros 10 minutos. Superponga la gota con el medio de expansión (250 μL por pocillo para una placa de 48 pocillos).
   2. Refresque el medio organoide cada 3 días. A los días 10-11, el tamaño del organoide será superior a 100 μm.
3. Realizar la disociación y diferenciación mecánica de eHEPO.
   1. Divida cada gota de organoide en una proporción de 1:4. Para dividir, deseche el medio organoide y agregue 500 μL de Ad-DMEM/F12 frío. Con puntas de filtro de 1.000 μL, pipetee vigorosamente las gotas de BMM.
   2. Recoja un máximo de 10 gotas de BMM en tubos cónicos de 15 mL y agregue 5 mL de Ad-DMEM/F12 frío. Mantenga el tubo en hielo durante 3-5 minutos.
   3. Centrifugar las células a 200 x g durante 5 min a 4 °C. Deseche el sobrenadante hasta que quede 1 mL. Pipetear enérgicamente el pellet de la célula 30-40 veces con puntas de filtro de 200 μL. Verifique el tamaño del organoide bajo microscopía óptica, evitando cuidadosamente la formación de una suspensión unicelular.
   4. Después de la disociación mecánica, añadir 5 mL de Ad-DMEM/F12 frío y centrifugar las células a 200 x g durante 5 min a 4 °C.
   5. Deseche el sobrenadante y mantenga la suspensión en el hielo hasta sembrar las células.
   6. Siembre una gota de BMM de 50 μL (que contiene 35 μL de BMM + 15 μL de células y Ad-DMEM/F-12 por pocillo para una placa de 24 pocillos).
   7. Añadir BMP7 (25 ng/mL, ver la Tabla de Materiales) al medio EM y cultivar durante 3 días. En el día 4, reemplace el medio con el medio de diferenciación (paso 1.4). Refresque el medio cada 3 días y cultive las células durante al menos 14 días.

5. Caracterización de los eHEPOs

1. Realizar exámenes histológicos.
   1. Realizar la incrustación de parafina.
      1. Retire el medio, agregue 1-2 mL de PBS frío 1x y vuelva a suspender suavemente el BMM en el 1x PBS frío. Transfiera con cuidado los organoides a un tubo de centrífuga de 15 ml. Deje que los organoides se asienten bajo la gravedad y luego aspire cuidadosamente el PBS. Repita el paso de lavado tres veces.
      2. Añadir 10 mL de fijador fresco (10% de formalina tamponada neutra) a los organoides e incubar durante 30 min. Retire suavemente el fijador, agregue 10 ml de PBS frío 1x e incube durante 10 minutos. Aspire con cuidado el PBS.
      3. Tiñir los organoides en una solución de eosina al 0,5% (ver Tabla de Materiales) disuelta en etanol al 96% durante 30 min a temperatura ambiente.
         NOTA: Si se va a realizar una inmunotinción, no se tiñe con eosina.
      4. Deshidrate los organoides lavándolos con una serie de alcohol (70% de etanol, 80% de etanol y 96% de etanol) durante 5 minutos cada uno a temperatura ambiente. Remojar los organoides en etanol al 100% (etanol absoluto) durante 30 min.
      5. Limpie los organoides con xileno (consulte la Tabla de materiales) tres veces durante 20 minutos cada vez⁹.
         PRECAUCIÓN: El xileno es un compuesto muy tóxico e inflamable, así que manéjelo con el equipo de seguridad adecuado. Evite trabajar en grandes cantidades.
      6. Transfiera suavemente los organoides a un molde de base de metal precalentado (consulte la Tabla de materiales) con parafina fundida utilizando una pipeta de plástico. Mantenga los organoides en parafina fundida tres veces durante 30 minutos cada una en una incubadora a 65 °C (reemplácela con parafina fresca derretida nueva en cada cambio).
      7. Luego, incruste los organoides en parafina fresca nueva. Mueva los organoides suavemente hacia el centro del molde de base de metal.
         NOTA: Para este paso, es crucial trabajar rápidamente porque la parafina se solidifica a temperatura ambiente.
