Erzeugung von funktionellen endodermalen Leberorganoiden

Zusammenfassung

Dieses Protokoll beschreibt die Erzeugung von schnellen und reproduzierbaren endodermalen Leberorganoiden (eHEPOs). Mit diesem Protokoll können eHEPOs innerhalb von 2 Wochen hergestellt werden und langfristig (mehr als 1 Jahr) expandieren, ohne ihre Differenzierung und Funktionalität zu verlieren.

Zusammenfassung

Die Organoid-Technologie hat es uns ermöglicht, eine Vielzahl von menschlichen organähnlichen Ministrukturen, z. B. für Leber, Gehirn und Darm, in vitro zu erzeugen. Die bemerkenswerten Fortschritte bei Organoidmodellen haben in jüngster Zeit eine neue experimentelle Ära für verschiedene Anwendungen in der Krankheitsmodellierung, Entwicklungsbiologie und Wirkstoffforschung eröffnet. Adulte Stammzellen oder von induzierten pluripotenten Stammzellen (iPSC) abgeleitete Leberorganoide steuern die Bildung von Hepatozyten, die für verschiedene Anwendungen verwendet werden können. Hier stellen wir ein robustes und reproduzierbares Protokoll zur Generierung von Leberorganoiden aus pluripotenten Stammzellen vor. Dieses Protokoll ist auf gesunde und von Patienten stammende Zellen anwendbar. Um 3D-Endoderm-abgeleitete Leberorganoide (eHEPOs) zu erhalten, wurden iPSCs zunächst direkt in endodermale Zellen differenziert, und dann wurden FACS-angereicherte EpCAM-positive (EpCAM+) Zellen verwendet, um Leberorganoide unter Verwendung des Expansionsmediums zu etablieren. Wir bieten eine schnelle und effiziente Methode zur Erzeugung von Leberorganoiden innerhalb von 2 Wochen. Die erzeugten Organoide ahmen die wesentlichen Eigenschaften und Funktionen von Hepatozyten nach, wie z. B. die Albuminsekretion, die Glykogenspeicherung und die Aktivität des Cytochrom-P450-Enzyms. Neben den leberspezifischen Ähnlichkeiten der Genexpression bestehen eHEPOs aus polarisierten Epithelzellen mit Gallenkanälen dazwischen. Darüber hinaus können eHEPOs langfristig (1 Jahr) expandiert und seriell durchlaufen werden, ohne ihre Fähigkeit zur Differenzierung in reife Hepatozyten zu verlieren. Somit stellen eHEPOs eine alternative Quelle für die Produktion funktionsfähiger Hepatozyten dar.

Einleitung

Organoide sind miniaturisierte organähnliche Strukturen, die unter 3-dimensionalen Kulturbedingungen gezüchtet werden, die die Mikroumgebung des Organs nachahmen und die intrinsischen Faktoren enthalten, die für die Selbstorganisation und Selbsterneuerung in der Organentwicklung selbst notwendig sind. Organoide können entweder aus pluripotenten Stammzellen (PSCs) oder adulten Gewebezellen (Stamm- oder Vorläuferzellen) gewonnen ^werden1. Obwohl ihre genaue organähnliche Organisation und funktionelle Ähnlichkeit mit dem spezifischen Organ sie zu wertvollen Werkzeugen für die Modellierung von Krankheiten machen, müssen sie noch weiter verbessert werden, was die Standardisierung in der Kultur betrifft. Insbesondere wurden mehrere Protokolle für die Erzeugung von Leberorganoiden veröffentlicht, die sich in ihrer Komplexität und Reproduzierbarkeit^{unterscheiden 2}. Zum Beispiel haben die von Takebe et al. entwickelten Leberknospen-Organoide die Form von dichten, mehrzelligen Strukturen, die die folgenden induzierten pluripotenten Stammzellen (iPSCs) enthalten: hepatische endodermale Vorläuferzellen, humane Nabelvenendothelzellen (HUVECs) und mesenchymale Stammzellen (MSCs). Diese Organoide haben jedoch keine langfristige Selbsterneuerungsfähigkeit ^3,4.

Aus historischer Sicht berichteten Huch et al. erstmals über die Produktion von humanen Leberepithel-Organoiden, die aus adultem Gewebe gewonnen wurden, in denen sich die Zellen polarisieren und spezialisieren, um Aspekte des nativen Epithels zu reproduzieren⁵. Dann verwendeten Guan et al. iPSC-abgeleitete Leberorganoide, um das Alagille-Syndrom (ALGS) zu modellieren, eine seltene genetische Störung, die mit einer Gallengangsreduktion in der Leber einhergeht⁶. Beide Organoide haben eine Selbsterneuerungsfähigkeit und können ausgereifte Hepatozytenfunktionen wie Gallen- und Albuminsekretion, Glykogenspeicherung und leberspezifische Arzneimittelentgiftung erlangen. In einer kürzlich durchgeführten Studie stellten Ramli et al. ein PSC-abgeleitetes Leberorganoid-Modell vor, das funktionelle Gallenkanal-Netzwerke zwischen polarisierten Hepatozyten-ähnlichen Zellen (HLCs) enthält, die cholestatische Medikamente in Gallenzysten entleeren, die aus cholangiozytenähnlichen Zellen (CLCs) ^bestehen7.

Diese Studie stellt eine einzigartige Kultur zur Erzeugung von iPSC-abgeleiteten endodermalen Leberorganoiden, sogenannten eHEPOs, vor. Die iPS-Kultur und die Differenzierung in Endoderm werden Schritt für Schritt beschrieben, und die Erzeugung von eHEPOs aus angereicherten EpCAM+-Vorläuferzellen wird demonstriert. Abschließend wird die Charakterisierung der Funktionalität und strukturellen Organisation der eHEPOs, sowie die Kryokonservierung der Organoide beschrieben.

Protokoll

Die Genehmigungen für die experimentellen Schritte wurden von der lokalen Ethikkommission für klinische Forschung der Medizinischen Fakultät der Dokuz Eylul Universität eingeholt (2013/25-4, 12. Mai 2013; 2016/30-29, 24. November 2016).

