機能的肝内胚葉オルガノイドの作製

要約

このプロトコールでは、迅速で再現性の高い内胚葉性肝オルガノイド(eHEPO)の生成について説明します。このプロトコルにより、eHEPOは2週間以内に産生され、その差別化と機能を失うことなく長期(1年以上)に拡大することができます。

要約

オルガノイド技術により、肝臓、脳、腸など、さまざまなヒト臓器様のミニ構造を in vitroで生成することが可能になりました。オルガノイドモデルの目覚ましい進歩により、近年、疾患モデリング、発生生物学、創薬など、さまざまな応用に新たな実験の時代が開かれています。成体幹細胞または人工多能性幹細胞(iPSC)由来の肝臓オルガノイドは、さまざまなアプリケーションに使用する肝細胞の生成を制御します。ここでは、多能性幹細胞から肝臓オルガノイドを作製するための堅牢で再現性の高いプロトコールを紹介します。このプロトコルは、健康な細胞と患者由来の細胞に適用できます。3D内胚葉由来肝オルガノイド(eHEPO)を達成するために、まずiPS細胞を直接内胚葉細胞に分化させ、次にFACS濃縮EpCAM陽性(EpCAM+)細胞を用いて、増殖培地を用いて肝臓オルガノイドを作製しました。私たちは、2週間以内に肝臓オルガノイドを生成するための迅速かつ効率的な方法を提供します。生成されたオルガノイドは、アルブミン分泌、グリコーゲン貯蔵、シトクロムP450酵素活性など、肝細胞の本質的な特性と機能を模倣しています。肝臓特異的な遺伝子発現の類似性に加えて、eHEPOは、胆管を挟んだ分極した上皮細胞で構成されています。さらに、eHEPOは、成熟した肝細胞に分化する能力を失うことなく、長期間(1年)にわたって拡大し、連続継代することができます。したがって、eHEPOは機能的な肝細胞を産生するための代替供給源を提供します。

概要

オルガノイドは、臓器の微小環境を模倣した3次元培養条件で成長した小型の臓器様構造であり、臓器の発達自体に自己組織化と自己再生に必要な内因性因子を含んでいます。オルガノイドは、多能性幹細胞(PSC)または成体組織由来細胞(幹細胞または前駆^{細胞)のいずれか}に由来します1。その正確な臓器のような組織化と特定の臓器との機能的類似性は、疾患モデリングのための貴重なツールとなりますが、文化の標準化という点では、まださらなる改善が必要です。特に、肝臓オルガノイドの作製についてはいくつかのプロトコルが発表されており、その複雑さと再現性が異なります²。例えば、武部らが開発した肝臓芽オルガノイドは、肝内胚葉前駆細胞、ヒト臍帯静脈内皮細胞(HUVEC)、間葉系幹細胞(MSC)の人工多能性幹細胞(iPSC)を含む高密度の多細胞構造の形をしています。しかし、これらのオルガノイドには長期的な自己複製能力はありません^3,4。

歴史的な観点から、Huchらは、成体組織に由来するヒト肝上皮オルガノイドの産生を最初に報告しました。このオルガノイドでは、細胞が分極し、天然の上皮の側面を再現するために特殊化^{します5。}次に、Guanらは、iPS細胞由来の肝臓オルガノイドを使用して、肝臓内の胆管縮小に関連するまれな遺伝性疾患であるアラジール症候群(ALGS)をモデル化しました⁶。これらのオルガノイドはどちらも自己複製能力を持ち、胆汁やアルブミンの分泌、グリコーゲンの貯蔵、肝臓特異的な薬物解毒などの成熟した肝細胞機能を獲得することができます。最近の研究では、Ramliらは、胆管細胞様細胞(CLC^{)で構成される}胆汁嚢胞に胆汁うっ滞薬を排出する分極性肝細胞様細胞(HLC)間の機能的な胆管ネットワークを含むPSC由来の肝臓オルガノイドモデルを導入しました7。

この研究では、iPS細胞由来の胚葉内胚葉型オルガノイド(eHEPO)を作製するためのユニークな培養物を紹介しています。iPS細胞の培養と内胚葉への分化について段階的に説明し、濃縮されたEpCAM+前駆細胞からのeHEPOの生成を実証します。最後に、eHEPOの機能性と構造構成の特性評価、およびオルガノイドの凍結保存について説明します。

プロトコル

実験ステップに関する許可は、Dokuz Eylul大学医学部の臨床研究倫理委員会から取得されました(2013/25-4、2013年5月12日、2016/30-29、2016年11月24日)。