      8. Transfiera el molde de base metálica a la placa fría durante 10-20 s para estabilizar los organoides. Luego, vierta parafina fundida para cubrir el molde de base de metal y agregue un casete de pañuelo (consulte la Tabla de materiales) en la parte superior del molde de base de metal para etiquetar. Asegúrese de que haya suficiente parafina en el molde y luego deje que se solidifiquen en la placa fría. Retire el molde de base de metal.
      9. Corte secciones de 5-7 μm de grosor con un micrótomo estándar (consulte la Tabla de materiales). Coloque secciones de parafina en serie en portaobjetos adhesivos de microscopio. Deja que los portaobjetos se sequen durante la noche.
   2. Realice tinción con hematoxilina y eosina (H&E) y ácido peryódico-Shiff (PAS).
      1. Coloque los portaobjetos incrustados en parafina en una incubadora a 63 °C durante la noche para la desparafinación. Al día siguiente, coloque los portaobjetos en xileno tres veces durante 20 minutos cada vez. No permita que los portaobjetos se sequen.
      2. Rehidrate los portaobjetos con una serie de alcohol graduada (100% etanol, 96% etanol, 80% etanol y 70% etanol) durante 2 min. Luego, coloque los portaobjetos en el agua destilada durante 1 minuto.
      3. Para la tinción de H&E, realice los siguientes pasos.
      4. Coloque los portaobjetos en una solución de hematoxilina durante 5 min. Enjuague los portaobjetos con agua corriente del grifo durante 5 minutos. Teñir los portaobjetos con una solución de eosina Y al 1% (ver Tabla de Materiales) durante 10 s.
      5. Deshidratar las secciones con una serie de etanol al 80%, etanol al 96% y dos cambios de etanol al 100% durante 30 s cada uno.
      6. Coloque los portaobjetos en el xileno para limpiarlo tres veces durante 20 minutos cada vez.
      7. Monte con cuidado los cubreobjetos en las secciones de los portaobjetos de vidrio con un medio de montaje (consulte la Tabla de materiales). Asegúrate de que no queden burbujas.
      8. Para la tinción de PAS, realice los pasos 5.1.2.4-5.1.2.6, seguidos de los procedimientos para la tinción de PAS según lo informado por Akbari et ^al.10. A continuación, monte con cuidado los cubreobjetos en las secciones de las guías de vidrio con el medio de montaje. Asegúrate de que no queden burbujas.
   3. Realizar la tinción de inmunohistoquímica (IHQ).
      1. Realice los pasos 5.1.2.1 y 5.1.2.2 en el protocolo de tinción de H&E.
      2. Calentar los portaobjetos en tampón de citrato 0,1 M (pH 6,0) en el microondas durante 10 min.
      3. Sostenga hasta que los portaobjetos se enfríen a temperatura ambiente (aproximadamente 20 minutos) y enjuague los portaobjetos con agua destilada.
      4. Coloque los portaobjetos en metanol al 3% H₂O₂ recién preparados durante 10 minutos a temperatura ambiente. Luego, enjuague los portaobjetos en agua destilada durante 1 minuto.
      5. Bloquear la unión inespecífica de los anticuerpos del cebador incubando las secciones con una solución de bloqueo (2% de suero + 0,1% Triton X-100 + 0,1% BSA) a temperatura ambiente durante 1 h.
      6. Retire suavemente la solución de bloqueo y añada los anticuerpos primarios (E-CAD, ALB, EpCAM, A1AT, CK19) (consulte la tabla de materiales) diluidos en la solución de bloqueo a 4 °C durante la noche.
      7. Al día siguiente, enjuague los portaobjetos cuidadosamente dos veces durante 10 minutos (.
      8. Añadir los anticuerpos secundarios (Cabra Anti-Conejo, Cabra Anti-Ratón) (ver Tabla de Materiales) durante 1 h a temperatura ambiente, y enjuagar los portaobjetos en agua destilada durante 5 min (tres veces).
      9. Prepare la solución de tetraclorhidrato de diaminobenzidina (DAB, consulte la tabla de materiales) (debe prepararse 30 minutos antes de usar).
      10. Aplique la solución de DAB a los portaobjetos durante 1-5 minutos y enjuague los portaobjetos con agua destilada durante 5 minutos (tres veces).
