Генерация функциональных эндодермальных органоидов печени

Резюме

Этот протокол описывает генерацию быстрых и воспроизводимых эндодермальных органоидов печени (eHEPO). С помощью этого протокола eHEPO могут быть произведены в течение 2 недель и расширяться в долгосрочной перспективе (более 1 года) без потери своей дифференциации и функциональности.

Аннотация

Технология органоидов позволила нам создавать различные человеческие органоподобные мини-структуры, такие как печень, мозг и кишечник, in vitro. Замечательные достижения в области органоидных моделей недавно открыли новую экспериментальную эру для различных приложений в моделировании заболеваний, биологии развития и разработке лекарств. Взрослые стволовые клетки или органоиды печени, полученные из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (ИПСК), регулируют генерацию гепатоцитов для использования в различных целях. Здесь мы представляем надежный и воспроизводимый протокол для получения печеночных органоидов из плюрипотентных стволовых клеток. Этот протокол применим к здоровым клеткам и клеткам, полученным от пациента. Для получения 3D-эндодермальных печеночных органоидов (eHEPOs), iPSCs сначала напрямую дифференцировались в эндодермальные клетки, а затем FACS-обогащенные EpCAM-положительные (EpCAM+) клетки использовались для создания печеночных органоидов с использованием расширяющей среды. Мы предоставляем быстрый и эффективный метод получения органоидов печени в течение 2 недель. Сгенерированные органоиды имитируют основные свойства и функции гепатоцитов, такие как секреция альбумина, накопление гликогена и активность фермента цитохрома Р450. Помимо сходства экспрессии генов, специфичных для печени, eHEPO содержат поляризованные эпителиальные клетки с желчными каналами между ними. Кроме того, eHEPO могут быть расширены и серийно пассажены в течение длительного времени (1 год) без потери их способности дифференцироваться в зрелые гепатоциты. Таким образом, eHEPOs являются альтернативным источником для производства функциональных гепатоцитов.

Введение

Органоиды представляют собой миниатюризированные органоподобные структуры, выращенные в трехмерных культурных условиях, которые имитируют микроокружение органа и включают внутренние факторы, необходимые для самоорганизации и самообновления, в развитие самого органа. Органоиды могут быть получены либо из плюрипотентных стволовых клеток (ПСК), либо из клеток тканей взрослого человека (стволовых клеток или клеток-предшественников)¹. Хотя их точная органоподобная организация и функциональное сходство с конкретным органом делают их ценными инструментами для моделирования заболеваний, они все еще нуждаются в дальнейших улучшениях с точки зрения стандартизации в культуре. В частности, опубликовано несколько протоколов по получению органоидов печени, и они различаются по своей сложности и воспроизводимости2^. Например, органоиды почек печени, разработанные Takebe et al., имеют форму плотных многоклеточных структур, содержащих следующие индуцированные плюрипотентные стволовые клетки (ИПСК): эндодермальные предшественники печени, эндотелиальные клетки пупочной вены человека (HUVECs) и мезенхимальные стволовые клетки (МСК). Однако эти органоиды не обладают способностью к долгосрочному самообновлению ^3,4.

С исторической точки зрения, Huch et al. впервые сообщили о производстве эпителиальных органоидов печени человека, полученных из тканей взрослого человека, в которых клетки поляризуются и специализируются на воспроизведении аспектов нативного эпителия⁵. Затем Guan et al. использовали органоиды печени, полученные из iPSC, для моделирования синдрома Алажиля (ALGS), редкого генетического заболевания, связанного с уменьшением желчных протоков^{в печени.} Оба этих органоида обладают способностью к самообновлению и могут восстанавливать зрелые функции гепатоцитов, такие как секреция желчи и альбумина, хранение гликогена и детоксикация специфических для печени лекарств. В недавнем исследовании Ramli et al. представили модель органоида печени, полученную из ПСХ, содержащую функциональные сети желчных каналов между поляризованными гепатоцитоподобными клетками (КГК), которые выделяют холестатические препараты в желчные кисты, состоящие из холангиоцитоподобных клеток (ХЛК)⁷.

В этом исследовании представлена уникальная культура для получения эндодермальных органоидов печени, полученных из iPSC, называемых eHEPOs. Культура иПСК и дифференцировка в энтодерму описаны шаг за шагом, а также продемонстрировано создание eHEPOs из обогащенных предшественников EpCAM+. Наконец, описывается характеристика функциональности и структурной организации eHEPO, а также криоконсервация органоидов.

протокол

Разрешения, связанные с экспериментальными этапами, были получены от местного Комитета по этике клинических исследований медицинского факультета Университета Докуз Эйлюль (2013/25-4, 12 мая 2013 г.; 2016/30-29, 24 ноября 2016 г.).