1. 細胞培養用溶液の調製

1. 層流フードで次の成分を混合することにより、内胚葉分化培地を調製します:1% B27、100 ng/mL アクチビン A、Wnt3a または 30% wnt3a-CM、および R-spo1 または 10% R-spo1-CM ( 材料の表を参照)。
2. 次の組成で蛍光活性化セルソーティング(FACS)バッファーを調製します:PBS、1 mM EDTA、25 mM HEPES、1% FBS。
3. 拡張培地(EM)を調製します:1% N2、1% B27、1.25 mM N-アセチル-L-システイン、50 ng/mL EGF、10% R-spo1 馴化培地、100 ng/mL FGF 10、10 mM ニコチンアミド、5 μM A8301、10 μM フォルスコリン(FSK)を Advanced DMEM/F-12 で調製します。10 nM Y-27632 と 0.3 nM WNT3a を添加します ( 材料表を参照)。
   注:完全な培地を2〜8°Cで最大2週間保管します。
4. 分化培地(DM)を調製します:1% N2、1% B27、10 nM ガストリン、50 ng/mL EGF、100 ng/mL FGF 10、25 ng/mL HGF、500 nM A8301、10 μM DAPT、25 ng/mL BMP7、および 30 μM デキサメタゾン Ad-DMEM/F-12 中( 材料表を参照)。
   注:完全な培地を2〜8°Cで2週間保管します。

2. フィーダーフリープレート上のiPS細胞の解凍

1. 細胞培養プレートを基底膜マトリックス(BMM)でコーティングします。
   1. BMMのアリコートの1バイアルを氷上で一晩、またはコーティングを開始する前に少なくとも2時間解凍します。15mLのコニカルチューブに6mLの冷たDMEM/F-12を加え、すぐに80μLの解凍したBMMを加えてよく混ぜます。
   2. 組織培養処理したウェルプレートを使用し、培養プレートにBMM溶液をコーティングし、ウェルプレート表面を覆うように分注します。プレートを37°Cのインキュベーターで少なくとも1時間インキュベートしてから使用してください。インキュベーション時間後、BMM溶液を廃棄し、すぐにiPS細胞特異的培地を添加します。
2. 極低温手袋を使用して、液体窒素貯蔵庫からiPS細胞のバイアル1本を取り出します。すぐにバイアルをフローティングチューブラックに置き、氷の結晶が溶けるまでラックを37°Cのウォーターバスに浸します。
   1. バイアルをウォーターバスから取り出し、70%エタノールで外側をしっかりと拭きます。次に、それを層流フードに入れます。このステップでは、迅速に行うことが重要です。
   2. 無菌条件下で、層流フード内で、解凍した細胞を5 mLのiPS細胞特異的培地を含む滅菌15 mLコニカルチューブに移します。
      1. 細胞を200 × g (室温)で3分間遠心分離します。上清をゆっくりと廃棄し、5 mLの血清学的ピペットで数回非常に穏やかにピペッティングして、細胞を2 mLのiPS細胞特異的培地に再懸濁し、コーティングされたウェルに細胞を播種します。
   3. プレートをすばやく動かして、細胞をウェル表面全体に分散させます。プレートを37°C、5%CO₂ インキュベーターにインキュベートします。
   4. 毎日培地をリフレッシュしてください。

3. 内胚葉の分化

1. セクション2で述べたように、iPS細胞を分割する前に、新しいウェルプレートにBMMを1時間かけてコーティングします。
2. 光学顕微鏡下でのiPS細胞の完全性と生存率を制御します。未分化iPS細胞は、大きな核、小さな細胞質、および明確なエッジを持つコンパクトな細胞コロニーを持つ細胞です。
   注:細胞を分裂するための酵素溶液は2つあります。ディスパーゼ(1 U/mL)を使用する場合は、分化した細胞の領域を除去する必要があります。特定の酵素を使用する場合、掻き取りや吸引で手動で領域を区別する必要はありません。特定の酵素を室温で保管してください。
3. iPSC培地を室温まで温めます。培地を吸引し、iPSCプレートをDMEM/F-12またはD-PBSですすいでください。6ウェルプレートの1ウェルに1mLの特異的酵素を加え、室温で1分間インキュベートした後、特異的酵素を吸引し、プレートを37°Cで5〜7分間インキュベートします。
   注:酵素による最適な治療時間は、使用するiPS細胞株に基づいて最適化する必要があります。
4. インキュベーション時間後、予め加温したiPSC培地1 mLを加え、プレートの側面を軽くたたいて、プレートの表面から未分化コロニー凝集体を剥離します。骨材の最適なサイズは50〜200μMです。
   1. 5 mLの血清学的ピペットで懸濁液を穏やかに混合し、BMMコーティングウェルに細胞懸濁液を所望の密度で播種します。細胞を37°Cで3〜5日間インキュベートし、70%のコンフルエントに達します。
5. 鑑別を開始する前に、iPSC培地を内胚葉培地に交換します(ステップ1.1)。毎日ミディアムをリフレッシュしてください。分化ステップ中の細胞の形態学的変化を制御します。分化に伴って細胞間相互作用が現れ始め、細胞はとがった形をします。