1. Vorbereitung von Lösungen für die Zellkultur

1. Bereiten Sie das Endoderm-Differenzierungsmedium vor, indem Sie die folgenden Komponenten in einer Laminar-Flow-Haube mischen: 1 % B27, 100 ng/ml Activin A, Wnt3a oder 30 % wnt3a-CM und R-spo1 oder 10 % R-spo1-CM (siehe Materialtabelle).
2. Bereiten Sie den Puffer für die fluoreszenzaktivierte Zellsortierung (FACS) mit der folgenden Zusammensetzung vor: PBS, 1 mM EDTA, 25 mM HEPES, 1 % FBS.
3. Bereiten Sie das Expansionsmedium (EM) vor: 1 % N2, 1 % B27, 1,25 mM N-Acetyl-L-Cystein, 50 ng/mL EGF, 10 % R-spo1 konditioniertes Medium, 100 ng/mL FGF 10, 10 mM Nicotinamid, 5 μM A8301 und 10 μM Forskolin (FSK) in Advanced DMEM/F-12. Fügen Sie 10 nM Y-27632 und 0,3 nM WNT3a hinzu (siehe Materialtabelle).
   HINWEIS: Bewahren Sie das gesamte Medium maximal 2 Wochen bei 2-8 °C auf.
4. Bereiten Sie das Differenzierungsmedium (TM) vor: 1 % N2, 1 % B27, 10 nM Gastrin, 50 ng/mL EGF, 100 ng/mL FGF 10, 25 ng/mL HGF, 500 nM A8301, 10 μM DAPT, 25 ng/mL BMP7 und 30 μM Dexamethason in Ad-DMEM/F-12 (siehe Materialtabelle).
   HINWEIS: Bewahren Sie das gesamte Medium 2 Wochen lang bei 2-8 °C auf.

2. Auftauen der iPSCs auf der Feeder-freien Platte

1. Beschichten Sie die Zellkulturplatte mit Basalmembranmatrix (BMM).
   1. Tauen Sie eine Durchstechflasche mit einem Aliquot BMM über Nacht auf Eis oder mindestens 2 Stunden vor Beginn der Beschichtung auf. 6 ml kaltes DMEM/F-12 in ein konisches 15-ml-Röhrchen geben, sofort 80 μl aufgetautes BMM hinzufügen und gut mischen.
   2. Verwenden Sie mit Gewebekulturen behandelte Well-Platten, beschichten Sie die Kulturplatte mit BMM-Lösung und geben Sie sie ab, um die Oberfläche der Well-Platte zu bedecken. Inkubieren Sie die Platte vor der Verwendung mindestens 1 h in einem 37 °C heißen Inkubator. Verwerfen Sie nach der Inkubationszeit die BMM-Lösung, und fügen Sie sofort das iPSC-spezifische Medium hinzu.
2. Nehmen Sie ein Fläschchen mit iPS-Zellen mit kryogenen Handschuhen aus der Lagerung von flüssigem Stickstoff. Stellen Sie das Fläschchen sofort auf ein schwimmendes Röhrchengestell und tauchen Sie das Gestell in ein 37 °C heißes Wasserbad, bis die Eiskristalle geschmolzen sind.
   1. Nehmen Sie das Fläschchen aus dem Wasserbad und wischen Sie die Außenseite gründlich mit 70 % Ethanol ab. Platzieren Sie es dann in der Laminarhaube. Es ist wichtig, bei diesem Schritt schnell zu sein.
   2. Unter aseptischen Bedingungen werden die aufgetauten Zellen in einer laminaren Haube in ein steriles konisches 15-ml-Röhrchen mit 5 ml iPSC-spezifischem Medium überführt.
      1. Die Zellen bei 200 × g (bei Raumtemperatur) 3 min zentrifugieren. Entsorgen Sie den Überstand langsam, resuspendieren Sie die Zellen in 2 ml iPSC-spezifischem Medium, indem Sie einige Male sehr vorsichtig mit einer serologischen 5-ml-Pipette pipettieren, und säen Sie die Zellen in die beschichteten Wells.
   3. Bewegen Sie die Platte schnell, um die Zellen auf der Well-Oberfläche zu verteilen. Inkubieren Sie die Platte in den 37 °C heißen Inkubator mit 5 % CO₂ .
   4. Aktualisieren Sie das Kulturmedium jeden Tag.

3. Differenzierung des Endoderms

1. Beschichten Sie eine neue Well-Platte 1 h vor dem Aufteilen der iPSCs mit BMM, wie in Abschnitt 2 beschrieben.
2. Kontrollieren Sie die Integrität und Lebensfähigkeit der iPS-Zellen unter Lichtmikroskopie. Undifferenzierte iPS-Zellen sind Zellen mit großen Zellkernen, kleinem Zytoplasma und kompakten Zellkolonien mit ausgeprägten Kanten.
   HINWEIS: Es gibt zwei enzymatische Lösungen für die Spaltung von Zellen. Bei der Verwendung von Dispase (1 U/ml) müssen Bereiche mit differenzierten Zellen entfernt werden. Wird ein bestimmtes Enzym verwendet, entfällt die manuelle Unterscheidung der Regionen durch Schaben oder Absaugen. Bewahren Sie das spezifische Enzym bei Raumtemperatur auf.
3. Erwärmen Sie den iPSC medium auf Raumtemperatur. Saugen Sie das Medium an und spülen Sie die iPSC-Platte mit DMEM/F-12 oder D-PBS. Geben Sie 1 ml des spezifischen Enzyms in eine Vertiefung einer 6-Well-Platte, inkubieren Sie 1 Minute lang bei Raumtemperatur, aspirieren Sie dann das spezifische Enzym und inkubieren Sie die Platte 5-7 Minuten lang bei 37 °C.
   HINWEIS: Die optimale Behandlungszeit mit Enzymen sollte auf der Grundlage der verwendeten iPSC-Linie optimiert werden.
4. Fügen Sie nach der Inkubationszeit 1 ml vorgewärmtes iPSC-Medium hinzu und klopfen Sie vorsichtig auf die Seite der Platte, um undifferenzierte Kolonienaggregate von der Oberfläche der Platte zu lösen. Die optimale Größe der Aggregate liegt bei 50-200 μM.
   1. Mischen Sie die Suspension vorsichtig mit einer serologischen 5-ml-Pipette und säen Sie dann die Zellsuspension in der gewünschten Dichte auf die BMM-beschichtete Vertiefung. Inkubieren Sie die Zellen 3-5 Tage lang bei 37 °C, um eine Konfluenz von 70 % zu erreichen.
5. Bevor Sie mit der Differenzierung beginnen, ersetzen Sie das iPSC-Medium durch das Endodermmedium (Schritt 1.1). Frischen Sie das Medium jeden Tag auf. Kontrollieren Sie die morphologischen Veränderungen der Zellen während der Differenzierungsschritte. Nach der Differenzierung beginnen Zell-Zell-Interaktionen zu erscheinen, und die Zellen erhalten eine stachelige Form.