      11. Contramanche las secciones con hematoxilina durante 1 minuto y enjuague los portaobjetos con agua corriente del grifo durante 1 minuto.
      12. Deshidratar las secciones con una serie de etanol al 80%, etanol al 96% y dos cambios de etanol al 100% durante 30 s cada uno.
      13. Coloque los portaobjetos en xileno durante 20 minutos (tres veces).
      14. Monte con cuidado el cubreobjetos en la sección del portaobjetos de vidrio con un medio de montaje. Asegúrate de que no queden burbujas.
   4. Realizar la incrustación de OCT.
      1. Fije los organoides con PFA al 4% frío recién preparado durante la noche a 4 °C. Retire con cuidado el fijador y lave con 1x PBS durante 15 minutos (tres veces).
      2. Prepare una solución de sacarosa al 30% (p/v) con agua destilada. Retire el 1x PBS y agregue el 30% de sacarosa para deshidratar los organoides.
      3. Incubar los organoides a 4 °C durante la noche. Inicialmente, la mayoría de los tejidos flotarán en un 30% de sacarosa y se hundirán una vez que se complete la permeación. La crioprotección puede considerarse completa en este punto.
      4. Prepare hielo seco o nitrógeno líquido para el proceso de incrustación.
      5. Coloque dos o tres gotas de OCT (consulte la Tabla de materiales) en criomoldes de plástico. Coloque los organoides en la parte superior en la orientación correcta para cortar.
      6. Vierta lenta y cuidadosamente el OCT sobre los organoides. Tenga cuidado de evitar las burbujas. Deje que los organoides se asienten bajo la gravedad durante 10-15 minutos a temperatura ambiente.
      7. Etiquete los criomoldes antes de la etapa de congelación. Coloque los moldes sobre hielo seco o nitrógeno líquido para una congelación rápida. Transfiera los criomoldes a -80 °C y guárdelos allí hasta el proceso de seccionado.
   5. Realizar la tinción de inmunofluorescencia (IF).
      1. Realice la tinción de secciones congeladas.
         1. Seque al aire las secciones criogénicas durante 20-30 minutos a temperatura ambiente. Rehidrata los portaobjetos con agua destilada durante 5 min (tres veces). Rodea el tejido con una barrera hidrofóbica usando un bolígrafo (ver la Tabla de Materiales).
         2. Añadir 200-300 μL de Triton X-100 al 0,2 % por sección. Lave cuidadosamente los portaobjetos durante 5 minutos (tres veces). Asegúrese de que las secciones no se caigan de los portaobjetos durante los pasos de lavado.
         3. Añadir solución de bloqueo (2% de suero + 0,1% Triton X-100 + 0,1% BSA) durante 1 h a temperatura ambiente.
         4. Retire suavemente la solución de bloqueo, añada los anticuerpos primarios (E-CAD, A1AT, HNF4α) diluidos en la solución de bloqueo (consulte la tabla de materiales) e incube los portaobjetos durante la noche a 4 °C. Al día siguiente, enjuague los portaobjetos cuidadosamente durante 10 min (dos veces).
         5. Añada anticuerpos secundarios adecuados (Alexa Fluor 488 [Mouse], Alexa Fluor 594 [Mouse], Alexa Fluor 594 [Rabbit]) durante 1 h a temperatura ambiente (consulte la Tabla de materiales) y enjuague los portaobjetos en agua destilada durante 5 min (tres veces).
         6. Agregue 100-200 μL de colorante nuclear Hoechst o DAPI por sección durante 3 minutos, lave los portaobjetos con 1x PBS y repita el paso de lavado tres veces.
         7. Monte los cubreobjetos en las secciones de los portaobjetos de vidrio con un medio de montaje antidecoloración. Mantenga los portaobjetos durante la noche a 4 °C y protéjalos de la luz hasta el proceso de obtención de imágenes.
      2. Realice la tinción de montaje completo.
         1. Realice los pasos 5.1.1.1 y 5.1.1.2 en el procedimiento de inclusión de parafina.
         2. Agregue la solución de bloqueo (0.1%-1% Triton X-100, 1% DMSO, 1% BSA y 1% de suero de cabra en 1x PBS, consulte la Tabla de Materiales) e incube los organoides con solución de bloqueo durante 2-3 h a temperatura ambiente.