4. eHEPOの設立

1. EpCAM+内胚葉細胞のFACSによる濃縮を行います。
   1. 細胞選別実験の前に、オルガノイド特異的BMM( 材料表を参照)のバイアル1本を氷上で解凍します。細胞選別実験の前に、組織培養プレートを37°Cで一晩予温します。
   2. 内胚葉細胞を1x PBSですすいでください。トリプシン300 μLを加え、インキュベーター内で5分間インキュベートします。3 mLの冷DMEM-F12を加え、1,000 μLのフィルターチップでピペット処理して単一細胞を作製します。
   3. 細胞懸濁液を15mLのコニカルチューブに集めます。細胞を300 x g (室温)で5分間遠心分離します。上清を捨て、ペレットを10mLのFACSバッファーで洗浄します(ステップ1.2)。
   4. シングルセル懸濁液を作成するには、まず100 μmメッシュのストレーナーでセルをろ過し、次に40 μmメッシュのストレーナーでセルをろ過します。
      注:ストレーナを使用する前に、ストレーナーの表面を1mLのFACSバッファーですすいでください。
   5. 細胞懸濁液を300 x g (室温)で5分間遠心分離します。トリパン^ブルー8でセル番号をカウントします。
   6. 染色の比率は1:11です。例えば、15 x 10⁶ セルを 105 μL の FACS バッファーで再懸濁し、45 μL の FcR と 15 μL の EpCAM を添加します ( 材料の表を参照)。細胞を40°Cで10分間インキュベートし、チューブを光から保護します。インキュベーション後、500 μLのFACSバッファーを加えて細胞懸濁液を洗浄します。細胞を300 x g (室温)で5分間遠心分離します。
   7. ペレットを500μLのFACSバッファーに再懸濁します。細胞懸濁液にDAPI(0.5 μM/1 mL、最終濃度)を添加して、死細胞を定量します。細胞の選別ステップを開始するまで、細胞を氷上に置いておきます。
2. EpCAMとソートされたセルをBMMに埋め込みます。細胞ソーティング後、細胞を300 x g で5分間遠心分離し、FACSバッファーを回収します。上清を取り除き、20 μLのBMMに3,000〜5,000個の細胞を再懸濁します。
   1. 各48ウェルプレートの中心にBMMの液滴を添加して、細胞に播種します。BMMが固まるまで、細胞を37°Cで2分間インキュベートします。プレートを慎重に戻し、さらに10分間インキュベーターに入れます。液滴を膨張培地(48ウェルプレートの場合、ウェルあたり250 μL)で覆います。
   2. オルガノイド培地は3日ごとに更新してください。10-11日目には、オルガノイドサイズは100μmより大きくなります。
3. eHEPOの機械的解離と分化を行います。
   1. 各オルガノイド液滴を1:4の比率で分割します。分割するには、オルガノイド培地を捨て、500 μLの冷たくしたAd-DMEM/F12を加えます。1,000 μLのフィルターチップを使用して、BMM液滴を勢いよくピペットで掴みます。
   2. 最大10個のBMM液滴を15 mLのコニカルチューブに収集し、5 mLの冷たいAd-DMEM / F12を追加します。チューブを氷の上に置いて3〜5分間保管します。
   3. 細胞を200 x g で4°Cで5分間遠心分離します。 1mLが残るまで上清を捨てます。.細胞ペレットを200 μLのフィルターチップを使用して30〜40回激しくピペットします。光学顕微鏡でオルガノイドのサイズを確認し、単一細胞懸濁液の形成を慎重に避けます。
   4. 機械的解離後、5 mLの冷Ad-DMEM/F12を加え、細胞を200 x g で4°Cで5分間遠心分離します。
   5. 上清を捨て、細胞が播種されるまで懸濁液を氷の上に保ちます。
   6. 50 μL の BMM 液滴 (24 ウェルプレートの場合、ウェルあたり 35 μL の BMM + 15 μL の細胞と Ad-DMEM/F-12 を含む) をシードします。
   7. EM培地にBMP7(25 ng/mL、 材料表参照)を加え、3日間培養します。4日目に、培地を分化培地と交換します(ステップ1.4)。培地を3日ごとに更新し、細胞を少なくとも14日間培養します。

