Generazione di organoidi epatici endodermici funzionali

Riepilogo

Questo protocollo descrive la generazione di organoidi epatici endodermici (eHEPO) veloci e riproducibili. Con questo protocollo, gli eHEPO possono essere prodotti entro 2 settimane e ampliati a lungo termine (più di 1 anno) senza perdere la loro differenziazione e funzionalità.

Abstract

La tecnologia degli organoidi ci ha permesso di generare in vitro una varietà di mini strutture simili a organi umani, come per il fegato, il cervello e l'intestino. I notevoli progressi nei modelli di organoidi hanno recentemente aperto una nuova era sperimentale per varie applicazioni nella modellazione delle malattie, nella biologia dello sviluppo e nella scoperta di farmaci. Le cellule staminali adulte o gli organoidi epatici derivati da cellule staminali pluripotenti indotte (iPSC) governano la generazione di epatociti da utilizzare per diverse applicazioni. Qui, presentiamo un protocollo robusto e riproducibile per la generazione di organoidi epatici da cellule staminali pluripotenti. Questo protocollo è applicabile alle cellule sane e derivate da pazienti. Per ottenere organoidi epatici derivati dall'endoderma 3D (eHEPO), le iPSC sono state prima differenziate direttamente in cellule endodermiche, quindi sono state utilizzate cellule EpCAM-positive (EpCAM+) arricchite con FACS per stabilire organoidi epatici utilizzando il mezzo di espansione. Forniamo un metodo rapido ed efficiente per generare organoidi epatici entro 2 settimane. Gli organoidi generati imitano le proprietà e le funzioni essenziali degli epatociti, come la secrezione di albumina, l'immagazzinamento del glicogeno e l'attività dell'enzima del citocromo P450. Oltre alle somiglianze di espressione genica specifiche del fegato, gli eHEPO comprendono cellule epiteliali polarizzate con canalicoli biliari in mezzo. Inoltre, gli eHEPO possono essere espansi e i passaggi seriali a lungo termine (1 anno) senza perdere la loro capacità di differenziarsi in epatociti maturi. Pertanto, gli eHEPO forniscono una fonte alternativa per produrre epatociti funzionali.

Introduzione

Gli organoidi sono strutture simili a organi miniaturizzate cresciute in condizioni di coltura tridimensionali che imitano il microambiente dell'organo e includono i fattori intrinseci necessari per l'auto-organizzazione e l'auto-rinnovamento nello sviluppo dell'organo stesso. Gli organoidi possono essere derivati da cellule staminali pluripotenti (PSC) o da cellule derivate da tessuti adulti (cellule staminali o progenitrici⁾¹. Sebbene la loro accurata organizzazione simile a un organo e la somiglianza funzionale con l'organo specifico li rendano strumenti preziosi per la modellazione della malattia, necessitano ancora di ulteriori miglioramenti in termini di standardizzazione della coltura. In particolare, sono stati pubblicati diversi protocolli per la generazione di organoidi epatici, che si differenziano per complessità e riproducibilità². Ad esempio, gli organoidi delle gemme epatiche sviluppati da Takebe et al. assumono la forma di strutture dense e multicellulari contenenti le seguenti cellule staminali pluripotenti indotte (iPSC): progenitori endodermici epatici, cellule endoteliali della vena ombelicale umana (HUVECs) e cellule staminali mesenchimali (MSC). Tuttavia, tali organoidi non hanno capacità di autorinnovamento a lungo termine ^3,4.

Da una prospettiva storica, Huch et al. hanno riportato per la prima volta la produzione di organoidi epiteliali epatici umani derivati da tessuti adulti, in cui le cellule si polarizzano e si specializzano per riprodurre aspetti dell'epitelio nativo⁵. Quindi, Guan et al. hanno utilizzato organoidi epatici derivati da iPSC per modellare la sindrome di Alagille (ALGS), una rara malattia genetica associata alla riduzione del dotto biliare all'interno del fegato⁶. Entrambi questi organoidi hanno capacità di auto-rinnovamento e possono acquisire funzioni di epatociti maturi, come la secrezione di bile e albumina, l'accumulo di glicogeno e la disintossicazione da farmaci specifici per il fegato. In un recente studio, Ramli et al. hanno introdotto un modello di organoide epatico derivato da PSC contenente reti funzionali di canalicoli biliari tra cellule polarizzate simili a epatociti (HLC) che svuotano i farmaci colestatici in cisti biliari composte da cellule simili ai colangiociti (CLC)⁷.