1. Приготовление растворов для культивирования клеток

1. Приготовьте среду для дифференцировки энтодермы, смешав в колпаке с ламинарным потоком следующие компоненты: 1% B27, 100 нг/мл активина А, Wnt3a или 30% wnt3a-CM и R-spo1 или 10% R-spo1-CM (см. Таблицу материалов).
2. Приготовьте буфер для сортировки клеток, активируемый флуоресценцией (FACS) со следующим составом: PBS, 1 мМ ЭДТА, 25 мМ HEPES, 1% FBS.
3. Приготовьте расширяющую среду (EM): 1% N2, 1% B27, 1,25 мМ N-ацетил-L-цистеина, 50 нг/мл EGF, 10% кондиционированной среды R-spo1, 100 нг/мл FGF 10, 10 мМ никотинамида, 5 мкМ A8301 и 10 мкМ форсколина (FSK) в Advanced DMEM/F-12. Добавьте 10 нМ Y-27632 и 0,3 нМ WNT3a (см. Таблицу материалов).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Держите готовую среду не более 2 недель при температуре 2-8 °C.
4. Приготовьте среду для дифференцировки (СД): 1% N2, 1% B27, 10 нМ гастрина, 50 нг/мл EGF, 100 нг/мл FGF 10, 25 нг/мл HGF, 500 нМ A8301, 10 мкМ DAPT, 25 нг/мл BMP7 и 30 мкМ дексаметазона в Ad-DMEM/F-12 (см. Таблицу материалов).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Держите готовую среду в течение 2 недель при температуре 2-8 °C.

2. Размораживание ИПСК на пластине без подающего устройства

1. Покрыть клеточную культуральную пластину базальной мембранной матрицей (BMM).
   1. Разморозьте один флакон аликвоты BMM на ночь на льду или не менее чем за 2 часа до начала нанесения покрытия. Добавьте 6 мл холодного DMEM/F-12 в коническую пробирку объемом 15 мл, сразу же добавьте 80 мкл размороженного BMM и хорошо перемешайте.
   2. Используйте хорошо обработанные тканевые культуры, покройте культуральную пластину раствором BMM и распределите его, чтобы покрыть поверхность луночного планшета. Перед использованием инкубируйте планшет в инкубаторе при температуре 37 °C не менее 1 часа. По истечении времени инкубации выбросьте раствор BMM и немедленно добавьте среду, специфичную для iPSC.
2. Извлеките один флакон ИПСК из хранилища жидкого азота с помощью криогенных перчаток. Немедленно поместите флакон на плавающую решетку для пробирок и погрузите штатив в водяную баню при температуре 37 °C, пока кристаллы льда не растают.
   1. Снимите флакон с водяной бани, и тщательно протрите его снаружи 70% этанолом. Затем поместите его в ламинарный капюшон. Важно быть быстрым на этом этапе.
   2. В асептических условиях, в ламинарном колпаке, переложите размороженные клетки в стерильную коническую пробирку объемом 15 мл, содержащую 5 мл среды, специфичной для iPSC.
      1. Центрифугируйте ячейки при 200 × г (при комнатной температуре) в течение 3 мин. Медленно отбросьте надосадочную жидкость, ресуспендируйте клетки в 2 мл среды, специфичной для iPSC, очень осторожно несколько раз проведя пипетирование серологической пипеткой объемом 5 мл, и засейте клетки в лунки с покрытием.
   3. Быстро переместите пластину, чтобы распределить ячейки по всей поверхности лунки. Инкубируйте планшет в инкубаторе с температурой 37 °C, 5% CO₂ .
   4. Обновляйте питательную среду каждый день.

3. Дифференциация эндодермы

1. Покройте новую луночную пластину BMM за 1 ч до разделения iPSCs, как указано в разделе 2.
2. Контролируйте целостность и жизнеспособность ИПСК под действием световой микроскопии. Недифференцированные ИПСК — это клетки с большими ядрами, малой цитоплазмой и компактными клеточными колониями с четко выраженными краями.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Существует два ферментативных решения для расщепления клеток. В случае использования диспазы (1 Ед/мл) необходимо удалить участки дифференцированных клеток. Если используется определенный фермент, нет необходимости вручную дифференцировать участки с помощью соскабливания или отсасывания. Храните определенный фермент при комнатной температуре.
3. Нагрейте iPSC средней и комнатной температуры. Отсадите среду и промойте планшет iPSC с помощью DMEM/F-12 или D-PBS. Добавьте 1 мл специфического фермента в одну лунку 6-луночного планшета, инкубируйте в течение 1 минуты при комнатной температуре, а затем аспирируйте специфический фермент и инкубируйте планшет при 37 °C в течение 5-7 минут.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Оптимальное время лечения ферментами должно быть оптимизировано в зависимости от используемой линии iPSC.
4. По истечении времени инкубации добавьте 1 мл предварительно подогретой среды iPSC и осторожно постучите по боковой стороне планшета, чтобы отделить недифференцированные агрегаты колоний от поверхности планшета. Оптимальный размер агрегатов – 50-200 мкМ.
   1. С помощью серологической пипетки объемом 5 мл аккуратно перемешайте суспензию, а затем засейте клеточную суспензию нужной плотности в лунку, покрытую BMM. Инкубируйте клетки при 37 °C в течение 3-5 дней до достижения конфлюенции 70%.
5. Перед началом дифференцировки замените среду iPSC на среду для энтодермы (шаг 1.1). Обновляйте средство каждый день. Контролируйте морфологические изменения клеток на этапах дифференцировки. После дифференцировки начинают проявляться межклеточные взаимодействия, и клетки приобретают остроконечную форму.