5. eHEPOの特性評価

1. 組織学的検査を行います。
   1. パラフィン包埋を行います。
      1. 培地を取り出し、1〜2 mLの冷たい1x PBSを加え、BMMを冷たい1x PBSに穏やかに再懸濁します。オルガノイドを15 mLの遠心チューブに慎重に移します。オルガノイドが重力下で落ち着くのを待ってから、PBSを慎重に吸引します。洗濯手順を3回繰り返します。
      2. オルガノイドに10 mLのフレッシュ固定液(10%中性緩衝ホルマリン)を加え、30分間インキュベートします。固定液を静かに取り除き、冷たくした1x PBSを10 mL加え、10分間インキュベートします。PBSを慎重に吸引します。
      3. オルガノイドを0.5%エオシン溶液( 材料表を参照)に96%エタノールに溶解し、室温で30分間染色します。
         注:免疫染色を行う場合は、エオシンで染色しないでください。
      4. オルガノイドをアルコール系(70%エタノール、80%エタノール、96%エタノール)を用いて室温で各5分間洗浄し、脱水します。オルガノイドを100%エタノール(無水エタノール)に30分間浸します。
      5. キシレン( 材料表を参照)を使用してオルガノイドを毎回20分間3回除去します⁹。
         注意: キシレンは非常に有毒で可燃性の化合物ですので、適切な安全装置を使用して取り扱ってください。大量に作業することは避けてください。
      6. プラスチックピペットを使用して、オルガノイドを予熱した金属ベース型( 材料表を参照)に静かに移します。オルガノイドを溶融パラフィンに3回、65°Cのインキュベーターでそれぞれ30分間保持します(交換するたびに新しい新しい溶融パラフィンと交換します)。
      7. 次に、オルガノイドを新しい新鮮なパラフィンに埋め込みます。オルガノイドを金属ベース金型の中央にゆっくりと動かします。
         注:このステップでは、パラフィンは室温で固化するため、迅速に作業することが重要です。
      8. 金属ベースモールドをコールドプレートに10〜20秒間移し、オルガノイドを安定させます。次に、溶融パラフィンを流し込んで金属ベース型を覆い、金属ベース型の上部にティッシュカセット( 材料の表を参照)を追加してラベルを付けます。型に十分なパラフィンが含まれていることを確認してから、コールドプレートで固化させます。金属ベースモールドを取り外します。
      9. 標準的なミクロトームを使用して、厚さ5〜7 μmの切片を切断します( 材料の表を参照)。連続パラフィン切片を接着性顕微鏡スライド上に配置します。スライドを一晩乾かします。
   2. ヘマトキシリンおよびエオシン(H&E)および過ヨウ素酸シフ(PAS)の染色を行います。
      1. パラフィン包埋スライドを63°Cのインキュベーターに一晩入れて脱パラフィンします。翌日、スライドをキシレンに3回、毎回20分間置きます。スライドを乾かさないでください。
      2. スライドを等級付けされたアルコールシリーズ(100%エタノール、96%エタノール、80%エタノール、70%エタノール)で2分間再水和します。次に、スライドを蒸留水に1分間入れます。
      3. H&E染色の場合は、次の手順を実行します。
      4. スライドをヘマトキシリン溶液に5分間入れます。流水で滑り台を5分間すすぎます。スライドを1%エオシンY溶液( 材料表を参照)で10秒間染色します。
      5. 80%エタノール、96%エタノールのシリーズ、および100%エタノールの2回の交換で切片をそれぞれ30秒間脱水します。
      6. スライドをキシレンに入れて、毎回20分間3回クリアします。
      7. カバースリップをスライドガラスの部分に封入剤で慎重に取り付けます( 材料の表を参照)。気泡が残っていないことを確認してください。
      8. PAS染色については、ステップ5.1.2.4-5.1.2.6を実行し、続いてAkbariら¹⁰によって報告されたPAS染色の手順を実行します。次に、カバースリップをスライドガラスの部分に封入剤で慎重に取り付けます。気泡が残っていないことを確認してください。
   3. 免疫組織化学染色(IHC)を行います。
      1. H&E染色プロトコルのステップ5.1.2.1およびステップ5.1.2.2を実行します。
      2. 0.1 Mクエン酸緩衝液(pH 6.0)でスライドを電子レンジで10分間加熱します。
      3. スライドが室温に冷えるまで保持し(約20分)、スライドを蒸留水ですすいでください。
      4. スライドを新たに調製した3%H₂O₂ にメタノールで室温で10分間入れます。次に、スライドを蒸留水で1分間すすぎます。
      5. プライマー抗体の非特異的結合をブロックします。ブロッキング溶液(2%血清+0.1%Triton X-100+0.1%BSA)と室温で1時間インキュベートします。
      6. ブロッキング溶液を静かに除去し、ブロッキング溶液で4°Cで一晩希釈した一次抗体(E-CAD、ALB、EpCAM、A1AT、CK19)( 材料表を参照)を加えます。
      7. 翌日、スライドを2回、10分間注意深くすすぎます(.