Questo studio presenta una coltura unica per la generazione di organoidi epatici endodermici derivati da iPSC, chiamati eHEPO. La coltura e la differenziazione delle iPSC nell'endoderma sono descritte passo dopo passo e viene dimostrata la generazione di eHEPO da progenitori arricchiti di EpCAM+. Infine, viene descritta la caratterizzazione della funzionalità e dell'organizzazione strutturale degli eHEPO, nonché la crioconservazione degli organoidi.

Protocollo

Le autorizzazioni relative alle fasi sperimentali sono state ottenute dal Comitato Etico per la Ricerca Clinica locale della Facoltà di Medicina dell'Università Dokuz Eylul (2013/25-4, 12 maggio 2013; 2016/30-29, 24 novembre 2016).

1. Preparazione di soluzioni per la coltura cellulare

1. Preparare il mezzo di differenziazione dell'endoderma mescolando i seguenti componenti in una cappa a flusso laminare: 1% B27, 100 ng/mL di activina A, Wnt3a o 30% wnt3a-CM e R-spo1 o 10% R-spo1-CM (vedere la Tabella dei materiali).
2. Preparare il tampone di selezione cellulare attivato dalla fluorescenza (FACS) con la seguente composizione: PBS, 1 mM EDTA, 25 mM HEPES, 1% FBS.
3. Preparare il terreno di espansione (EM): 1% N2, 1% B27, 1,25 mM N-acetil-L-cisteina, 50 ng/mL EGF, 10% terreno condizionato R-spo1, 100 ng/mL FGF 10, 10 mM nicotinamide, 5 μM A8301 e 10 μM forskolina (FSK) in Advanced DMEM/F-12. Aggiungere 10 nM Y-27632 e 0,3 nM WNT3a (vedere la Tabella dei materiali).
   NOTA: Conservare il terreno completo per un massimo di 2 settimane a 2-8 °C.
4. Preparare il mezzo di differenziazione (SS): 1% N2, 1% B27, 10 nM gastrina, 50 ng/mL EGF, 100 ng/mL FGF 10, 25 ng/mL HGF, 500 nM A8301, 10 μM DAPT, 25 ng/mL BMP7 e 30 μM desametasone in Ad-DMEM/F-12 (vedere la Tabella dei materiali).
   NOTA: Conservare il terreno completo per 2 settimane a 2-8 °C.

2. Scongelamento delle iPSC sulla piastra senza alimentatore

1. Rivestire la piastra di coltura cellulare con una matrice a membrana basale (BMM).
   1. Scongelare una fiala di un'aliquota di BMM durante la notte su ghiaccio o almeno 2 ore prima di iniziare il rivestimento. Aggiungere 6 mL di DMEM/F-12 freddo in una provetta conica da 15 mL, aggiungere immediatamente 80 μL di BMM scongelato e mescolare bene.
   2. Utilizzare piastre a pozzetti trattate con coltura tissutale, rivestire la piastra di coltura con una soluzione BMM ed erogarla per coprire la superficie della piastra a pozzetti. Incubare la piastra in un'incubatrice a 37 °C per almeno 1 ora prima dell'uso. Trascorso il tempo di incubazione, scartare la soluzione di BMM e aggiungere immediatamente il terreno specifico per iPSC.
2. Rimuovere una fiala di iPSC dalla conservazione dell'azoto liquido utilizzando guanti criogenici. Posizionare immediatamente il flaconcino su un rack per provette galleggiante e immergere il rack in un bagno d'acqua a 37 °C fino a quando i cristalli di ghiaccio non si saranno sciolti.
   1. Rimuovere la fiala dal bagnomaria e pulire accuratamente l'esterno con etanolo al 70%. Quindi, posizionarlo nella cappa laminare. È importante essere veloci in questo passaggio.
   2. In condizioni asettiche, in una cappa laminare, trasferire le cellule scongelate in una provetta conica sterile da 15 mL contenente 5 mL di terreno specifico per iPSC.
      1. Centrifugare le celle a 200 × g (a temperatura ambiente) per 3 min. Scartare lentamente il surnatante, risospendere le cellule in 2 mL di terreno specifico per iPSC pipettando molto delicatamente alcune volte con una pipetta sierologica da 5 mL e seminare le cellule sui pozzetti rivestiti.
   3. Spostare rapidamente la piastra per disperdere le cellule su tutta la superficie del pozzetto. Incubare la piastra nell'incubatore a 37 °C, 5% CO₂ .
   4. Aggiorna il terreno di coltura ogni giorno.