         3. Retire suavemente la solución de bloqueo y agregue los anticuerpos primarios (CK19, CK18, ZO-1, ALB) diluidos en la solución de bloqueo durante la noche a 4 °C (consulte la tabla de materiales).
         4. Al día siguiente, retire suavemente la solución y agregue 1x PBS. Deje que los organoides se asienten bajo la gravedad durante un máximo de 10 minutos. Retire la solución con cuidado y repita el paso de lavado tres veces.
         5. Incubar los organoides con los anticuerpos secundarios (Alexa Fluor 594 [Ratón], Alexa Fluor 488 [Conejo], Alexa Fluor 488 [Ratón]) durante al menos 1 h a temperatura ambiente. Retire la solución con cuidado y repita el paso de lavado cuatro veces.
         6. Para la tinción nuclear, incubar los organoides con colorante nuclear Hoechst o DAPI durante 10 min. Lave los organoides agregando 1x PBS y repita el paso de lavado tres veces. Deja que los organoides se depositen en el fondo del tubo.
         7. Con una pipeta Pasteur de plástico, retire los organoides del tubo y colóquelos en portaobjetos de vidrio. Asegúrese de hacerlo con un daño mínimo a los organoides.
         8. Retire el exceso de PBS y agregue una cantidad (una o dos gotas) de medio de montaje. Monta con cuidado los cubreobjetos en los organoides de los portaobjetos de vidrio con el medio de montaje. Mantenga los portaobjetos a 4 °C y protéjalos de la luz hasta el proceso de obtención de imágenes.
2. Realizar microscopía electrónica.
   1. Fijar los organoides con solución de Karnovsky (glutaraldehído tamponado al 2,5% + paraformaldehído al 2% en tampón de fosfato sódico 0,1 M [tampón de Sorensen], pH 7,4, ver la Tabla de Materiales) durante la noche a 4 °C.
   2. Lavar los organoides con tampón Sorenson 0,1 M + sacarosa 0,1 M (1:1) durante 15 min (tres veces). A continuación, coloque el prefijo de los organoides en tetróxido de osmio tamponado con fosfato de sodio al 2% (véase la Tabla de Materiales) durante 90 min.
   3. Incrustar los organoides en agar tibio al 2%. Corta el exceso de agar alrededor de los organoides con una lanceta. Lave los organoides en el tampón de Sorensen durante 15 minutos (tres veces).
   4. Deshidratar con acetona al 50% durante 15 min (dos veces).
   5. Contraste durante la noche con acetona al 70% + ácido fosfotúngstico al 1% + acetato de uranilo al 0,5% (ver tabla de materiales) a 4 °C.
   6. Al día siguiente, deshidrate los organoides con una serie de acetona (80% de acetona, 90% de acetona, 96% de acetona y 100% de acetona) durante 15 minutos (dos veces).
   7. Limpie los organoides con óxido de propileno durante 10 min (dos veces) y luego coloque los organoides en una mezcla de epon:óxido de propileno (consulte la Tabla de materiales) durante 30 min a temperatura ambiente.
   8. Añadir una nueva solución de epón a los organoides e incubar durante la noche a 4 °C.
   9. Al día siguiente, coloque una nueva solución de epón fresco en el molde base y luego incruste los organoides. Poner en una incubadora durante 48 h a 65 °C para la polimerización.
   10. Corte los bloques de epón organoide con un ultramicrótomo ajustado a un grosor de sección de 50-100 nm. Coloque las secciones en cuadrículas cubiertas de formvar.
3. Mida la actividad de la enzima CYP3A4.
   1. Mida la actividad del CYP utilizando un kit disponible en el mercado (consulte la Tabla de materiales) siguiendo las instrucciones del fabricante.
      NOTA: Las enzimas CYP convierten el sustrato en un producto intermedio detectable 11,12,13. Hay dos opciones (lítica celular y no lítica) para medir la actividad de la enzima CYP. El kit proporciona una aplicación para analizar las actividades basales del CYP y las actividades inducidas del CYP después del tratamiento con compuestos.