      8. 二次抗体(ヤギ抗ウサギ、ヤギ抗マウス)( 材料表参照)を室温で1時間添加し、スライドを蒸留水で5分間(3回)すすぎます。
      9. 3'3ジアミノベンジジン四塩酸塩(DAB、 材料の表を参照)溶液を調製します(これは使用の30分前に調製する必要があります)。
      10. DAB溶液をスライドに1〜5分間塗布し、蒸留水でスライドを5分間(3回)すすぎます。
      11. 切片をヘマトキシリンで1分間対比染色し、流水でスライドを1分間すすぎます。
      12. 80%エタノール、96%エタノールのシリーズ、および100%エタノールの2回の交換で切片をそれぞれ30秒間脱水します。
      13. スライドをキシレンに20分間(3回)入れます。
      14. カバースリップをスライドガラスの部分に封入剤で慎重に取り付けます。気泡が残っていないことを確認してください。
   4. OCT 埋め込みを実行します。
      1. 新たに調製した冷たい4% PFAを使用して、オルガノイドを4°Cで一晩固定します。 固定剤を慎重に取り除き、1x PBSで15分間(3回)洗浄します。
      2. 蒸留水を使用して30%ショ糖溶液(w / v)を調製します。1x PBSを取り出し、30%スクロースを加えてオルガノイドを脱水します。
      3. オルガノイドを4°Cで一晩インキュベートします。最初は、ほとんどの組織は30%のスクロースに浮遊し、浸透が完了すると沈みます。この時点で凍結保護は完了したと見なすことができます。
      4. 埋め込みプロセス用のドライアイスまたは液体窒素を準備します。
      5. 2〜3滴のOCT( 材料の表を参照)をプラスチックのクライオモールドに入れます。オルガノイドを切断のために正しい向きで上に置きます。
      6. オルガノイドの上にOCTをゆっくりと慎重に注ぎます。気泡を避けて注意してください。オルガノイドを室温で10〜15分間重力下に沈殿させます。
      7. 凍結ステップの前にクライオモールドにラベルを付けます。型をドライアイスまたは液体窒素の上に置いて急速冷凍します。クライオモールドを-80°Cに移し、切片化プロセスまでそこに保管します。
   5. 免疫蛍光染色(IF)を行います。
      1. 凍結切片染色を行います。
         1. クライオ切片を室温で20〜30分間風乾します。スライドを蒸留水で5分間(3回)再水和します。パップペンを使用して組織を疎水性バリアで囲みます( 材料の表を参照)。
         2. 切片あたり200-300 μLの0.2 % Triton X-100を添加します。スライドを5分間(3回)慎重に洗います。洗浄手順中にセクションがスライドから落ちないようにしてください。
         3. ブロッキング溶液(2%血清+0.1%Triton X-100+0.1%BSA)を室温で1時間加えます。
         4. ブロッキング溶液を静かに除去し、ブロッキング溶液で希釈した一次抗体(E-CAD、A1AT、HNF4α)を添加し( 材料表を参照)、スライドを4°Cで一晩インキュベートします。
         5. 適切な二次抗体(Alexa Fluor 488 [マウス]、Alexa Fluor 594 [マウス]、Alexa Fluor 594 [ウサギ])を室温で1時間( 材料表を参照)添加し、スライドを蒸留水で5分間(3回)すすぎます。
         6. 切片あたり100〜200 μLのHoechstまたはDAPI核染料を3分間加え、スライドを1x PBSで洗浄し、洗浄ステップを3回繰り返します。
         7. カバースリップをスライドガラスのセクションに、フェード防止封入剤で取り付けます。スライドを4°Cで一晩保管し、イメージングプロセスまで光から保護します。
      2. ホールマウント染色を行います。
         1. パラフィン包埋手順のステップ 5.1.1.1 とステップ 5.1.1.2 を実行します。
         2. ブロッキング溶液(0.1%-1% Triton X-100、1% DMSO、1% BSA、1% ヤギ血清)を1x PBSに添加し、オルガノイドをブロッキング溶液と室温で2-3時間インキュベートします。
         3. ブロッキング溶液を静かに取り出し、ブロッキング溶液で希釈した一次抗体(CK19、CK18、ZO-1、ALB)を4°Cで一晩加えます( 材料表を参照)。
         4. 翌日、溶液を静かに取り出し、1x PBSを追加します。オルガノイドを重力下で最大10分間落ち着かせます。溶液を慎重に取り出し、洗浄手順を3回繰り返します。
         5. オルガノイドを二次抗体(Alexa Fluor 594 [マウス]、Alexa Fluor 488 [ウサギ]、Alexa Fluor 488 [マウス])と室温で少なくとも1時間インキュベートします。溶液を慎重に取り出し、洗浄手順を4回繰り返します。
         6. 核染色の場合は、オルガノイドをHoechstまたはDAPI核色素と10分間インキュベートします。1x PBSを加えてオルガノイドを洗浄し、洗浄ステップを3回繰り返します。オルガノイドをチューブの底に落ち着かせます。