3. Differenziazione endodermica

1. Rivestire una nuova piastra a pozzetti con BMM 1 ora prima di dividere le iPSC, come indicato nella sezione 2.
2. Controllare l'integrità e la vitalità delle iPSC al microscopio ottico. Le iPSC indifferenziate sono cellule con nuclei grandi, citoplasma piccolo e colonie cellulari compatte con bordi distinti.
   NOTA: Esistono due soluzioni enzimatiche per la scissione delle cellule. Nel caso di utilizzo della dispasi (1 U/mL), le aree di cellule differenziate devono essere rimosse. Se viene utilizzato un enzima specifico, non è necessario differenziare manualmente le regioni con raschiatura o aspirazione. Mantenere l'enzima specifico a temperatura ambiente.
3. Riscaldare il mezzo iPSC a temperatura ambiente. Aspirare il terreno e sciacquare la piastra iPSC con DMEM/F-12 o D-PBS. Aggiungere 1 mL dell'enzima specifico a un pozzetto di una piastra a 6 pozzetti, incubare per 1 minuto a temperatura ambiente, quindi aspirare l'enzima specifico e incubare la piastra a 37 °C per 5-7 minuti.
   NOTA: Il tempo di trattamento ottimale con gli enzimi deve essere ottimizzato in base alla linea iPSC utilizzata.
4. Trascorso il tempo di incubazione, aggiungere 1 mL di terreno iPSC preriscaldato e picchiettare delicatamente il lato della piastra per staccare gli aggregati di colonie indifferenziate dalla superficie della piastra. La dimensione ottimale degli aggregati è di 50-200 μM.
   1. Con una pipetta sierologica da 5 mL, miscelare delicatamente la sospensione, quindi seminare la sospensione cellulare alla densità desiderata sul pozzetto rivestito di BMM. Incubare le cellule a 37 °C per 3-5 giorni fino a raggiungere una confluenza del 70%.
5. Prima di iniziare la differenziazione, sostituire il terreno iPSC con il terreno endodermico (passaggio 1.1). Rinfresca il mezzo ogni giorno. Controllare i cambiamenti morfologici delle cellule durante le fasi di differenziazione. Le interazioni cellula-cellula iniziano a comparire dopo la differenziazione e le cellule assumono una forma appuntita.