   2. Ejecute el experimento por triplicado. Lea la luminiscencia con un luminómetro y calcule la señal. Para normalizar, tripsinice los organoides y cuente el número de células.
4. Realizar la cuantificación de la albúmina humana.
   1. Sustituya el medio de cultivo celular por un medio fresco 24 h antes de la prueba ELISA. Después de 24 h de incubación, recoja el medio de cultivo celular (300-500 μL) y centrifugue a 500 x g (a 4 °C) durante 2 minutos para eliminar los restos y partículas celulares. Alicuone el sobrenadante y almacene las muestras a -80 °C (hasta 3 meses).
   2. Ejecute el estándar y la muestra por duplicado. Los organoides maduros secretan albúmina en el medio de cultivo; cuantificar esta albúmina con un kit de cuantificación ELISA (ver la Tabla de Materiales). Mida la absorbancia con un lector de placas ELISA a 450 nm dentro de los 30 minutos después de detener la adición de la solución. Tripsinar los organoides y contar el número de células para normalizar.
5. Realizar el ensayo de eliminación de amoníaco.
   1. Realice el ensayo de eliminación de amoníaco siguiendo las instrucciones del fabricante (consulte la Tabla de materiales). Brevemente, añadir 1,5 mM NH₄Cl al medio de cultivo, e incubar durante 24 h.
   2. Después de la incubación, determine la concentración de amoníaco con un kit de ensayo de amoníaco (consulte la Tabla de materiales). Calcule las mediciones utilizando un lector multimodo de placas múltiples y normalice los valores a los números de celda.
6. Realizar el ensayo de colilglicilamido-fluoresceína (CLF).
   1. Trate brevemente los organoides con 10 μmol/L de CLF (consulte la Tabla de materiales) e incube durante 1 h en una incubadora a 37 °C. Después de la incubación, lavar los organoides con 1x PBS. Realice imágenes mediante microscopía de fluorescencia.
7. Realizar análisis de expresión génica.
   1. Siga las instrucciones del kit RNeasy (consulte la Tabla de materiales) para aislar el ARN total de los eHEPO.
   2. Configure la reacción de PCR utilizando una mezcla maestra disponible en el mercado (consulte la Tabla de materiales), siguiendo las instrucciones del fabricante. Después de preparar la mezcla de PCR para cada juego de cebadores, coloque 10 μL de cada muestra en las placas de qPCR de 96 pocillos (Tabla 1).
   3. Selle las placas con sellador adhesivo y luego centrifugue las placas a 1,000 x g durante 2 min a temperatura ambiente. Cargue las placas en una máquina de PCR. Normalizar la expresión génica relativa a un control interno (RPL41, Tabla 1) y analizar mediante el método 2−ΔΔCt ¹⁴.

6. Criopreservación de los eHEPOs

1. Etiquete los crioviales con un marcador resistente al nitrógeno. Compruebe el nivel de isopropanol del recipiente de congelación y manténgalo a 4 °C durante 15-30 minutos antes de comenzar el experimento.
2. Congele una gota de BMM de 50 μL en un criovial. Proceda con la disociación mecánica de organoides como se describe en el paso 4.3. Después de la disociación, vuelva a suspender el agregado celular en 500 μL de medio de congelación frío, luego transfiera suavemente la suspensión a los crioviales y manténgalos en el recipiente de congelación.
3. Transfiera el recipiente de congelación celular a -80 °C y, después de 24 h, transfiera los crioviales a nitrógeno líquido para su almacenamiento a largo plazo.

7. Descongelación de los eHEPOs

1. Precalentar un baño de agua y Ad-DMEM/F12 a 37 °C.
2. Retire un vial de eHEPO del almacenamiento de nitrógeno líquido con guantes criogénicos. Coloque el vial en un baño de agua a 37 °C hasta que los cristales de hielo se hayan derretido. Transfiera la suspensión de la celda a un tubo cónico de 15 mL y centrifuga a 200 x g durante 5 min a 4 °C.
3. Aspire el sobrenadante y proceda a sembrar los eHEPOs como se describe en la sección 4. Superponga la gota de BMM con el medio de expansión complementado con 10 μM Y-27632 (consulte la tabla de materiales). Refresque el medio cada 3 días y retire el inhibidor de ROCK después de 3 días.