4. Errichtung des eHEPO

1. Führen Sie die Anreicherung der endodermalen EpCAM+-Zellen mit FACS durch.
   1. Tauen Sie ein Fläschchen mit organoidspezifischem BMM (siehe Materialtabelle) vor dem Zellsortierexperiment auf Eis auf. Wärmen Sie die Gewebekulturplatten vor dem Zellsortierversuch über Nacht auf 37 °C vor.
   2. Spülen Sie die Endodermzellen mit 1x PBS. 300 μl Trypsin zugeben und 5 Minuten im Inkubator inkubieren. Fügen Sie 3 ml kaltes DMEM-F12 hinzu und pipetieren Sie mit 1.000 μl Filterspitzen, um einzelne Zellen zu erzeugen.
   3. Sammeln Sie die Zellsuspension in einem konischen 15-ml-Röhrchen. Zentrifugieren Sie die Zellen bei 300 x g (bei Raumtemperatur) für 5 min. Den Überstand verwerfen und das Pellet mit 10 ml FACS-Puffer waschen (Schritt 1.2).
   4. Um eine einzellige Suspension herzustellen, filtrieren Sie die Zellen zunächst mit einem 100-μm-Sieb und dann mit einem 40-μm-Sieb.
      HINWEIS: Spülen Sie vor der Verwendung des Siebs die Oberfläche des Siebs mit 1 ml FACS-Puffer ab.
   5. Die Zellsuspension bei 300 x g (bei Raumtemperatur) 5 min zentrifugieren. Zählen Sie die Zellzahl mit Trypan Blue⁸.
   6. Das Verhältnis für die Färbung beträgt 1:11. Resuspendieren Sie z. B. 15 x 10⁶ Zellen mit 105 μl FACS-Puffer und fügen Sie 45 μl FcR und 15 μl EpCAM hinzu (siehe Materialtabelle). Inkubieren Sie die Zellen 10 Minuten lang bei 40 °C und schützen Sie das Röhrchen vor Licht. Nach der Inkubation fügen Sie 500 μl FACS-Puffer hinzu, um die Zellsuspension zu waschen. Zentrifugieren Sie die Zellen bei 300 x g (bei Raumtemperatur) für 5 min.
   7. Resuspendieren Sie das Pellet in 500 μl FACS-Puffer. Geben Sie DAPI (0,5 μM/1 ml, Endkonzentration) zur Zellsuspension, um die abgestorbenen Zellen zu quantifizieren. Bewahren Sie die Zellen auf Eis auf, bis Sie mit dem Zellsortierschritt beginnen.
2. Betten Sie die EpCAM und sortierten Zellen in BMM ein. Nach der Zellsortierung zentrifugieren Sie die Zellen bei 300 x g für 5 min, um den FACS-Puffer zu entziehen. Entfernen Sie den Überstand und resuspendieren Sie 3.000-5.000 Zellen in 20 μl BMM.
   1. Säen Sie die Zellen aus, indem Sie ein Tröpfchen BMM in die Mitte jeder 48-Well-Platte geben. Inkubieren Sie die Zellen 2 Minuten lang bei 37 °C, bis das BMM erstarrt ist. Drehen Sie die Platte vorsichtig zurück und bewahren Sie sie weitere 10 Minuten im Inkubator auf. Überlagern Sie das Tröpfchen mit dem Expansionsmedium (250 μl pro Vertiefung für eine 48-Well-Platte).
   2. Frischen Sie das Organoid-Medium alle 3 Tage auf. An den Tagen 10-11 wird die Größe des Organoids größer als 100 μm sein.
3. Führen Sie die mechanische Dissoziation und Differenzierung von eHEPO durch.
   1. Teilen Sie jedes Organoid-Tröpfchen im Verhältnis 1:4. Zum Teilen das Organoidmedium verwerfen und 500 μl kaltes Ad-DMEM/F12 hinzufügen. Mit 1.000 μL Filterspitzen pipettieren Sie die BMM-Tröpfchen kräftig.
   2. Sammeln Sie maximal 10 BMM-Tröpfchen in konische 15-ml-Röhrchen und fügen Sie 5 ml kaltes Ad-DMEM/F12 hinzu. Lassen Sie die Tube 3-5 Minuten auf Eis.
   3. Die Zellen bei 200 x g für 5 min bei 4 °C zentrifugieren. Entsorgen Sie den Überstand, bis 1 ml übrig ist. Pipettieren Sie das Küvettenpellet 30-40 Mal kräftig mit 200-μl-Filterspitzen. Überprüfen Sie die Größe des Organoids unter dem Lichtmikroskop und vermeiden Sie sorgfältig die Bildung einer einzelligen Suspension.
   4. Nach der mechanischen Dissoziation werden 5 mL kaltes Ad-DMEM/F12 zugegeben und die Zellen bei 200 x g für 5 min bei 4 °C zentrifugiert.
   5. Entsorgen Sie den Überstand und bewahren Sie die Suspension auf dem Eis auf, bis die Zellen ausgesät sind.
   6. Entkernen Sie ein 50-μl-BMM-Tröpfchen (enthält 35 μl BMM + 15 μl Zellen und Ad-DMEM/F-12 pro Well für eine 24-Well-Platte).
   7. Geben Sie BMP7 (25 ng/ml, siehe Materialtabelle) in das EM-Medium und kultivieren Sie es 3 Tage lang. Ersetzen Sie am 4. Tag das Medium durch das Differenzierungsmedium (Schritt 1.4). Frischen Sie das Medium alle 3 Tage auf und kultivieren Sie die Zellen mindestens 14 Tage lang.