4. Istituzione dell'eHEPO

1. Eseguire l'arricchimento delle cellule endodermiche EpCAM+ con FACS.
   1. Scongelare una fiala di BMM specifico per organoidi (vedere la Tabella dei materiali) su ghiaccio prima dell'esperimento di selezione cellulare. Preriscaldare le piastre di coltura tissutale a 37 °C durante la notte prima dell'esperimento di selezione cellulare.
   2. Sciacquare le cellule dell'endoderma con 1x PBS. Aggiungere 300 μL di tripsina e incubare per 5 minuti nell'incubatore. Aggiungere 3 mL di DMEM-F12 freddo e pipettare con puntali filtranti da 1.000 μL per generare singole cellule.
   3. Raccogliere la sospensione cellulare in una provetta conica da 15 mL. Centrifugare le celle a 300 x g (a temperatura ambiente) per 5 min. Eliminare il surnatante e lavare il pellet con 10 mL di tampone FACS (passaggio 1.2).
   4. Per realizzare una sospensione a cella singola, filtrare le celle prima con un filtro a rete da 100 μm e poi con un filtro a rete da 40 μm.
      NOTA: Prima di utilizzare il colino, sciacquare la superficie del colino con 1 mL di tampone FACS.
   5. Centrifugare la sospensione cellulare a 300 x g (a temperatura ambiente) per 5 min. Conta il numero di cellulare con il blu di tripano⁸.
   6. Il rapporto per la colorazione è 1:11. Ad esempio, risospendere 15 x 10⁶ celle con 105 μL di tampone FACS e aggiungere 45 μL di FcR e 15 μL di EpCAM (vedere la Tabella dei materiali). Incubare le cellule per 10 minuti a 40 °C e proteggere la provetta dalla luce. Dopo l'incubazione, aggiungere 500 μl di tampone FACS per lavare la sospensione cellulare. Centrifugare le celle a 300 x g (a temperatura ambiente) per 5 min.
   7. Risospendere il pellet in 500 μL di tampone FACS. Aggiungere DAPI (0,5 μM/1 mL, concentrazione finale) alla sospensione cellulare per quantificare le cellule morte. Mantenere le cellule sul ghiaccio fino all'inizio della fase di selezione delle cellule.
2. Incorporare l'EpCAM e ordinare le celle in BMM. Dopo lo smistamento delle cellule, centrifugare le cellule a 300 x g per 5 minuti per prelevare il tampone FACS. Rimuovere il surnatante e risospendere 3.000-5.000 cellule in 20 μL di BMM.
   1. Seminare le cellule aggiungendo una goccia di BMM al centro di ogni piastra a 48 pozzetti. Incubare le cellule per 2 minuti a 37 °C fino a quando il BMM non si sarà solidificato. Capovolgere con cura la piastra e tenerla nell'incubatrice per altri 10 minuti. Sovrapporre la gocciolina con il mezzo di espansione (250 μl per pozzetto per una piastra a 48 pozzetti).
   2. Rinfrescare il terreno organoide ogni 3 giorni. Ai giorni 10-11, la dimensione dell'organoide sarà maggiore di 100 μm.
3. Eseguire la dissociazione e la differenziazione meccanica eHEPO.
   1. Dividi ogni gocciolina di organoide in un rapporto 1:4. Per dividere, scartare il terreno organoide e aggiungere 500 μL di Ad-DMEM/F12 freddo. Con i puntali filtranti da 1.000 μl, pipettare energicamente le goccioline BMM.
   2. Raccogliere un massimo di 10 goccioline di BMM in provette coniche da 15 mL e aggiungere 5 mL di Ad-DMEM/F12 freddo. Tenere il tubo sul ghiaccio per 3-5 minuti.
   3. Centrifugare le celle a 200 x g per 5 minuti a 4 °C. Eliminare il surnatante fino a quando rimane 1 mL. Pipettare energicamente il pellet cellulare 30-40 volte utilizzando puntali filtranti da 200 μl. Controllare la dimensione dell'organoide al microscopio ottico, evitando accuratamente la formazione di una sospensione a singola cellula.
   4. Dopo la dissociazione meccanica, aggiungere 5 mL di Ad-DMEM/F12 freddo e centrifugare le cellule a 200 x g per 5 minuti a 4 °C.
   5. Scartare il surnatante e mantenere la sospensione sul ghiaccio fino alla semina delle cellule.
   6. Seminare una gocciolina di BMM da 50 μl (contenente 35 μl di BMM + 15 μl di cellule e Ad-DMEM/F-12 per pozzetto per una piastra a 24 pozzetti).
   7. Aggiungere BMP7 (25 ng/mL, vedere la Tabella dei materiali) al terreno EM e fermentare per 3 giorni. Il giorno 4, sostituire il mezzo con il mezzo di differenziazione (passaggio 1.4). Rinfrescare il terreno ogni 3 giorni e coltivare le cellule per almeno 14 giorni.