         7. プラスチック製のパスツールピペットを使用して、オルガノイドをチューブから取り出し、スライドガラスの上に置きます。オルガノイドへのダメージを最小限に抑えて行うようにしてください。
         8. 余分なPBSを取り除き、封入剤を1〜2滴加えます。カバースリップをスライドガラス上のオルガノイドに封入剤で慎重に取り付けます。スライドは4°Cに保ち、イメージングプロセスまで光から保護します。
2. 電子顕微鏡検査を行います。
   1. カルノフスキー溶液(2.5%緩衝グルタルアルデヒド+2%パラホルムアルデヒド、0.1 Mリン酸ナトリウム緩衝液[ソレンセン緩衝液]、pH 7.4、 材料表を参照)を使用してオルガノイドを4°Cで一晩固定します。
   2. オルガノイドを0.1 M Sorenson緩衝液 + 0.1 Mスクロース(1:1)で15分間(3回)洗浄します。次に、オルガノイドを2%リン酸ナトリウム緩衝四酸化オスミウム( 材料表を参照)に90分間ポストフィックスします。
   3. オルガノイドを2%温かい寒天に埋め込みます。オルガノイドの周りの余分な寒天をランセットで切り取ります。オルガノイドをソレンセンの緩衝液で15分間(3回)洗浄します。
   4. 50%アセトンを使用して15分間(2回)脱水します。
   5. 70%アセトン+1%リンタングステン酸+0.5%酢酸ウラニル( 材料表を参照)を4°Cで使用して、一晩造影します。
   6. 翌日、アセトンシリーズ(80%アセトン、90%アセトン、96%アセトン、100%アセトン)を使用してオルガノイドを15分間(2回)脱水します。
   7. プロピレンオキシドを使用してオルガノイドを10分間(2回)透明にした後、オルガノイドをepon:プロピレンオキシド( 材料表を参照)混合物に室温で30分間入れます。
   8. オルガノイドに新しいエポン溶液を加え、4°Cで一晩インキュベートします。
   9. 翌日、新しい新鮮なエポン溶液をベース型に入れ、オルガノイドを埋め込みます。インキュベーターに65°Cで48時間入れて重合します。
   10. オルガノイドエポンブロックをウルトラミクロトームで切断し、切片の厚さを50〜100 nmに設定します。セクションをフォームバーで覆われたグリッドに配置します。
3. CYP3A4酵素活性を測定します。
   1. 製造元の指示に従って、市販のキット( 材料の表を参照)を使用してCYP活性を測定します。
      注:CYP酵素は、基質を検出可能な中間生成物11,12,13に変換する。CYP酵素活性の測定には、2つのオプション(細胞溶解性および非溶解性)があります。このキットは、化合物処理後の基礎CYP活性および誘導CYP活性を解析するアプリケーションを提供します。
   2. 実験を 3 回に分けて実行します。ルミノメーターで発光を読み取り、信号を計算します。正規化のために、オルガノイドをトリプシン化し、細胞の数を数えます。
4. ヒトアルブミンの定量化を行います。
   1. ELISA試験の24時間前に、細胞培養培地を新しい培地と交換します。インキュベーション24時間後、細胞培養培地(300-500 μL)を回収し、500 x g (4°C)で2分間遠心分離して、細胞の破片と粒子を除去します。上清を分注し、サンプルを-80°C(最大3か月)で保存します。
   2. 標準試料と試料を二重に実行します。成熟したオルガノイドは、アルブミンを培地に分泌します。ELISA定量キットを使用してこのアルブミンを定量します( 材料の表を参照)。ELISAプレートリーダーで、溶液添加を止めてから30分以内に450nmで吸光度を測定します。オルガノイドをトリプシン処理し、正規化する細胞の数を数えます。
5. アンモニア除去アッセイを実施します。
   1. 製造元の指示に従ってアンモニア除去アッセイを実施します( 材料表を参照)。簡単に説明すると、1.5 mM NH₄Clを培地に加え、24時間インキュベートします。
   2. インキュベーション後、アンモニアアッセイキットでアンモニア濃度を測定します( 材料表を参照)。マルチモードマルチプレートリーダーを使用して測定値を計算し、値をセル番号に正規化します。
6. コリルグリシルアミド-フルオレセイン(CLF)アッセイを実施します。
   1. 簡単に説明すると、オルガノイドを10 μmol/L CLFで処理し( 材料表を参照)、37°Cのインキュベーターで1時間インキュベートします。インキュベーション後、オルガノイドを1x PBSで洗浄します。蛍光顕微鏡を用いてイメージングを行います。
7. 遺伝子発現解析を行います。
   1. RNeasyキット( 材料表を参照)の指示に従って、eHEPOからトータルRNAを単離してください。
   2. 市販のマスターミックス( 材料表を参照)を使用して、メーカーの指示に従ってPCR反応をセットアップします。各プライマーセットのPCRミックスを調製した後、各サンプル10 μLを96ウェルqPCRプレートに入れます(表1)。
   3. プレートを粘着シーラーで密封し、1,000 x g で室温で2分間遠心分離します。プレートをPCRマシンにロードします。相対的な遺伝子発現を内部コントロールに正規化し(RPL41、 表1)、2−ΔΔCt法 ¹⁴を用いて解析する。