4. Создание eHEPO

1. Выполняйте обогащение эндодермальных клеток EpCAM+ с помощью FACS.
   1. Разморозьте один флакон специфичного для органоидов BMM (см. Таблицу материалов) на льду перед экспериментом по сортировке клеток. Предварительно нагрейте планшеты для тканевых культур до 37 °C в течение ночи перед экспериментом по сортировке клеток.
   2. Промойте клетки энтодермы 1x PBS. Добавьте 300 μл трипсина, и инкубируйте в течение 5 минут в инкубаторе. Добавьте 3 мл холодного DMEM-F12 и пипетку с фильтрующими наконечниками объемом 1000 мкл для получения отдельных клеток.
   3. Соберите клеточную суспензию в коническую пробирку объемом 15 мл. Центрифугируйте клетки при плотности 300 x g (при комнатной температуре) в течение 5 минут. Выбросьте надосадочную жидкость и промойте гранулу 10 мл буфера FACS (шаг 1.2).
   4. Чтобы получить суспензию для одиночных клеток, сначала отфильтруйте ячейки с помощью сетчатого фильтра 100 мкм, а затем с помощью сетчатого фильтра 40 мкм.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Перед использованием ситечка промойте поверхность ситечка 1 мл буфера FACS.
   5. Центрифугируйте клеточную суспензию при 300 x g (при комнатной температуре) в течение 5 мин. Посчитайте номер ячейки с помощью Trypan Blue⁸.
   6. Соотношение для окрашивания составляет 1:11. Например, ресуспендируйте 15 x 10⁶ элементов со 105 мкл буфера FACS и добавьте 45 мкл FcR и 15 мкл EpCAM (см. таблицу материалов). Инкубируйте клетки в течение 10 минут при температуре 40 °C и защищайте трубку от света. После инкубации добавьте 500 мкл буфера FACS для промывания клеточной суспензии. Центрифугируйте клетки при плотности 300 x g (при комнатной температуре) в течение 5 минут.
   7. Повторно суспендируйте гранулу в 500 мкл буфера FACS. Добавьте DAPI (0,5 мкМ/1 мл, конечная концентрация) в клеточную суспензию для количественного определения мертвых клеток. Держите клетки на льду до начала этапа сортировки ячеек.
2. Встраиваем EpCAM и отсортированные ячейки в BMM. После сортировки клеток центрифугируйте ячейки при давлении 300 x g в течение 5 минут, чтобы извлечь буфер FACS. Удалите надосадочную жидкость и повторно суспендируйте 3000-5000 клеток в 20 мкл BMM.
   1. Засейте клетки, добавив каплю BMM в центр каждого 48-луночного планшета. Инкубируйте клетки в течение 2 минут при 37 °C до тех пор, пока BMM не затвердеет. Осторожно переверните тарелку и подержите ее в инкубаторе еще 10 минут. Наложите на каплю расширительную среду (250 μл на лунку для 48-луночного планшета).
   2. Обновляйте органоидную среду каждые 3 дня. На 10-11 день размер органоида будет больше 100 мкм.
3. Выполнение механической диссоциации и дифференцировки eHEPO.
   1. Разделите каждую каплю органоида в соотношении 1:4. Чтобы разделить, выбросьте органоидную среду и добавьте 500 μл холодного Ad-DMEM/F12. С помощью фильтрующих наконечников объемом 1 000 мкл можно энергично пипетировать капли BMM.
   2. Соберите максимум 10 капель BMM в конические пробирки объемом 15 мл и добавьте 5 мл холодного Ad-DMEM/F12. Держите трубку на льду 3-5 минут.
   3. Центрифугируйте ячейки при температуре 200 x g в течение 5 минут при 4 °C. Выбросьте надосадочную жидкость до тех пор, пока не останется 1 мл. Энергично пипетируйте клеточную таблетку 30-40 раз, используя фильтрующие наконечники объемом 200 мкл. Проверяйте размер органоидов под помощью световой микроскопии, тщательно избегая образования одноклеточной суспензии.
   4. После механической диссоциации добавьте 5 мл холодного Ad-DMEM/F12 и центрифугируйте клетки при 200 x g в течение 5 минут при 4 °C.
   5. Выбросьте надосадочную жидкость, а суспензию держите на льду до засеивания клеток.
   6. Засейте каплю BMM объемом 50 мкл (содержащую 35 мкл BMM + 15 мкл клеток и Ad-DMEM/F-12 на лунку для 24-луночного планшета).
   7. Добавьте BMP7 (25 нг/мл, см. Таблицу материалов) в ЭМ-среду, и закваливайте в течение 3 дней. На 4 день замените среду на среду для дифференцировки (шаг 1.4). Обновляйте среду каждые 3 дня, а культивируйте клетки не менее 14 дней.