5. Caratterizzazione degli eHEPO

1. Eseguire esami istologici.
   1. Eseguire l'inclusione della paraffina.
      1. Rimuovere il terreno, aggiungere 1-2 ml di 1x PBS freddo e risospendere delicatamente il BMM nel 1x PBS freddo. Trasferire con cura gli organoidi in una provetta da centrifuga da 15 mL. Lasciare che gli organoidi si depositino per gravità, quindi aspirare con cura il PBS. Ripetere la fase di lavaggio tre volte.
      2. Aggiungere 10 mL di fissativo fresco (10% formalina tamponata neutra) agli organoidi e incubare per 30 minuti. Rimuovere delicatamente il fissativo, aggiungere 10 ml di 1x PBS freddo e incubare per 10 minuti. Aspirare con cura il PBS.
      3. Colorare gli organoidi in una soluzione di eosina allo 0,5% (vedi Tabella dei materiali) disciolta in etanolo al 96% per 30 minuti a temperatura ambiente.
         NOTA: Se è necessario eseguire l'immunocolorazione, non colorare con eosina.
      4. Disidratare gli organoidi mediante lavaggio con una serie alcolica (70% etanolo, 80% etanolo e 96% etanolo) per 5 minuti ciascuno a temperatura ambiente. Immergere gli organoidi in etanolo al 100% (etanolo assoluto) per 30 minuti.
      5. Eliminare gli organoidi usando lo xilene (vedere la Tabella dei materiali) tre volte per 20 minuti ogni^{volta 9}.
         ATTENZIONE: Lo xilene è un composto molto tossico e infiammabile, quindi maneggiarlo utilizzando un equipaggiamento di sicurezza appropriato. Evita di lavorare in grandi quantità.
      6. Trasferire delicatamente gli organoidi in uno stampo di base metallica preriscaldato (vedere la Tabella dei materiali) con paraffina fusa utilizzando una pipetta di plastica. Tenere gli organoidi in paraffina fusa tre volte per 30 minuti ciascuna in un incubatore a 65 °C (sostituirlo con nuova paraffina fresca fusa ad ogni cambio).
      7. Quindi, incorporare gli organoidi in nuova paraffina fresca. Spostare delicatamente gli organoidi al centro dello stampo di base in metallo.
         NOTA: Per questo passaggio, è fondamentale lavorare rapidamente perché la paraffina si solidifica a temperatura ambiente.
      8. Trasferire lo stampo di base in metallo sulla piastra fredda per 10-20 s per stabilizzare gli organoidi. Quindi, versare la paraffina fusa per coprire lo stampo di base in metallo e aggiungere una cassetta di fazzoletti (vedere la Tabella dei materiali) sulla parte superiore dello stampo di base in metallo per l'etichettatura. Assicurati che ci sia abbastanza paraffina nello stampo, quindi lasciali solidificare sulla piastra fredda. Rimuovere lo stampo di base in metallo.
      9. Tagliare sezioni di 5-7 μm di spessore utilizzando un microtomo standard (vedere la Tabella dei materiali). Posizionare le sezioni di paraffina seriali sui vetrini adesivi del microscopio. Lasciare asciugare i vetrini per una notte.
   2. Eseguire l'ematossilina e l'eosina (H&E) e la colorazione periodica acido-Shiff (PAS).
      1. Mettere i vetrini inclusi in paraffina in un incubatore a 63 °C per una notte per la deparaffinazione. Il giorno successivo, posizionare i vetrini nello xilene tre volte per 20 minuti ogni volta. Non lasciare che le diapositive si secchino.
      2. Reidratare i vetrini con una serie di alcol graduato (100% etanolo, 96% etanolo, 80% etanolo e 70% etanolo) per 2 minuti. Quindi, posizionare i vetrini nell'acqua distillata per 1 minuto.
      3. Per la colorazione H&E, eseguire i seguenti passaggi.
      4. Mettere i vetrini in soluzione di ematossilina per 5 minuti. Sciacquare gli scivoli in acqua corrente del rubinetto per 5 minuti. Colorare i vetrini con una soluzione di eosina Y all'1% (vedi Tabella dei materiali) per 10 s.
      5. Disidratare le sezioni con una serie di etanolo all'80%, etanolo al 96% e due cambi di etanolo al 100% per 30 s ciascuno.
      6. Metti i vetrini nello xilene per la pulizia tre volte per 20 minuti ogni volta.
      7. Montare con cautela i vetrini coprioggetti sulle sezioni dei vetrini con un mezzo di montaggio (vedere la tabella dei materiali). Assicurati che non rimangano bolle.