6. eHEPOの凍結保存

1. クライオバイアルを耐窒素マーカーで標識します。凍結容器のイソプロパノールレベルを確認し、実験を開始する前に4°Cで15〜30分間保ちます。
2. 50 μL BMM液滴1個を1つのクライオバイアルで凍結します。手順 4.3 で説明したように、オルガノイドのメカニズムの解離を進めます。解離後、細胞凝集体を500 μLの冷凍結培地に再懸濁し、懸濁液をクライオバイアルに穏やかに移し、凍結容器に保持します。
3. 細胞凍結容器を-80°Cに移し、24時間後にクライオバイアルを液体窒素に移して長期保存します。

7. eHEPOの解凍

1. ウォーターバスとAd-DMEM/F12を37°Cに予熱します。
2. 極低温手袋を使用して、液体窒素貯蔵庫からeHEPOのバイアル1本を取り出します。氷の結晶が溶けるまで、バイアルを37°Cの水浴に入れます。細胞懸濁液を15 mLのコニカルチューブに移し、200 x g で4°Cで5分間遠心分離します。
3. 上清を吸引し、セクション4で説明されているようにeHEPOの播種に進みます。BMM液滴に10 μM Y-27632を添加した膨張培地を重ね合わせます( 材料表を参照)。培地は3日ごとに更新し、3日後にROCK阻害剤を取り除きます。

結果

まず、ヒト線維芽細胞または末梢血単核細胞(PBMC)細胞を培養し、エピソームリプログラミング により iPS細胞に転換しました。新鮮なノックアウト血清は、健康なiPS細胞を得るために不可欠でした。次に、iPS細胞をBMMコーティングした培養プレートに50%〜60%のコンフルエンシーで播種しました。iPS細胞コロニーが小型/中型のコロニーを持つことで、分化効率が...