5. Характеристика eHEPO

1. Проводят гистологические исследования.
   1. Выполните заделку парафином.
      1. Удалите среду, добавьте 1-2 мл холодного 1x PBS и аккуратно восстановите BMM в холодном 1x PBS. Осторожно переложите органоиды в центрифужную пробирку объемом 15 мл. Дайте органоидам осесть под действием силы тяжести, а затем осторожно аспирируйте PBS. Повторите этап стирки три раза.
      2. Добавьте 10 мл свежего фиксатора (10% нейтрального буферизованного формалина) к органоидам и инкубируйте в течение 30 минут. Аккуратно снимите фиксатор, добавьте 10 мл холодного 1x PBS и выдерживайте 10 минут. Осторожно аспирируйте PBS.
      3. Окрасить органоиды в раствор 0,5% эозина (см. Таблицу материалов), растворенный в 96% этаноле, на 30 мин при комнатной температуре.
         ПРИМЕЧАНИЕ: Если необходимо провести иммуноокрашивание, не окрашивайте эозином.
      4. Обезвоживайте органоиды путем промывки спиртовой серией (70% этанола, 80% этанола и 96% этанола) в течение 5 минут при комнатной температуре. Замочите органоиды в 100% этаноле (абсолютном этаноле) на 30 минут.
      5. Очистите органоиды с помощью ксилола (см. Таблицу материалов) три раза в течение 20 мин каждый раз⁹.
         ВНИМАНИЕ: Ксилол является очень токсичным и легковоспламеняющимся соединением, поэтому обращайтесь с ним, используя соответствующее защитное снаряжение. Избегайте работы в больших количествах.
      6. Аккуратно перенесите органоиды в предварительно разогретую металлическую форму на основе (см. Таблицу материалов) с расплавленным парафином с помощью пластиковой пипетки. Подержите органоиды в расплавленном парафине три раза по 30 минут каждый в инкубаторе при температуре 65 °C (при каждой смене заменяйте его новым свежерасплавленным парафином).
      7. Затем встройте органоиды в новый свежий парафин. Осторожно переместите органоиды в середину формы с металлическим основанием.
         ПРИМЕЧАНИЕ: На этом этапе очень важно работать быстро, потому что парафин затвердевает при комнатной температуре.
      8. Перенесите форму с металлическим основанием на холодную пластину на 10-20 с, чтобы стабилизировать органоиды. Затем залейте расплавленный парафин, чтобы покрыть форму с металлическим основанием, и добавьте тканевую кассету (см. Таблицу материалов) на верхнюю часть формы для металлической основы для маркировки. Убедитесь, что в форме достаточно парафина, а затем дайте им застыть на холодной плите. Снимите форму с металлическим основанием.
      9. Срезать участки толщиной 5-7 мкм с помощью стандартного микротома (см. Таблицу материалов). Поместите серийные парафиновые срезы на адгезивные предметные стекла микроскопа. Дайте предметным стеклам высохнуть в течение ночи.
   2. Выполните окрашивание гематоксилином и эозином (H&E) и периодическим окрашиванием кислотой-шиффом (PAS).
      1. Поместите залитые парафином предметные стекла в инкубатор при температуре 63 °C на ночь для депарафинизации. На следующий день поместите предметные стекла в ксилол три раза на 20 минут каждый раз. Не допускайте пересыхания горок.
      2. Увлажните предметные стекла серией спиртов (100% этанол, 96% этанол, 80% этанол и 70% этанол) в течение 2 минут. Затем поместите горки в дистиллированную воду на 1 минуту.
      3. Для окрашивания H&E выполните следующие действия.
      4. Поместите предметные стекла в раствор гематоксилина на 5 мин. Промойте горки в проточной воде из-под крана в течение 5 минут. Окрашивать предметные стекла 1% раствором эозина Y (см. Таблицу материалов) в течение 10 с.
      5. Обезвожьте секции серией 80% этанола, 96% этанола и двумя сменами 100% этанола в течение 30 с каждая.
      6. Поместите предметные стекла в ксилол для прояснения три раза по 20 минут каждый раз.
      7. Аккуратно закрепите покровные стекла на секциях на предметных стеклах с помощью монтажного носителя (см. Таблицу материалов). Убедитесь, что на нем не осталось пузырей.
      8. Для окрашивания PAS выполните шаги 5.1.2.4-5.1.2.6, а затем процедуры окрашивания PAS, описанные в Akbari et ^al.10. Затем аккуратно закрепите покровные стекла на секциях на предметных стеклах с помощью монтажного носителя. Убедитесь, что на нем не осталось пузырей.
   3. Проводят иммуногистохимическое (ИГХ) окрашивание.
      1. Выполните шаги 5.1.2.1 и 5.1.2.2 в протоколе окрашивания H&E.
      2. Нагрейте предметные стекла в 0,1 М цитратном буфере (pH 6,0) в микроволновой печи в течение 10 минут.
      3. Подержите, пока предметные стекла остынут до комнатной температуры (примерно 20 минут), и промойте горные стекла дистиллированной водой.
      4. Выложите горки в свежеприготовленные 3% H₂O₂ в метаноле на 10 минут при комнатной температуре. Затем промойте горки в дистиллированной воде в течение 1 минуты.
      5. Блокируют неспецифическое связывание антител праймера путем инкубации участков с блокирующим раствором (2% сыворотки + 0,1% Triton X-100 + 0,1% BSA) при комнатной температуре в течение 1 ч.
      6. Аккуратно удалите блокирующий раствор и добавьте первичные антитела (E-CAD, ALB, EpCAM, A1AT, CK19) (см. Таблицу материалов), разведенные в блокирующем растворе при 4 °C на ночь.
      7. На следующий день тщательно промойте предметные стекла два раза в течение 10 мин (.