5. Charakterisierung von eHEPOs

1. Führen Sie histologische Untersuchungen durch.
   1. Führen Sie die Paraffineinbettung durch.
      1. Entfernen Sie das Medium, fügen Sie 1-2 ml kaltes 1x PBS hinzu und resuspendieren Sie das BMM vorsichtig in dem kalten 1x PBS. Übertragen Sie die Organoide vorsichtig in ein 15-ml-Zentrifugenröhrchen. Lassen Sie die Organoide unter der Schwerkraft absetzen und saugen Sie das PBS dann vorsichtig an. Wiederholen Sie den Waschschritt dreimal.
      2. Geben Sie 10 ml frisches Fixiermittel (10 % neutrales gepuffertes Formalin) zu den Organoiden und inkubieren Sie es 30 Minuten lang. Entfernen Sie vorsichtig das Fixiermittel, fügen Sie 10 ml kaltes 1x PBS hinzu und inkubieren Sie es 10 Minuten lang. Saugen Sie das PBS vorsichtig an.
      3. Färben Sie die Organoide in 0,5%iger Eosinlösung (siehe Materialtabelle), gelöst in 96%igem Ethanol für 30 min bei Raumtemperatur.
         HINWEIS: Wenn eine Immunfärbung durchgeführt werden soll, färben Sie nicht mit Eosin.
      4. Dehydrieren Sie die Organoide, indem Sie sie mit einer Alkoholserie (70 % Ethanol, 80 % Ethanol und 96 % Ethanol) jeweils 5 Minuten lang bei Raumtemperatur waschen. Die Organoide 30 min in 100% Ethanol (absolutes Ethanol) einweichen.
      5. Reinigen Sie die Organoide mit Xylol (siehe Materialtabelle) dreimal für jeweils 20 Minuten⁹.
         ACHTUNG: Xylol ist eine sehr giftige und brennbare Verbindung, also gehen Sie mit geeigneter Sicherheitsausrüstung damit um. Vermeiden Sie es, in großen Mengen zu arbeiten.
      6. Übertragen Sie die Organoide vorsichtig mit einer Kunststoffpipette in eine vorgewärmte Metallgrundform (siehe Materialtabelle) mit geschmolzenem Paraffin. Halten Sie die Organoide dreimal für jeweils 30 min in geschmolzenem Paraffin in einem 65 °C heißen Inkubator (ersetzen Sie diesen bei jedem Wechsel durch neues, frisch geschmolzenes Paraffin).
      7. Betten Sie dann die Organoide in neues, frisches Paraffin ein. Schieben Sie die Organoide vorsichtig in die Mitte der Metallgrundform.
         HINWEIS: Für diesen Schritt ist es entscheidend, schnell zu arbeiten, da sich Paraffin bei Raumtemperatur verfestigt.
      8. Übertragen Sie die Metallgrundform für 10-20 s auf die Kühlplatte, um die Organoide zu stabilisieren. Gießen Sie dann geschmolzenes Paraffin, um die Metallgrundform zu bedecken, und fügen Sie eine Taschentuchkassette (siehe Materialtabelle) auf der Oberseite der Metallgrundform zum Beschriften hinzu. Stellen Sie sicher, dass sich genügend Paraffin in der Form befindet, und lassen Sie sie dann auf der Kühlplatte erstarren. Entferne die Metallgrundform.
      9. Schneiden Sie 5-7 μm dicke Abschnitte mit einem Standardmikrotom (siehe Materialtabelle). Platzieren Sie serielle Paraffinschnitte auf selbstklebenden Objektträgern. Lassen Sie die Dias über Nacht trocknen.
   2. Führen Sie Hämatoxylin- und Eosin- (H&E) und periodische Säure-Shiff (PAS)-Färbungen durch.
      1. Legen Sie die in Paraffin eingebetteten Objektträger über Nacht zur Entparaffinisierung in einen 63 °C heißen Inkubator. Legen Sie die Objektträger am nächsten Tag dreimal für jeweils 20 Minuten in Xylol. Lassen Sie die Objektträger nicht austrocknen.
      2. Rehydrieren Sie die Objektträger 2 Minuten lang mit einer abgestuften Alkoholserie (100 % Ethanol, 96 % Ethanol, 80 % Ethanol und 70 % Ethanol). Legen Sie dann die Objektträger für 1 Minute in das destillierte Wasser.
      3. Führen Sie für die H&E-Färbung die folgenden Schritte aus.
      4. Legen Sie die Objektträger für 5 Minuten in Hämatoxylinlösung. Spülen Sie die Objektträger 5 Minuten lang unter fließendem Leitungswasser ab. Färben Sie die Objektträger 10 s lang mit 1%iger Eosin-Y-Lösung (siehe Materialtabelle).
      5. Die Abschnitte werden mit einer Reihe von 80 % Ethanol, 96 % Ethanol und zwei Wechseln von 100 % Ethanol für jeweils 30 s dehydriert.
      6. Legen Sie die Objektträger dreimal für jeweils 20 Minuten in das Xylol zum Reinigen.
      7. Montieren Sie Deckgläser vorsichtig mit einem Montagemedium auf die Profile der Objektträger (siehe Materialtabelle). Stellen Sie sicher, dass keine Blasen mehr vorhanden sind.
      8. Für die PAS-Färbung führen Sie die Schritte 5.1.2.4-5.1.2.6 durch, gefolgt von den Verfahren für die PAS-Färbung, wie von Akbari et ^al.10 berichtet. Montieren Sie dann die Deckgläser vorsichtig mit dem Montagemedium auf die Sektionen auf den Objektträgern. Stellen Sie sicher, dass keine Blasen mehr vorhanden sind.
   3. Führen Sie eine immunhistochemische (IHC) Färbung durch.
      1. Führen Sie die Schritte 5.1.2.1 und 5.1.2.2 im H&E-Färbeprotokoll aus.
      2. Die Objektträger in 0,1 M Citratpuffer (pH 6,0) in der Mikrowelle 10 min erhitzen.
      3. Halten Sie die Objektträger, bis sie auf Raumtemperatur abgekühlt sind (ca. 20 Minuten), und spülen Sie die Objektträger mit destilliertem Wasser ab.
      4. Legen Sie die Objektträger für 10_{min bei} Raumtemperatur in frisch zubereitetes 3%iges H₂O 2 in Methanol hinein. Spülen Sie dann die Objektträger 1 Minute lang in destilliertem Wasser ab.
      5. Blockieren Sie die unspezifische Bindung von Primer-Antikörpern, indem Sie die Schnitte mit einer Blockierungslösung (2 % Serum + 0,1 % Triton X-100 + 0,1 % BSA) bei Raumtemperatur für 1 h inkubieren.
      6. Entfernen Sie vorsichtig die Blockierungslösung und fügen Sie die Primärantikörper (E-CAD, ALB, EpCAM, A1AT, CK19) (siehe Materialtabelle) hinzu, die über Nacht in der Blockierungslösung bei 4 °C verdünnt sind.