ディスカッション

本プロトコールは、iPS細胞から始まる肝臓オルガノイドを作製、拡大、凍結/融解するための包括的な方法を記載しています。このプロトコールは、フィーダーおよびフィーダーフリー培養でのiPS細胞の培養、2次元内胚葉分化、FACSおよびオルガノイド形成による前駆細胞の濃縮、機能獲得オルガノイドの生成を含むすべてのステップをカバーしています。さらに、オ...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
15 mL conical centrifuge tubes	Corning	430052
37 °C water bath	Nüve	210.NB9
37 °C, 5 % CO2 incubator	Memmert	INCO 153
50 mL conical centrifuge tubes	Corning	430290
70 µm and 40 µm Cell strainer	Falcon	352350/ 352340
70% Ethanol	Sigma	1009832511
A1AT	Abcam	ab166610	Dilution: 1/500 (IF), 1/50 (IHC)
A-83.01 (TGF-β inhibitor)	Tocris Biosciene	2939
Acetone	Isolab	9,01,026
Adhesive Microscope Slide	Histobond	C981040
Advanced DMEM-F12	Gibco	12634-010
AFP	Abcam	ab3980	Dilution: 1/25 (IHC)
Agar	EMS	10200
ALB	Abcam	ab10241	Dilution: 1/100 (IF), 1/20 (IHC)
Alexa Flour 488 (Mouse)	Invitrogen	A11001	Dilution: 1/1000 (IF)
Alexa Flour 488 (Rabbit)	Invitrogen	A110034	Dilution: 1/1000 (IF)
Alexa Flour 594 (Mouse)	Invitrogen	A11005	Dilution: 1/1000 (IF)
Alexa flour 594 (Rabbit)	Invitrogen	A11037	Dilution: 1/1000 (IF)
Ammonia Assay Kit	Sigma-Aldrich	MAK-310
Ammonium cloride	Santa Cruz	sc-202936
B27 Supplement 50x	Gibco	12587010
Base mold	Sakura	4216
b-FGF	Peprotech	100-18B
Biosafety, CLASS II,SAFETY CABINET	Thermo	SAFE 2020
Calibrated pipettes	Gilson	F167380
Centrifuge	Eppendorf	5702
Cholylglycylamido-fluorescein	Corning	451041
Citrate Buffer pH 6.0	Bio-optica	15-M103
CK-18	Santa Cruz	sc-51582	Dilution: 1/100 (IF), 1/20 (IHC)
CK-19	Santa Cruz	sc-6278	Dilution: 1/100 (IF), 1/20 (IHC)
Confocal Microscope	Zeiss	LSM880
Cryogenic handling gloves and eye protection	Cryokit	5274
Cryostat	Leica	CM 1950
Cryovial tubes	Corning	430659
DAB	Roche	11718096001
DAPT	Sigma-Aldrich	a5942
Dexamethasone	Sigma-Aldrich	D4902
Dispase	Stem Cell Technologies	7923
DMEM F12	Gibco	31330038
E-CAD	Santa Cruz	sc-8426	Dilution: 1/100 (IF), 1/20 (IHC)
EDTA	Invitrogen	15575-020
Electron Microscope	Zeiss	Sigma500
ELISA kit	Fortis life sciences bethyl	E88-129
Embed 812 Embedding Kit	EMS	14121
Entellan	Merck	107961
Eosin Y %1	Sigma-Aldrich	HT110332
EpCAM	Miltenyi Biotec	130-059-901	Dilution: 1/11 (FACS)
Ethanol	Merck	1,00,98,32,511
Fetal Bovine Serum (FBS)	Gibco	26010066
Forskolin (FSK)	Tocris Biosciene	1099
Freezing container (Mr. Frosty)	Thermo	5100-0001
Freezing Medium	Gibco	12648010
Glass Pasteur pipette	Isolab	084.01.001
Glutamax 100x	Gibco	35050-068
Gluteraldehyde %25, EM grade	EMS	16210-1L
Goat Anti-Mouse HRP	Thermo Fisher	62-6520	Dilution: 1/1000 (IHC)
Goat Anti-Rabbit HRP	Thermo Fisher	31460	Dilution: 1/1000 (IHC)
Goat Serum	Gibco	162-10-072
H2O2	Merck	107209
Hematoxylin	Millipore	HX86017674
HEPES, 1 M	Gibco	15630-056
HNF-4α	Abcam	ab55223	Dilution: 1/50 (IHC)
Ice and dry ice	homemade	homemade
Incubator (65 °C)	Nüve	EN 400
Isopropanol	Sigma-Aldrich	24137
Leu15 Gastrin I human	Sigma-Aldrich	G9145
Luminometer	Berthold Tech	LB 960
Master mix	Applied Biosystems	43676659
Matrigel matrix, hESC-Qualified	Corning	354277
Matrigel matrix, phenol-red-free	Corning	356231
Methanol	Merck	179337
Microcentrifuge tubes	Axygen	321-02-501
Microscope	Zeiss	AXIO VERT A1
Microtome blade	Feather	S35, C35
mTeSR1	Stem Cell Technologies	sc-05850
Multi well suspension culture plates	Sarstedt	83,39,21,500
N2 supplement 100x	Gibco	17502048
N-Acetylcysteine	Sigma-Aldrich	A9165
Neutral Buffered Formalin %10	Tekkim	TK.60161.05001
Nicotinamide	Sigma-Aldrich	N0636
Non-essential Amino Acide (NEAA)	Gibco	11140050
OCT	Tissue-Tek	4583
Osmium tetroxide	EMS	19110
P450-Glo Assays kit	Promega	V9001
Pap-pen	Sigma	Z377821-1EA
Paraffin	Tekkim	TK.200661.01002
PAS stain kit	Abcam	ab150680
PBS	Lonza	be17-516
Penicillin/Streptomycin	Gibco	15630-056
Phosphotungustic acid	Ted Pella	19402
Pipette aid	Axygen	Motopet-1
Plate reader varioskan flash	Thermo	5250040
Prolong Antifade Mountant	Invitrogen	P36980
Propylene Oxide, EM grade	EMS	20401
Real Time PCR system	Applied Biosystems	7500 Fast
Recombinant human Activin A	R&D	338-Ac-050
Recombinant human BMP7	Peprotech	120-03
Recombinant human EGF	Peprotech	af-100-15
Recombinant human FGF10	Peprotech	100-26
Recombinant human FGF19	Peprotech	100-32
Recombinant human HGF	Peprotech	100-39
Rho kinase inhibitor, Y-27632 dihydrochloride	Sigma-Aldrich	Y0503
RNase/DNase free 1.5 mL tube	Axygen	31108101
RNase/DNase free filter tips	Sarstedt	703031255
Rotary Microtome	Leica	RM 2245
RPMI 1640 Medium	Gibco	61870010
Rspo1-conditioned medium	Homemade
Slide master	Bio-optica	15-MEQ001
Sorenson’s Phosphate Buffer	EMS	11600-10
Spinner	Thermo	MY SPIN 6
Sterile serological pipettes	Falcon	357543
Tissue Casette	Leica	3802240
Trimmer	Leica	EM TRIM2
Triton X-100	Thermo Scientific	28314
TrypLE Express Enzyme	Gibco	12605010
Trypsin-EDTA	Gibco	25200-056
Ultramicrotome	Leica	EM UC7
Uranylacetate	EMS	22400
Vortex	Thermo	88880018
Wnt Surrogate-Fc Fusion Protein	ImmunoPrecise	N001
Xylene	Sigma	16446
ZO-1	Invitrogen	40-2200	Dilution: 1/400 (IF)