      8. Добавьте вторичные антитела (Goat Anti-Rabbit, Goat Anti-Mouse) (см. Таблицу материалов) в течение 1 ч при комнатной температуре, и промойте предметные стекла в дистиллированной воде в течение 5 мин (три раза).
      9. Приготовьте 3'3 раствор диаминобензидина тетрагидрохлорида (DAB, см. Таблицу материалов) (его необходимо приготовить за 30 минут до использования).
      10. Нанесите раствор DAB на предметные стекла на 1-5 минут, и промойте горки в дистиллированной воде в течение 5 минут (три раза).
      11. Срезы запачкать гематоксилином в течение 1 минуты, а горки промыть в проточной воде из-под крана в течение 1 минуты.
      12. Обезвожьте секции серией 80% этанола, 96% этанола и двумя сменами 100% этанола в течение 30 с каждая.
      13. Поместите предметные стекла в ксилол на 20 минут (три раза).
      14. Аккуратно закрепите покровное стекло на секции на предметном стекле с помощью монтажного носителя. Убедитесь, что на нем не осталось пузырей.
   4. Выполните встраивание OCT.
      1. Закрепите органоиды с помощью свежеприготовленной холодной 4% PFA на ночь при температуре 4 °C. Осторожно снимите фиксатор и промойте 1x PBS в течение 15 минут (три раза).
      2. Приготовьте 30% раствор сахарозы (w/v) с использованием дистиллированной воды. Удалите 1x PBS и добавьте 30% сахарозу для обезвоживания органоидов.
      3. Инкубируйте органоиды при температуре 4 °C в течение ночи. Первоначально большинство тканей будут плавать в 30% сахарозы и тонуть после завершения проникновения. На этом этапе криозащиту можно считать завершенной.
      4. Подготовьте сухой лед или жидкий азот для процесса заделки.
      5. Поместите две-три капли ОКТ (см. Таблицу материалов) в пластиковые криоформы. Поместите органоиды сверху в правильной ориентации для резки.
      6. Медленно и осторожно налейте ОКТ поверх органоидов. Будьте осторожны, чтобы не допустить образования пузырей. Дайте органоидам осесть под действием силы тяжести в течение 10-15 минут при комнатной температуре.
      7. Маркируйте криоформы перед этапом замораживания. Поместите формочки на сухой лед или жидкий азот для быстрой заморозки. Перенесите криоформы при температуру −80 °C и храните их там до процесса разделки.
   5. Выполните иммунофлюоресцентное (ЕСЛИ) окрашивание.
      1. Выполните окрашивание замороженных сечений.
         1. Высушить криосекции на воздухе в течение 20-30 минут при комнатной температуре. Увлажните горки дистиллированной водой в течение 5 минут (три раза). Окружите ткань гидрофобным барьером с помощью пап-ручки (см. Таблицу материалов).
         2. Добавьте 200-300 мкл 0,2 % Triton X-100 на секцию. Тщательно вымойте горки в течение 5 минут (три раза). Следите за тем, чтобы секции не отвалились от горок во время этапов мойки.
         3. Добавьте блокирующий раствор (2% сыворотка + 0,1% Triton X-100 + 0,1% BSA) в течение 1 ч при комнатной температуре.
         4. Аккуратно удалите блокирующий раствор, добавьте первичные антитела (E-CAD, A1AT, HNF4α), разведенные в блокирующем растворе (см. Таблицу материалов), и инкубируйте предметные стекла в течение ночи при температуре 4 °C. На следующий день тщательно промойте предметные стекла в течение 10 минут (два раза).
         5. Добавьте подходящие вторичные антитела (Alexa Fluor 488 [Мышь], Alexa Fluor 594 [Мышь], Alexa Fluor 594 [Кролик]) в течение 1 ч при комнатной температуре (см. Таблицу материалов) и промойте предметные стекла в дистиллированной воде в течение 5 мин (три раза).
         6. Добавьте 100-200 μл ядерного красителя Hoechst или DAPI на секцию в течение 3 минут, промойте предметные стекла 1x PBS и повторите этап промывки три раза.
         7. Закрепите покровные стекла на секциях на стеклянных предметных стеклах с помощью монтажной среды, предотвращающей выцветание. Держите предметные стекла на ночь при температуре 4 °C и защищайте их от света до начала процесса визуализации.
      2. Выполните окрашивание всего крепления.
         1. Выполните шаги 5.1.1.1 и 5.1.1.2 в процедуре заделки парафина.
         2. Добавьте раствор для блокирования (0,1%-1% Triton X-100, 1% DMSO, 1% BSA и 1% сыворотку для коз в 1x PBS, см. Таблицу материалов) и инкубируйте органоиды с раствором для блокирования в течение 2-3 часов при комнатной температуре.
         3. Аккуратно удалите блокирующий раствор и добавьте первичные антитела (CK19, CK18, ZO-1, ALB), разведенные в блокирующем растворе на ночь при 4 °C (см. Таблицу материалов).
         4. На следующий день аккуратно удалите раствор и добавьте 1x PBS. Дайте органоидам осесть под действием силы тяжести до 10 минут. Аккуратно удалите раствор и повторите этап промывки три раза.
         5. Инкубируйте органоиды со вторичными антителами (Alexa Fluor 594 [мышь], Alexa Fluor 488 [кролик], Alexa Fluor 488 [мышь]) в течение не менее 1 ч при комнатной температуре. Аккуратно удалите раствор и повторите этап промывки четыре раза.
         6. Для ядерного окрашивания органоиды инкубируют с ядерным красителем Hoechst или DAPI в течение 10 минут. Промойте органоиды, добавив 1x PBS, и повторите шаг промывки три раза. Дайте органоидам осесть на дно пробирки.