      7. Spülen Sie die Objektträger am nächsten Tag zweimal 10 min lang vorsichtig aus (.
      8. Geben Sie die Sekundärantikörper (Goat Anti-Rabbit, Goat Anti-Mouse) (siehe Materialtabelle) für 1 h bei Raumtemperatur und spülen Sie die Objektträger 5 min lang (dreimal) in destilliertem Wasser ab.
      9. Bereiten Sie 3'3 Diaminobenzidintetrahydrochlorid (DAB, siehe Materialtabelle) Lösung vor (diese muss 30 Minuten vor Gebrauch hergestellt werden).
      10. Tragen Sie die DAB-Lösung 1-5 Minuten lang auf die Objektträger auf und spülen Sie die Objektträger 5 Minuten lang (dreimal) in destilliertem Wasser ab.
      11. Färben Sie die Abschnitte 1 Minute lang mit Hämatoxylin und spülen Sie die Objektträger 1 Minute lang unter fließendem Leitungswasser ab.
      12. Die Abschnitte werden mit einer Reihe von 80 % Ethanol, 96 % Ethanol und zwei Wechseln von 100 % Ethanol für jeweils 30 s dehydriert.
      13. Legen Sie die Objektträger 20 Minuten lang (dreimal) in Xylol.
      14. Montieren Sie das Deckglas vorsichtig mit einem Montagemedium auf den Abschnitt auf dem Objektträger. Stellen Sie sicher, dass keine Blasen mehr vorhanden sind.
   4. Führen Sie die OAT-Einbettung durch.
      1. Fixieren Sie die Organoide mit frisch zubereitetem kaltem 4%igem PFA über Nacht bei 4 °C. Entfernen Sie vorsichtig das Fixiermittel und waschen Sie es 15 Minuten lang (dreimal) mit 1x PBS.
      2. Bereiten Sie eine 30%ige Saccharoselösung (w/v) mit destilliertem Wasser vor. Entfernen Sie das 1x PBS und fügen Sie die 30% Saccharose hinzu, um die Organoide zu dehydrieren.
      3. Inkubieren Sie die Organoide über Nacht bei 4 °C. Anfangs schwimmen die meisten Gewebe in 30% Saccharose und sinken, sobald die Permeation abgeschlossen ist. Die Kryoprotektion kann zu diesem Zeitpunkt als abgeschlossen betrachtet werden.
      4. Bereiten Sie Trockeneis oder flüssigen Stickstoff für den Einbettungsprozess vor.
      5. Geben Sie zwei bis drei Tropfen OCT (siehe Materialtabelle) in Kryoformen aus Kunststoff. Legen Sie die Organoide in der richtigen Ausrichtung für den Schnitt darauf.
      6. Gießen Sie das OCT langsam und vorsichtig auf die Organoide. Achten Sie darauf, Blasen zu vermeiden. Lassen Sie die Organoide 10-15 Minuten bei Raumtemperatur unter der Schwerkraft absetzen.
      7. Beschriften Sie die Kryoformen vor dem Gefrierschritt. Legen Sie die Formen zum schnellen Einfrieren auf Trockeneis oder flüssigen Stickstoff. Übertragen Sie die Kryoformen auf -80 °C und lagern Sie sie dort bis zum Trennprozess.
   5. Führen Sie eine Immunfluoreszenzfärbung (IF) durch.
      1. Führen Sie eine Färbung im Schnellschliff durch.
         1. Trocknen Sie die Kryo-Schnitte 20-30 Minuten lang bei Raumtemperatur an der Luft. Rehydrieren Sie die Objektträger 5 Minuten lang (dreimal) mit destilliertem Wasser. Umgeben Sie das Gewebe mit einer hydrophoben Barriere mit einem Pap-Pen (siehe Materialtabelle).
         2. 200-300 μl 0,2 % Triton X-100 pro Schnitt zugeben. Waschen Sie die Objektträger vorsichtig 5 Minuten lang (dreimal). Achten Sie darauf, dass die Teile während der Waschschritte nicht von den Rutschen fallen.
         3. Blockierungslösung (2 % Serum + 0,1 % Triton X-100 + 0,1 % BSA) 1 h lang bei Raumtemperatur zugeben.
         4. Entfernen Sie vorsichtig die Blockierungslösung, fügen Sie die in der Blockierungslösung verdünnten Primärantikörper (E-CAD, A1AT, HNF4α) hinzu (siehe Materialtabelle) und inkubieren Sie die Objektträger über Nacht bei 4 °C.Spülen Sie die Objektträger am nächsten Tag vorsichtig 10 Minuten lang (zweimal) aus.
         5. Geben Sie geeignete Sekundärantikörper (Alexa Fluor 488 [Maus], Alexa Fluor 594 [Maus], Alexa Fluor 594 [Kaninchen]) für 1 h bei Raumtemperatur (siehe Materialtabelle) und spülen Sie die Objektträger 5 Minuten lang (dreimal) in destilliertem Wasser ab.
         6. 100-200 μl Hoechst oder DAPI Kernfarbstoff pro Schnitt für 3 min zugeben, die Objektträger mit 1x PBS waschen und den Waschschritt dreimal wiederholen.
         7. Montieren Sie die Deckgläser mit einem lichtbeständigen Einbettmedium auf die Profile der Objektträger. Bewahren Sie die Objektträger über Nacht bei 4 °C auf und schützen Sie sie bis zum Bildgebungsprozess vor Licht.
      2. Führen Sie eine Färbung für das gesamte Passepartout durch.
         1. Führen Sie die Schritte 5.1.1.1 und 5.1.1.2 des Paraffineinbettungsverfahrens aus.
         2. Fügen Sie Blockierungslösung hinzu (0,1%-1% Triton X-100, 1% DMSO, 1% BSA und 1% Ziegenserum in 1x PBS, siehe Materialtabelle) und inkubieren Sie die Organoide mit Blockierungslösung für 2-3 h bei Raumtemperatur.
         3. Entfernen Sie vorsichtig die Blockierungslösung und fügen Sie die Primärantikörper (CK19, CK18, ZO-1, ALB) hinzu, die über Nacht bei 4 °C in der Blockierungslösung verdünnt wurden (siehe Materialtabelle).
         4. Am nächsten Tag entfernen Sie die Lösung vorsichtig und fügen Sie 1x PBS hinzu. Lassen Sie die Organoide bis zu 10 Minuten unter der Schwerkraft ruhen. Entfernen Sie die Lösung vorsichtig und wiederholen Sie den Waschschritt dreimal.
         5. Inkubieren Sie die Organoide mit den Sekundärantikörpern (Alexa Fluor 594 [Maus], Alexa Fluor 488 [Kaninchen], Alexa Fluor 488 [Maus]) für mindestens 1 h bei Raumtemperatur. Entfernen Sie die Lösung vorsichtig und wiederholen Sie den Waschschritt viermal.
         6. Für die Kernfärbung inkubieren Sie die Organoide 10 min lang mit Hoechst- oder DAPI-Kernfarbstoff. Waschen Sie die Organoide mit 1x PBS und wiederholen Sie den Waschschritt dreimal. Lassen Sie die Organoide am Boden des Röhrchens absetzen.