Resultados

En primer lugar, se cultivaron células de fibroblastos humanos o células mononucleares de sangre periférica (PBMC) y se convirtieron en iPSC mediante reprogramación episomal. El nuevo suero knockout fue esencial para obtener iPSC saludables. A continuación, las iPSC se sembraron en las placas de cultivo recubiertas de BMM con una confluencia del 50%-60%. Tener colonias de iPSC de tamaño pequeño/mediano mejoró la eficiencia de diferenciación. A continuación, las iPSCs s...

Discusión

El presente protocolo describe un método integral para generar, expandir y congelar/descongelar organoides hepáticos a partir de iPSCs. Este protocolo cubre todos los pasos, incluido el cultivo de las iPSC en el cultivo alimentador y sin alimentador, la diferenciación del endodermo en 2 dimensiones, el enriquecimiento de las células progenitoras con FACS y formación de organoides, y la generación de organoides que ganan función. Además, también se proporcionan instrucciones deta...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
15 mL conical centrifuge tubes	Corning	430052
37 °C water bath	Nüve	210.NB9
37 °C, 5 % CO2 incubator	Memmert	INCO 153
50 mL conical centrifuge tubes	Corning	430290
70 µm and 40 µm Cell strainer	Falcon	352350/ 352340
70% Ethanol	Sigma	1009832511
A1AT	Abcam	ab166610	Dilution: 1/500 (IF), 1/50 (IHC)
A-83.01 (TGF-β inhibitor)	Tocris Biosciene	2939
Acetone	Isolab	9,01,026
Adhesive Microscope Slide	Histobond	C981040
Advanced DMEM-F12	Gibco	12634-010
AFP	Abcam	ab3980	Dilution: 1/25 (IHC)
Agar	EMS	10200
ALB	Abcam	ab10241	Dilution: 1/100 (IF), 1/20 (IHC)
Alexa Flour 488 (Mouse)	Invitrogen	A11001	Dilution: 1/1000 (IF)
Alexa Flour 488 (Rabbit)	Invitrogen	A110034	Dilution: 1/1000 (IF)
Alexa Flour 594 (Mouse)	Invitrogen	A11005	Dilution: 1/1000 (IF)
Alexa flour 594 (Rabbit)	Invitrogen	A11037	Dilution: 1/1000 (IF)
Ammonia Assay Kit	Sigma-Aldrich	MAK-310
Ammonium cloride	Santa Cruz	sc-202936
B27 Supplement 50x	Gibco	12587010
Base mold	Sakura	4216
b-FGF	Peprotech	100-18B
Biosafety, CLASS II,SAFETY CABINET	Thermo	SAFE 2020
Calibrated pipettes	Gilson	F167380
Centrifuge	Eppendorf	5702
Cholylglycylamido-fluorescein	Corning	451041
Citrate Buffer pH 6.0	Bio-optica	15-M103
CK-18	Santa Cruz	sc-51582	Dilution: 1/100 (IF), 1/20 (IHC)
CK-19	Santa Cruz	sc-6278	Dilution: 1/100 (IF), 1/20 (IHC)
Confocal Microscope	Zeiss	LSM880
Cryogenic handling gloves and eye protection	Cryokit	5274
Cryostat	Leica	CM 1950
Cryovial tubes	Corning	430659
DAB	Roche	11718096001
DAPT	Sigma-Aldrich	a5942
Dexamethasone	Sigma-Aldrich	D4902
Dispase	Stem Cell Technologies	7923
DMEM F12	Gibco	31330038
E-CAD	Santa Cruz	sc-8426	Dilution: 1/100 (IF), 1/20 (IHC)
EDTA	Invitrogen	15575-020
Electron Microscope	Zeiss	Sigma500
ELISA kit	Fortis life sciences bethyl	E88-129
Embed 812 Embedding Kit	EMS	14121
Entellan	Merck	107961