         7. С помощью пластиковой пастеровской пипетки извлеките органоиды из пробирки и поместите их на стеклянные предметные стекла. Убедитесь, что делаете это с минимальным повреждением органоидов.
         8. Удалите излишки PBS и добавьте количество (одну-две капли) монтажного материала. Аккуратно закрепите покровные стекла на органоидах на предметных стеклах с помощью монтажного носителя. Держите предметные стекла при температуре 4 °C и защищайте их от света до начала процесса визуализации.
2. Проведите электронную микроскопию.
   1. Закрепить органоиды с помощью раствора Карновского (2,5% буферного глутаральдегида + 2% параформальдегида в 0,1 М натрий-фосфатном буфере [буфер Соренсена], рН 7,4, см. таблицу материалов) в течение ночи при 4 °С.
   2. Промойте органоиды с 0,1 М буфером Соренсона + 0,1 М сахарозой (1:1) в течение 15 минут (три раза). Затем поместите органоиды в 2% буферизованный фосфатом натрия тетраоксид осмия (см. Таблицу материалов) на 90 минут.
   3. Заложите органоиды в 2% теплый агар. Срежьте излишки агара вокруг органоидов с помощью ланцета. Промойте органоиды в буфере Соренсена в течение 15 минут (три раза).
   4. Обезвоживайте с использованием 50% ацетона в течение 15 минут (два раза).
   5. Сравните на ночь, используя 70% ацетон + 1% фосфовольфрамовую кислоту + 0,5% уранилацетат (см. Таблицу материалов) при 4 °C.
   6. На следующий день обезвожьте органоиды с помощью ацетонового ряда (80% ацетона, 90% ацетона, 96% ацетона и 100% ацетона) в течение 15 минут (два раза).
   7. Очистите органоиды с помощью оксида пропилена в течение 10 минут (два раза), а затем поместите органоиды в смесь эпон:оксид пропилена (см. Таблицу материалов) на 30 минут при комнатной температуре.
   8. Добавьте к органоидам новый раствор эпона и инкубируйте в течение ночи при 4 °C.
   9. На следующий день налейте новый свежий раствор эпона в базовую форму, а затем заделайте органоиды. Поместить в инкубатор на 48 ч при температуре 65 °С для полимеризации.
   10. Разрежьте органоидные эпонные блоки с помощью набора ультрамикротома до толщины сечения 50-100 нм. Выложите срезы на форму, покрытую сеткой.
3. Измерьте активность фермента CYP3A4.
   1. Измерьте активность CYP с помощью имеющегося в продаже набора (см. Таблицу материалов) в соответствии с инструкциями производителя.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Ферменты CYP превращают субстрат в обнаруживаемый промежуточный продукт 11,12,13. Существует два варианта измерения активности фермента CYP (клеточный литический и нелитический). Набор предназначен для анализа базальной активности CYP и индуцированной активности CYP после лечения компаундами.
   2. Проведите эксперимент в трех экземплярах. Считайте люминесценцию с помощью люминометра, и рассчитайте сигнал. Для нормализации проводят трипсинизацию органоидов, а также подсчитывают количество клеток.
4. Выполните количественное определение альбумина человека.
   1. Замените среду для культивирования клеток свежей средой за 24 ч до теста методом ИФА. После 24 ч инкубации соберите среду для культивирования клеток (300-500 мкл) и центрифугируйте при 500 x g (при 4 °C) в течение 2 мин для удаления клеточного мусора и частиц. Выделите надосадочную жидкость и храните образцы при температуре −80 °C (до 3 месяцев).
   2. Запустите стандарт и образец в двух экземплярах. Созревшие органоиды выделяют альбумин в культуральную среду; количественно определить этот альбумин с помощью набора для количественного определения методом ИФА (см. Таблицу материалов). Измерьте абсорбцию с помощью планшетного ридера ELISA с длиной волны 450 нм в течение 30 мин после прекращения добавления раствора. Трипсинизируйте органоиды и подсчитайте количество клеток для нормализации.
5. Проведите анализ на удаление аммиака.
   1. Проводите анализ на удаление аммиака в соответствии с инструкциями производителя (см. Таблицу материалов). Кратко добавьте 1,5 мМ NH₄Cl в питательную среду и инкубируйте в течение 24 ч.
   2. После инкубации определите концентрацию аммиака с помощью набора для анализа на аммиак (см. Таблицу материалов). Рассчитайте измерения с помощью многорежимного многопланшетного считывателя и нормализуйте значения по номерам ячеек.
6. Выполните анализ холилглимиламидо-флуоресцеина (CLF).
   1. Кратко обработайте органоиды 10 мкмоль/л CLF (см. Таблицу материалов) и инкубируйте в течение 1 ч в инкубаторе при температуре 37 °C. После инкубации промойте органоиды 1x PBS. Выполняйте визуализацию с помощью флуоресцентной микроскопии.
7. Выполнение анализа экспрессии генов.
   1. Следуйте инструкциям набора RNeasy (см. Таблицу материалов), чтобы выделить общую РНК из eHEPO.
   2. Настройте реакцию ПЦР с использованием имеющейся в продаже мастер-смеси (см. Таблицу материалов), следуя инструкциям производителя. После приготовления ПЦР-смеси для каждого набора праймеров поместите по 10 мкл каждого образца в 96-луночные планшеты для количественной ПЦР (Таблица 1).
   3. Запечатайте пластины с помощью клеевого герметика, а затем центрифугируйте пластины при давлении 1 000 x g в течение 2 минут при комнатной температуре. Загрузите планшеты в ПЦР-машину. Нормализуйте относительную экспрессию генов по внутреннему контролю (RPL41, табл. 1) и проанализируйте с помощью метода 2−ΔΔCt ¹⁴.