         7. Entfernen Sie mit einer Pasteurpipette aus Kunststoff die Organoide aus dem Röhrchen und legen Sie sie auf Objektträger. Stellen Sie sicher, dass die Organoide so wenig wie möglich beschädigt werden.
         8. Entfernen Sie das überschüssige PBS und fügen Sie eine Menge (ein bis zwei Tropfen) Eindeckmedium hinzu. Montieren Sie die Deckgläser vorsichtig mit dem Eindeckmedium auf die Organoide auf den Objektträgern. Bewahren Sie die Objektträger bei 4 °C auf und schützen Sie sie bis zum Bildgebungsprozess vor Licht.
2. Führen Sie Elektronenmikroskopie durch.
   1. Fixieren Sie die Organoide mit Karnovsky-Lösung (2,5 % gepuffertes Glutaraldehyd + 2 % Paraformaldehyd in 0,1 M Natriumphosphatpuffer [Sorensen-Puffer], pH 7,4, siehe Materialtabelle) über Nacht bei 4 °C.
   2. Waschen Sie die Organoide mit 0,1 M Sorenson-Puffer + 0,1 M Saccharose (1:1) für 15 min (dreimal). Anschließend werden die Organoide 90 Minuten lang in 2%igem Natriumphosphat-gepuffertem Osmiumtetroxid (siehe Materialtabelle) postfixiert.
   3. Betten Sie die Organoide in 2% warmes Agar ein. Schneiden Sie den überschüssigen Agar um die Organoide herum mit einer Lanzette ab. Waschen Sie die Organoide 15 Minuten lang (dreimal) in Sørensens Puffer.
   4. Dehydrieren Sie 15 Minuten lang (zweimal) mit 50% Aceton.
   5. Über Nacht mit 70 % Aceton + 1 % Phosphowolframsäure + 0,5 % Uranylacetat (siehe Materialtabelle) bei 4 °C kontrastieren.
   6. Am nächsten Tag dehydrieren Sie die Organoide mit einer Acetonreihe (80 % Aceton, 90 % Aceton, 96 % Aceton und 100 % Aceton) für 15 Minuten (zweimal).
   7. Reinigen Sie die Organoide 10 Minuten lang (zweimal) mit Propylenoxid und legen Sie die Organoide dann 30 Minuten lang bei Raumtemperatur in ein Epon:Propylenoxid-Gemisch (siehe Materialtabelle).
   8. Den Organoiden wird eine neue Epon-Lösung zugesetzt und über Nacht bei 4 °C inkubiert.
   9. Geben Sie am nächsten Tag eine neue, frische Eponlösung in die Grundform und betten Sie dann die Organoide ein. Zur Polymerisation 48 h bei 65 °C in einen Inkubator stellen.
   10. Schneiden Sie die organoiden Epon-Blöcke mit einem Ultramikrotom auf eine Schnittdicke von 50-100 nm. Legen Sie die Abschnitte auf formvar bedeckte Gitter.
3. Messen Sie die Aktivität des CYP3A4-Enzyms.
   1. Messen Sie die CYP-Aktivität mit einem im Handel erhältlichen Kit (siehe Materialtabelle) gemäß den Anweisungen des Herstellers.
      HINWEIS: CYP-Enzyme wandeln das Substrat in ein nachweisbares Zwischenprodukt 11,12,13 um. Es gibt zwei Optionen (cell lytic und nonlytic) zur Messung der CYP-Enzymaktivität. Das Kit bietet eine Anwendung zur Analyse der basalen CYP-Aktivitäten und der induzierten CYP-Aktivitäten nach der Behandlung mit Verbindungen.
   2. Führen Sie das Experiment in dreifacher Ausführung aus. Lesen Sie die Lumineszenz mit einem Luminometer ab und berechnen Sie das Signal. Zur Normalisierung trypsinisieren Sie die Organoide und zählen die Anzahl der Zellen.
4. Führen Sie eine Quantifizierung des menschlichen Albumins durch.
   1. Ersetzen Sie das Zellkulturmedium 24 h vor dem ELISA-Test durch ein frisches Medium. Nach 24 Stunden Inkubation das Zellkulturmedium (300-500 μl) auffangen und 2 Minuten lang bei 500 x g (bei 4 °C) zentrifugieren, um die Zelltrümmer und Partikel zu entfernen. Aliquotieren Sie den Überstand und lagern Sie die Proben bei -80 °C (bis zu 3 Monate).
   2. Führen Sie den Standard und die Stichprobe in doppelter Ausführung aus. Gereifte Organoide sezernieren Albumin in das Kulturmedium; Quantifizieren Sie dieses Albumin mit einem ELISA-Quantifizierungskit (siehe Materialtabelle). Messen Sie die Extinktion mit einem ELISA-Platten-Reader bei 450 nm innerhalb von 30 Minuten nach Beendigung der Lösungszugabe. Trypsinisieren Sie die Organoide und zählen Sie die Anzahl der zu normalisierenden Zellen.
5. Führen Sie den Ammoniak-Eliminations-Assay durch.
   1. Führen Sie den Ammoniak-Eliminations-Assay gemäß den Anweisungen des Herstellers durch (siehe Materialtabelle). Geben Sie kurz 1,5 mM NH₄Cl in das Kulturmedium und inkubieren Sie es 24 Stunden lang.
   2. Nach der Inkubation ist die Ammoniakkonzentration mit einem Ammoniak-Assay-Kit zu bestimmen (siehe Materialtabelle). Berechnen Sie die Messungen mit einem Multimode-Multiplatten-Lesegerät, und normalisieren Sie die Werte auf die Zellennummern.
6. Führen Sie den Cholylglycylamido-Fluorescein (CLF)-Assay durch.
   1. Kurz gesagt, die Organoide mit 10 μmol/L CLF behandeln (siehe Materialtabelle) und 1 h in einem 37 °C Inkubator inkubieren. Nach der Inkubation die Organoide mit 1x PBS waschen. Führen Sie die Bildgebung mit Hilfe der Fluoreszenzmikroskopie durch.
7. Führen Sie eine Genexpressionsanalyse durch.
   1. Befolgen Sie die Anweisungen des RNeasy-Kits (siehe Materialtabelle), um die Gesamt-RNA aus den eHEPOs zu isolieren.
   2. Richten Sie die PCR-Reaktion mit einem handelsüblichen Mastermix (siehe Materialtabelle) gemäß den Anweisungen des Herstellers ein. Nachdem Sie die PCR-Mischung für jedes Primer-Set vorbereitet haben, geben Sie 10 μl jeder Probe in die 96-Well-qPCR-Platten (Tabelle 1).
   3. Verschließen Sie die Platten mit Klebekleber und zentrifugieren Sie die Platten anschließend bei 1.000 x g für 2 min bei Raumtemperatur. Laden Sie die Platten in eine PCR-Maschine. Normalisieren Sie die relative Genexpression zu einer internen Kontrolle (RPL41, Tabelle 1) und analysieren Sie mit der 2-ΔΔCt-Methode ¹⁴.