      8. Per la colorazione PAS, eseguire i passaggi 5.1.2.4-5.1.2.6, seguiti dalle procedure per la colorazione PAS riportate da Akbari et ^al.10. Quindi montare con cautela i vetrini coprioggetti sulle sezioni dei vetrini con il mezzo di montaggio. Assicurati che non rimangano bolle.
   3. Eseguire la colorazione immunoistochimica (IHC).
      1. Eseguire i passaggi 5.1.2.1 e 5.1.2.2 nel protocollo di colorazione H&E.
      2. Riscaldare i vetrini nel tampone citrato 0,1 M (pH 6,0) nel microonde per 10 minuti.
      3. Tenere premuto fino a quando i vetrini non si raffreddano a temperatura ambiente (circa 20 minuti) e sciacquare i vetrini con acqua distillata.
      4. Mettere i vetrini in 3% H₂O₂ appena preparati in metanolo per 10 minuti a temperatura ambiente. Quindi, sciacquare i vetrini in acqua distillata per 1 minuto.
      5. Bloccare il legame non specifico degli anticorpi primer incubando le sezioni con una soluzione bloccante (2% siero + 0,1% Triton X-100 + 0,1% BSA) a temperatura ambiente per 1 ora.
      6. Rimuovere delicatamente la soluzione bloccante e aggiungere gli anticorpi primari (E-CAD, ALB, EpCAM, A1AT, CK19) (vedere la Tabella dei materiali) diluiti nella soluzione bloccante a 4 °C per una notte.
      7. Il giorno successivo, sciacquare accuratamente i vetrini due volte per 10 minuti (.
      8. Aggiungere gli anticorpi secondari (Capra Anti-Coniglio, Capra Anti-Topo) (vedere la Tabella dei Materiali) per 1 ora a temperatura ambiente e sciacquare i vetrini in acqua distillata per 5 minuti (tre volte).
      9. Preparare una soluzione di 3'3 di diaminobenzidina tetracloridrato (DAB, vedere la Tabella dei Materiali) (questa deve essere preparata 30 minuti prima dell'uso).
      10. Applicare la soluzione DAB sui vetrini per 1-5 minuti e sciacquare i vetrini in acqua distillata per 5 minuti (tre volte).
      11. Controcolorare le sezioni con ematossilina per 1 minuto e sciacquare i vetrini in acqua corrente del rubinetto per 1 minuto.
      12. Disidratare le sezioni con una serie di etanolo all'80%, etanolo al 96% e due cambi di etanolo al 100% per 30 s ciascuno.
      13. Mettere i vetrini nello xilene per 20 minuti (tre volte).
      14. Montare con cautela il vetrino coprioggetti sulla sezione del vetrino con un mezzo di montaggio. Assicurati che non rimangano bolle.
   4. Eseguire l'incorporamento dello Strumento di personalizzazione di Office.
      1. Fissare gli organoidi utilizzando il PFA freddo al 4% appena preparato per una notte a 4 °C. Rimuovere con cautela il fissativo e lavare con 1x PBS per 15 minuti (tre volte).
      2. Preparare una soluzione di saccarosio al 30% (p/v) utilizzando acqua distillata. Rimuovi 1x PBS e aggiungi il saccarosio al 30% per disidratare gli organoidi.
      3. Incubare gli organoidi a 4 °C per una notte. Inizialmente, la maggior parte dei tessuti galleggia nel 30% di saccarosio e affonda una volta completata la permeazione. La crioprotezione può essere considerata completa a questo punto.
      4. Preparare il ghiaccio secco o l'azoto liquido per il processo di inclusione.
      5. Mettere due o tre gocce di OCT (vedere la Tabella dei materiali) in criostampi di plastica. Posizionare gli organoidi sopra con l'orientamento corretto per il taglio.
      6. Versare lentamente e con attenzione l'OCT sopra gli organoidi. Fare attenzione a evitare bolle. Lasciare riposare gli organoidi per gravità per 10-15 minuti a temperatura ambiente.
      7. Etichettare i criostampi prima della fase di congelamento. Posizionare gli stampini su ghiaccio secco o azoto liquido per un rapido congelamento. Trasferire i criostampi a -80 °C e conservarli lì fino al processo di sezionamento.
   5. Eseguire la colorazione in immunofluorescenza (IF).
      1. Eseguire la colorazione della sezione congelata.
         1. Asciugare le criosezioni all'aria per 20-30 minuti a temperatura ambiente. Reidratare i vetrini con acqua distillata per 5 minuti (tre volte). Circondare il tessuto con una barriera idrofobica utilizzando una pap-pen (vedere la Tabella dei materiali).