6. Криоконсервация eHEPOs

1. Маркируйте криовиалы азотостойким маркером. Проверьте уровень изопропанола в контейнере для заморозки и держите его на уровне 4 °C в течение 15-30 минут перед началом эксперимента.
2. Заморозьте одну каплю BMM объемом 50 мкл в одном криовиале. Продолжайте механическую диссоциацию органоидов, как описано в шаге 4.3. После диссоциации клеточный агрегат ресуспендируют в 500 мкл холодной замораживающей среды, затем аккуратно переносят суспензию в криовиалы и хранят их в контейнере для заморозки.
3. Перенесите контейнер для заморозки клеток на температуру −80 °C, а через 24 ч перенесите криовалиальные контейнеры в жидкий азот для длительного хранения.

7. Размораживание eHEPO

1. Предварительно подогрейте водяную баню и добавьте Ad-DMEM/F12 до 37 °C.
2. Извлеките один флакон eHEPOs из хранилища жидкого азота в криогенных перчатках. Поместите флакон на водяную баню при температуре 37 °C, пока кристаллы льда не растают. Перенесите клеточную суспензию в коническую пробирку объемом 15 мл и центрифугируйте при 200 x g в течение 5 минут при 4°C.
3. Аспирируйте надосадочную жидкость и приступайте к посеву eHEPO, как описано в разделе 4. Наложите на каплю BMM расширяющую среду с добавлением 10 мкМ Y-27632 (см. Таблицу материалов). Обновляйте среду каждые 3 дня, а через 3 дня удаляйте ингибитор ROCK.

Результаты

Во-первых, клетки фибробластов человека или мононуклеарные клетки периферической крови (PBMC) были культивированы и преобразованы в iPSCs посредством эписомального перепрограммирования. Свежая нокаутирующая сыворотка была необходима для получения здоровых иПСК. З...