6. Kryokonservierung der eHEPOs

1. Kryofläschchen mit einem stickstoffresistenten Marker kennzeichnen. Überprüfen Sie den Isopropanol-Gehalt des Gefrierbehälters und halten Sie ihn 15-30 Minuten lang bei 4 °C, bevor Sie mit dem Experiment beginnen.
2. Frieren Sie ein 50 μL BMM-Tröpfchen in einem Kryofläschchen ein. Fahren Sie mit der organoidmechanischen Dissoziation fort, wie in Schritt 4.3 beschrieben. Nach der Dissoziation resuspendieren Sie das Zellaggregat in 500 μl kaltem Gefriermedium, überführen Sie die Suspension dann vorsichtig in Kryoröhrchen und bewahren Sie sie im Gefrierbehälter auf.
3. Den Gefrierbehälter der Zellen auf -80 °C umstellen und nach 24 h die Kryofläschchen zur Langzeitlagerung in flüssigen Stickstoff überführen.

7. Auftauen der eHEPO

1. Ein Wasserbad und Ad-DMEM/F12 auf 37 °C vorwärmen.
2. Nehmen Sie ein Fläschchen mit eHEPOs mit Kryohandschuhen aus dem Flüssigstickstofflager. Stellen Sie das Fläschchen in ein 37 °C heißes Wasserbad, bis die Eiskristalle geschmolzen sind. Die Zellsuspension wird in ein konisches 15-ml-Röhrchen überführt und 5 Minuten lang bei 4 °C bei 200 x g zentrifugiert.
3. Aspirieren Sie den Überstand und fahren Sie mit der Aussaat der eHEPOs fort, wie in Abschnitt 4 beschrieben. Überlagern Sie das BMM-Tröpfchen mit dem mit 10 μM Y-27632 ergänzten Expansionsmedium (siehe Materialtabelle). Frischen Sie das Medium alle 3 Tage auf und entfernen Sie den ROCK-Hemmer nach 3 Tagen.

Ergebnisse

Zunächst wurden humane Fibroblastenzellen oder mononukleäre Zellen des peripheren Blutes (PBMC) kultiviert und durch episomale Reprogrammierung in iPSCs umgewandelt. Das frische Knockout-Serum war essentiell für die Gewinnung gesunder iPSCs. Dann wurden die iPSCs mit einer Konfluenz von 50 % bis 60 % in die BMM-beschichteten Kulturplatten ausgesät. Das Vorhandensein von iPS-Kolonien von kleiner bis mittlerer Größe verbesserte die Differenzierungseffizienz. Dann wurden die ...