         2. Aggiungere 200-300 μl di Triton X-100 allo 0,2% per sezione. Lavare accuratamente i vetrini per 5 minuti (tre volte). Assicurarsi che le sezioni non cadano dalle guide durante le fasi di lavaggio.
         3. Aggiungere la soluzione bloccante (2% siero + 0,1% Triton X-100 + 0,1% BSA) per 1 ora a temperatura ambiente.
         4. Rimuovere delicatamente la soluzione bloccante, aggiungere gli anticorpi primari (E-CAD, A1AT, HNF4α) diluiti nella soluzione bloccante (vedere la Tabella dei materiali) e incubare i vetrini per una notte a 4 °C.Il giorno successivo, sciacquare accuratamente i vetrini per 10 minuti (due volte).
         5. Aggiungere anticorpi secondari idonei (Alexa Fluor 488 [Mouse], Alexa Fluor 594 [Mouse], Alexa Fluor 594 [Rabbit]) per 1 ora a temperatura ambiente (vedere la Tabella dei materiali) e sciacquare i vetrini in acqua distillata per 5 minuti (tre volte).
         6. Aggiungere 100-200 μl di colorante nucleare Hoechst o DAPI per sezione per 3 minuti, lavare i vetrini con 1x PBS e ripetere la fase di lavaggio tre volte.
         7. Montare i vetrini coprioggetti sulle sezioni dei vetrini con un mezzo di montaggio anti-sbiadimento. Conservare i vetrini per una notte a 4 °C e proteggerli dalla luce fino al processo di imaging.
      2. Eseguire la colorazione dell'intera montatura.
         1. Eseguire i passaggi 5.1.1.1 e 5.1.1.2 della procedura di inclusione della paraffina.
         2. Aggiungere la soluzione bloccante (0,1%-1% Triton X-100, 1% DMSO, 1% BSA e 1% siero di capra in 1x PBS, vedere la Tabella dei materiali) e incubare gli organoidi con soluzione bloccante per 2-3 ore a temperatura ambiente.
         3. Rimuovere delicatamente la soluzione bloccante e aggiungere gli anticorpi primari (CK19, CK18, ZO-1, ALB) diluiti nella soluzione bloccante per una notte a 4 °C (vedere la Tabella dei materiali).
         4. Il giorno successivo, rimuovere delicatamente la soluzione e aggiungere 1x PBS. Lasciare riposare gli organoidi per gravità per un massimo di 10 minuti. Rimuovere la soluzione con cautela e ripetere la fase di lavaggio tre volte.
         5. Incubare gli organoidi con gli anticorpi secondari (Alexa Fluor 594 [Mouse], Alexa Fluor 488 [Rabbit], Alexa Fluor 488 [Mouse]) per almeno 1 ora a temperatura ambiente. Rimuovere la soluzione con cautela e ripetere la fase di lavaggio quattro volte.
         6. Per la colorazione nucleare, incubare gli organoidi con il colorante nucleare Hoechst o DAPI per 10 minuti. Lavare gli organoidi aggiungendo 1x PBS e ripetere la fase di lavaggio tre volte. Lascia che gli organoidi si depositino sul fondo della provetta.
         7. Utilizzando una pipetta di plastica Pasteur, rimuovere gli organoidi dalla provetta e posizionarli su vetrini. Assicurati di farlo con il minimo danno agli organoidi.
         8. Rimuovere il PBS in eccesso e aggiungere una quantità (una o due gocce) di mezzo di montaggio. Montare con cautela i vetrini coprioggetti sugli organoidi sui vetrini con il mezzo di montaggio. Conservare i vetrini a 4 °C e proteggerli dalla luce fino al processo di imaging.
2. Eseguire la microscopia elettronica.
   1. Fissare gli organoidi utilizzando la soluzione di Karnovsky (glutaraldeide tamponata al 2,5% + paraformaldeide al 2% in tampone fosfato di sodio 0,1 M [tampone di Sorensen], pH 7,4, vedere la Tabella dei materiali) per una notte a 4 °C.
   2. Lavare gli organoidi con tampone di Sorenson 0,1 M + saccarosio 0,1 M (1:1) per 15 minuti (tre volte). Quindi, postfissare gli organoidi in tetrossido di osmio tamponato con fosfato di sodio al 2% (vedere la Tabella dei materiali) per 90 minuti.
   3. Incorporare gli organoidi in agar caldo al 2%. Tagliare l'agar in eccesso attorno agli organoidi usando una lancetta. Lavare gli organoidi nel tampone di Sorensen per 15 minuti (tre volte).
   4. Disidratare con acetone al 50% per 15 minuti (due volte).
   5. Confrontare per una notte con acetone al 70% + acido fosfotungstico all'1% + acetato di uranile allo 0,5% (vedere la Tabella dei materiali) a 4 °C.