Eosin Y %1	Sigma-Aldrich	HT110332
EpCAM	Miltenyi Biotec	130-059-901	Dilution: 1/11 (FACS)
Ethanol	Merck	1,00,98,32,511
Fetal Bovine Serum (FBS)	Gibco	26010066
Forskolin (FSK)	Tocris Biosciene	1099
Freezing container (Mr. Frosty)	Thermo	5100-0001
Freezing Medium	Gibco	12648010
Glass Pasteur pipette	Isolab	084.01.001
Glutamax 100x	Gibco	35050-068
Gluteraldehyde %25, EM grade	EMS	16210-1L
Goat Anti-Mouse HRP	Thermo Fisher	62-6520	Dilution: 1/1000 (IHC)
Goat Anti-Rabbit HRP	Thermo Fisher	31460	Dilution: 1/1000 (IHC)
Goat Serum	Gibco	162-10-072
H2O2	Merck	107209
Hematoxylin	Millipore	HX86017674
HEPES, 1 M	Gibco	15630-056
HNF-4α	Abcam	ab55223	Dilution: 1/50 (IHC)
Ice and dry ice	homemade	homemade
Incubator (65 °C)	Nüve	EN 400
Isopropanol	Sigma-Aldrich	24137
Leu15 Gastrin I human	Sigma-Aldrich	G9145
Luminometer	Berthold Tech	LB 960
Master mix	Applied Biosystems	43676659
Matrigel matrix, hESC-Qualified	Corning	354277
Matrigel matrix, phenol-red-free	Corning	356231
Methanol	Merck	179337
Microcentrifuge tubes	Axygen	321-02-501
Microscope	Zeiss	AXIO VERT A1
Microtome blade	Feather	S35, C35
mTeSR1	Stem Cell Technologies	sc-05850
Multi well suspension culture plates	Sarstedt	83,39,21,500
N2 supplement 100x	Gibco	17502048
N-Acetylcysteine	Sigma-Aldrich	A9165
Neutral Buffered Formalin %10	Tekkim	TK.60161.05001
Nicotinamide	Sigma-Aldrich	N0636
Non-essential Amino Acide (NEAA)	Gibco	11140050
OCT	Tissue-Tek	4583
Osmium tetroxide	EMS	19110
P450-Glo Assays kit	Promega	V9001
Pap-pen	Sigma	Z377821-1EA
Paraffin	Tekkim	TK.200661.01002
PAS stain kit	Abcam	ab150680
PBS	Lonza	be17-516
Penicillin/Streptomycin	Gibco	15630-056
Phosphotungustic acid	Ted Pella	19402
Pipette aid	Axygen	Motopet-1
Plate reader varioskan flash	Thermo	5250040
Prolong Antifade Mountant	Invitrogen	P36980
Propylene Oxide, EM grade	EMS	20401
Real Time PCR system	Applied Biosystems	7500 Fast
Recombinant human Activin A	R&D	338-Ac-050
Recombinant human BMP7	Peprotech	120-03
Recombinant human EGF	Peprotech	af-100-15
Recombinant human FGF10	Peprotech	100-26
Recombinant human FGF19	Peprotech	100-32
Recombinant human HGF	Peprotech	100-39
Rho kinase inhibitor, Y-27632 dihydrochloride	Sigma-Aldrich	Y0503
RNase/DNase free 1.5 mL tube	Axygen	31108101
RNase/DNase free filter tips	Sarstedt	703031255
Rotary Microtome	Leica	RM 2245
RPMI 1640 Medium	Gibco	61870010
Rspo1-conditioned medium	Homemade
Slide master	Bio-optica	15-MEQ001
Sorenson’s Phosphate Buffer	EMS	11600-10
Spinner	Thermo	MY SPIN 6
Sterile serological pipettes	Falcon	357543
Tissue Casette	Leica	3802240
Trimmer	Leica	EM TRIM2
Triton X-100	Thermo Scientific	28314
TrypLE Express Enzyme	Gibco	12605010
Trypsin-EDTA	Gibco	25200-056
Ultramicrotome	Leica	EM UC7
Uranylacetate	EMS	22400
Vortex	Thermo	88880018
Wnt Surrogate-Fc Fusion Protein	ImmunoPrecise	N001
Xylene	Sigma	16446
ZO-1	Invitrogen	40-2200	Dilution: 1/400 (IF)