Diskussion

Das vorliegende Protokoll beschreibt ein umfassendes Verfahren zum Erzeugen, Expandieren und Einfrieren/Auftauen von Leberorganoiden ausgehend von iPSCs. Dieses Protokoll deckt alle Schritte ab, einschließlich der Kultivierung der iPSCs auf dem Feeder und der feederfreien Kultur, der 2-dimensionalen Endodermdifferenzierung, der Anreicherung der Vorläuferzellen mit FACS und der Organoidbildung sowie der Generierung von Organoiden, die an Funktion gewinnen. Darüber hinaus werden detaill...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
15 mL conical centrifuge tubes	Corning	430052
37 °C water bath	Nüve	210.NB9
37 °C, 5 % CO2 incubator	Memmert	INCO 153
50 mL conical centrifuge tubes	Corning	430290
70 µm and 40 µm Cell strainer	Falcon	352350/ 352340
70% Ethanol	Sigma	1009832511
A1AT	Abcam	ab166610	Dilution: 1/500 (IF), 1/50 (IHC)
A-83.01 (TGF-β inhibitor)	Tocris Biosciene	2939
Acetone	Isolab	9,01,026
Adhesive Microscope Slide	Histobond	C981040
Advanced DMEM-F12	Gibco	12634-010
AFP	Abcam	ab3980	Dilution: 1/25 (IHC)
Agar	EMS	10200
ALB	Abcam	ab10241	Dilution: 1/100 (IF), 1/20 (IHC)
Alexa Flour 488 (Mouse)	Invitrogen	A11001	Dilution: 1/1000 (IF)
Alexa Flour 488 (Rabbit)	Invitrogen	A110034	Dilution: 1/1000 (IF)
Alexa Flour 594 (Mouse)	Invitrogen	A11005	Dilution: 1/1000 (IF)
Alexa flour 594 (Rabbit)	Invitrogen	A11037	Dilution: 1/1000 (IF)
Ammonia Assay Kit	Sigma-Aldrich	MAK-310
Ammonium cloride	Santa Cruz	sc-202936
B27 Supplement 50x	Gibco	12587010
Base mold	Sakura	4216
b-FGF	Peprotech	100-18B
Biosafety, CLASS II,SAFETY CABINET	Thermo	SAFE 2020
Calibrated pipettes	Gilson	F167380
Centrifuge	Eppendorf	5702
Cholylglycylamido-fluorescein	Corning	451041
Citrate Buffer pH 6.0	Bio-optica	15-M103
CK-18	Santa Cruz	sc-51582	Dilution: 1/100 (IF), 1/20 (IHC)
CK-19	Santa Cruz	sc-6278	Dilution: 1/100 (IF), 1/20 (IHC)
Confocal Microscope	Zeiss	LSM880
Cryogenic handling gloves and eye protection	Cryokit	5274
Cryostat	Leica	CM 1950
Cryovial tubes	Corning	430659
DAB	Roche	11718096001
DAPT	Sigma-Aldrich	a5942
Dexamethasone	Sigma-Aldrich	D4902
Dispase	Stem Cell Technologies	7923
DMEM F12	Gibco	31330038
E-CAD	Santa Cruz	sc-8426	Dilution: 1/100 (IF), 1/20 (IHC)
EDTA	Invitrogen	15575-020
Electron Microscope	Zeiss	Sigma500
ELISA kit	Fortis life sciences bethyl	E88-129
Embed 812 Embedding Kit	EMS	14121
Entellan	Merck	107961
Eosin Y %1	Sigma-Aldrich	HT110332
EpCAM	Miltenyi Biotec	130-059-901	Dilution: 1/11 (FACS)
Ethanol	Merck	1,00,98,32,511
Fetal Bovine Serum (FBS)	Gibco	26010066
Forskolin (FSK)	Tocris Biosciene	1099
Freezing container (Mr. Frosty)	Thermo	5100-0001
Freezing Medium	Gibco	12648010
Glass Pasteur pipette	Isolab	084.01.001
Glutamax 100x	Gibco	35050-068
Gluteraldehyde %25, EM grade	EMS	16210-1L
Goat Anti-Mouse HRP	Thermo Fisher	62-6520	Dilution: 1/1000 (IHC)
Goat Anti-Rabbit HRP	Thermo Fisher	31460	Dilution: 1/1000 (IHC)
Goat Serum	Gibco	162-10-072
H2O2	Merck	107209
Hematoxylin	Millipore	HX86017674
HEPES, 1 M	Gibco	15630-056
HNF-4α	Abcam	ab55223	Dilution: 1/50 (IHC)
Ice and dry ice	homemade	homemade
Incubator (65 °C)	Nüve	EN 400
Isopropanol	Sigma-Aldrich	24137
Leu15 Gastrin I human	Sigma-Aldrich	G9145
Luminometer	Berthold Tech	LB 960
Master mix	Applied Biosystems	43676659
Matrigel matrix, hESC-Qualified	Corning	354277
Matrigel matrix, phenol-red-free	Corning	356231
Methanol	Merck	179337
Microcentrifuge tubes	Axygen	321-02-501
Microscope	Zeiss	AXIO VERT A1
Microtome blade	Feather	S35, C35
mTeSR1	Stem Cell Technologies	sc-05850
Multi well suspension culture plates	Sarstedt	83,39,21,500
N2 supplement 100x	Gibco	17502048
N-Acetylcysteine	Sigma-Aldrich	A9165
Neutral Buffered Formalin %10	Tekkim	TK.60161.05001
Nicotinamide	Sigma-Aldrich	N0636
Non-essential Amino Acide (NEAA)	Gibco	11140050
OCT	Tissue-Tek	4583
Osmium tetroxide	EMS	19110
P450-Glo Assays kit	Promega	V9001
Pap-pen	Sigma	Z377821-1EA
Paraffin	Tekkim	TK.200661.01002
PAS stain kit	Abcam	ab150680
PBS	Lonza	be17-516
Penicillin/Streptomycin	Gibco	15630-056
Phosphotungustic acid	Ted Pella	19402
Pipette aid	Axygen	Motopet-1
Plate reader varioskan flash	Thermo	5250040
Prolong Antifade Mountant	Invitrogen	P36980
Propylene Oxide, EM grade	EMS	20401
Real Time PCR system	Applied Biosystems	7500 Fast
Recombinant human Activin A	R&D	338-Ac-050
Recombinant human BMP7	Peprotech	120-03
Recombinant human EGF	Peprotech	af-100-15
Recombinant human FGF10	Peprotech	100-26
Recombinant human FGF19	Peprotech	100-32
Recombinant human HGF	Peprotech	100-39
Rho kinase inhibitor, Y-27632 dihydrochloride	Sigma-Aldrich	Y0503
RNase/DNase free 1.5 mL tube	Axygen	31108101
RNase/DNase free filter tips	Sarstedt	703031255
Rotary Microtome	Leica	RM 2245
RPMI 1640 Medium	Gibco	61870010
Rspo1-conditioned medium	Homemade
Slide master	Bio-optica	15-MEQ001
Sorenson’s Phosphate Buffer	EMS	11600-10
Spinner	Thermo	MY SPIN 6
Sterile serological pipettes	Falcon	357543
Tissue Casette	Leica	3802240
Trimmer	Leica	EM TRIM2
Triton X-100	Thermo Scientific	28314
TrypLE Express Enzyme	Gibco	12605010
Trypsin-EDTA	Gibco	25200-056
Ultramicrotome	Leica	EM UC7
Uranylacetate	EMS	22400
Vortex	Thermo	88880018
Wnt Surrogate-Fc Fusion Protein	ImmunoPrecise	N001
Xylene	Sigma	16446
ZO-1	Invitrogen	40-2200	Dilution: 1/400 (IF)