Обсуждение

Настоящий протокол описывает комплексный способ получения, расширения и замораживания/размораживания печеночных органоидов, начиная с иПСК. Этот протокол охватывает все этапы, включая культивирование ИПСК на питателе и безфидерной культуре, двумерную дифференциро...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
15 mL conical centrifuge tubes	Corning	430052
37 °C water bath	Nüve	210.NB9
37 °C, 5 % CO2 incubator	Memmert	INCO 153
50 mL conical centrifuge tubes	Corning	430290
70 µm and 40 µm Cell strainer	Falcon	352350/ 352340
70% Ethanol	Sigma	1009832511
A1AT	Abcam	ab166610	Dilution: 1/500 (IF), 1/50 (IHC)
A-83.01 (TGF-β inhibitor)	Tocris Biosciene	2939
Acetone	Isolab	9,01,026
Adhesive Microscope Slide	Histobond	C981040
Advanced DMEM-F12	Gibco	12634-010
AFP	Abcam	ab3980	Dilution: 1/25 (IHC)
Agar	EMS	10200
ALB	Abcam	ab10241	Dilution: 1/100 (IF), 1/20 (IHC)
Alexa Flour 488 (Mouse)	Invitrogen	A11001	Dilution: 1/1000 (IF)
Alexa Flour 488 (Rabbit)	Invitrogen	A110034	Dilution: 1/1000 (IF)
Alexa Flour 594 (Mouse)	Invitrogen	A11005	Dilution: 1/1000 (IF)
Alexa flour 594 (Rabbit)	Invitrogen	A11037	Dilution: 1/1000 (IF)
Ammonia Assay Kit	Sigma-Aldrich	MAK-310
Ammonium cloride	Santa Cruz	sc-202936
B27 Supplement 50x	Gibco	12587010
Base mold	Sakura	4216
b-FGF	Peprotech	100-18B
Biosafety, CLASS II,SAFETY CABINET	Thermo	SAFE 2020
Calibrated pipettes	Gilson	F167380
Centrifuge	Eppendorf	5702
Cholylglycylamido-fluorescein	Corning	451041
Citrate Buffer pH 6.0	Bio-optica	15-M103
CK-18	Santa Cruz	sc-51582	Dilution: 1/100 (IF), 1/20 (IHC)
CK-19	Santa Cruz	sc-6278	Dilution: 1/100 (IF), 1/20 (IHC)
Confocal Microscope	Zeiss	LSM880
Cryogenic handling gloves and eye protection	Cryokit	5274
Cryostat	Leica	CM 1950
Cryovial tubes	Corning	430659
DAB	Roche	11718096001
DAPT	Sigma-Aldrich	a5942
Dexamethasone	Sigma-Aldrich	D4902
Dispase	Stem Cell Technologies	7923
DMEM F12	Gibco	31330038
E-CAD	Santa Cruz	sc-8426	Dilution: 1/100 (IF), 1/20 (IHC)
EDTA	Invitrogen	15575-020
Electron Microscope	Zeiss	Sigma500
ELISA kit	Fortis life sciences bethyl	E88-129
Embed 812 Embedding Kit	EMS	14121
Entellan	Merck	107961
Eosin Y %1	Sigma-Aldrich	HT110332
EpCAM	Miltenyi Biotec	130-059-901	Dilution: 1/11 (FACS)
Ethanol	Merck	1,00,98,32,511
Fetal Bovine Serum (FBS)	Gibco	26010066
Forskolin (FSK)	Tocris Biosciene	1099
Freezing container (Mr. Frosty)	Thermo	5100-0001
Freezing Medium	Gibco	12648010
Glass Pasteur pipette	Isolab	084.01.001
Glutamax 100x	Gibco	35050-068
Gluteraldehyde %25, EM grade	EMS	16210-1L
Goat Anti-Mouse HRP	Thermo Fisher	62-6520	Dilution: 1/1000 (IHC)
Goat Anti-Rabbit HRP	Thermo Fisher	31460	Dilution: 1/1000 (IHC)
Goat Serum	Gibco	162-10-072
H2O2	Merck	107209
Hematoxylin	Millipore	HX86017674
HEPES, 1 M	Gibco	15630-056
HNF-4α	Abcam	ab55223	Dilution: 1/50 (IHC)
Ice and dry ice	homemade	homemade
Incubator (65 °C)	Nüve	EN 400
Isopropanol	Sigma-Aldrich	24137
Leu15 Gastrin I human	Sigma-Aldrich	G9145
Luminometer	Berthold Tech	LB 960
Master mix	Applied Biosystems	43676659
Matrigel matrix, hESC-Qualified	Corning	354277
Matrigel matrix, phenol-red-free	Corning	356231
Methanol	Merck	179337
Microcentrifuge tubes	Axygen	321-02-501
Microscope	Zeiss	AXIO VERT A1
Microtome blade	Feather	S35, C35
mTeSR1	Stem Cell Technologies	sc-05850
Multi well suspension culture plates	Sarstedt	83,39,21,500
N2 supplement 100x	Gibco	17502048
N-Acetylcysteine	Sigma-Aldrich	A9165
Neutral Buffered Formalin %10	Tekkim	TK.60161.05001
Nicotinamide	Sigma-Aldrich	N0636
Non-essential Amino Acide (NEAA)	Gibco	11140050
OCT	Tissue-Tek	4583
Osmium tetroxide	EMS	19110
P450-Glo Assays kit	Promega	V9001
Pap-pen	Sigma	Z377821-1EA
Paraffin	Tekkim	TK.200661.01002
PAS stain kit	Abcam	ab150680
PBS	Lonza	be17-516
Penicillin/Streptomycin	Gibco	15630-056
Phosphotungustic acid	Ted Pella	19402
Pipette aid	Axygen	Motopet-1
Plate reader varioskan flash	Thermo	5250040
Prolong Antifade Mountant	Invitrogen	P36980
Propylene Oxide, EM grade	EMS	20401
Real Time PCR system	Applied Biosystems	7500 Fast
Recombinant human Activin A	R&D	338-Ac-050
Recombinant human BMP7	Peprotech	120-03
Recombinant human EGF	Peprotech	af-100-15
Recombinant human FGF10	Peprotech	100-26
Recombinant human FGF19	Peprotech	100-32
Recombinant human HGF	Peprotech	100-39
Rho kinase inhibitor, Y-27632 dihydrochloride	Sigma-Aldrich	Y0503
RNase/DNase free 1.5 mL tube	Axygen	31108101
RNase/DNase free filter tips	Sarstedt	703031255
Rotary Microtome	Leica	RM 2245
RPMI 1640 Medium	Gibco	61870010
Rspo1-conditioned medium	Homemade
Slide master	Bio-optica	15-MEQ001
Sorenson’s Phosphate Buffer	EMS	11600-10
Spinner	Thermo	MY SPIN 6
Sterile serological pipettes	Falcon	357543
Tissue Casette	Leica	3802240
Trimmer	Leica	EM TRIM2
Triton X-100	Thermo Scientific	28314
TrypLE Express Enzyme	Gibco	12605010
Trypsin-EDTA	Gibco	25200-056
Ultramicrotome	Leica	EM UC7
Uranylacetate	EMS	22400
Vortex	Thermo	88880018
Wnt Surrogate-Fc Fusion Protein	ImmunoPrecise	N001
Xylene	Sigma	16446
ZO-1	Invitrogen	40-2200	Dilution: 1/400 (IF)