   6. Il giorno successivo, disidratare gli organoidi utilizzando una serie di acetoni (80% acetone, 90% acetone, 96% acetone e 100% acetone) per 15 minuti (due volte).
   7. Eliminare gli organoidi con ossido di propilene per 10 minuti (due volte), quindi immergere gli organoidi in una miscela di ossido di propilene (vedere la Tabella dei materiali) per 30 minuti a temperatura ambiente.
   8. Aggiungere una nuova soluzione di epon agli organoidi e incubare per una notte a 4 °C.
   9. Il giorno successivo, metti una nuova soluzione di epon fresca nello stampo di base, quindi incorpora gli organoidi. Mettere in incubatore per 48 ore a 65 °C per la polimerizzazione.
   10. Tagliare i blocchi di epon organoidi con un ultramicrotomo impostato su uno spessore di sezione di 50-100 nm. Metti le sezioni in una griglia coperta da formvar.
3. Misurare l'attività dell'enzima CYP3A4.
   1. Misurare l'attività del CYP utilizzando un kit disponibile in commercio (vedere la Tabella dei materiali) seguendo le istruzioni del produttore.
      NOTA: Gli enzimi CYP convertono il substrato in un prodotto intermedio rilevabile 11,12,13. Ci sono due opzioni (litica cellulare e non litica) per misurare l'attività dell'enzima CYP. Il kit fornisce un'applicazione per analizzare le attività basali del CYP e le attività indotte dal CYP dopo il trattamento con il composto.
   2. Eseguire l'esperimento in triplice copia. Leggi la luminescenza con un luminometro e calcola il segnale. Per normalizzare, tripsinizzare gli organoidi e contare il numero di cellule.
4. Eseguire la quantificazione dell'albumina umana.
   1. Sostituire il terreno di coltura cellulare con un terreno fresco 24 ore prima del test ELISA. Dopo 24 ore di incubazione, raccogliere il terreno di coltura cellulare (300-500 μL) e centrifugare a 500 x g (a 4 °C) per 2 minuti per rimuovere i detriti e le particelle cellulari. Aliquotare il surnatante e conservare i campioni a -80 °C (fino a 3 mesi).
   2. Eseguire lo standard e il campione in duplicato. Gli organoidi maturi secernono albumina nel terreno di coltura; quantificare questa albumina con un kit di quantificazione ELISA (vedere la Tabella dei Materiali). Misurare l'assorbanza con un lettore di piastre ELISA a 450 nm entro 30 minuti dall'interruzione dell'aggiunta della soluzione. Tripsinizzare gli organoidi e contare il numero di cellule da normalizzare.
5. Eseguire il test di eliminazione dell'ammoniaca.
   1. Eseguire il test di eliminazione dell'ammoniaca seguendo le istruzioni del produttore (vedere la Tabella dei materiali). In breve, aggiungere 1,5 mM di NH₄Cl al terreno di coltura e incubare per 24 ore.
   2. Dopo l'incubazione, determinare la concentrazione di ammoniaca con un kit per il dosaggio dell'ammoniaca (vedere la Tabella dei materiali). Calcola le misurazioni utilizzando un lettore multi-piastra multimodale e normalizza i valori in base ai numeri delle celle.
6. Eseguire il test della colilglicilamido-fluoresceina (CLF).
   1. In breve, trattare gli organoidi con 10 μmol/L di CLF (vedere la Tabella dei materiali) e incubare per 1 ora in un incubatore a 37 °C. Dopo l'incubazione, lavare gli organoidi con 1x PBS. Eseguire l'imaging utilizzando la microscopia a fluorescenza.
7. Eseguire l'analisi dell'espressione genica.
   1. Segui le istruzioni del kit RNeasy (vedi la Tabella dei materiali) per isolare l'RNA totale dagli eHEPO.
   2. Impostare la reazione PCR utilizzando una master mix disponibile in commercio (vedere la Tabella dei materiali), seguendo le istruzioni del produttore. Dopo aver preparato la miscela PCR per ciascun set di primer, posizionare 10 μl di ciascun campione nelle piastre qPCR a 96 pozzetti (Tabella 1).
   3. Sigillare le piastre con un sigillante adesivo, quindi centrifugare le piastre a 1.000 x g per 2 minuti a temperatura ambiente. Caricare le piastre in una macchina per PCR. Normalizzare l'espressione genica relativa a un controllo interno (RPL41, Tabella 1) e analizzare utilizzando il metodo 2-ΔΔCt ¹⁴.

6. Crioconservazione degli eHEPO

1. Etichettare i crioviali con un pennarello resistente all'azoto. Controllare il livello di isopropanolo del contenitore di congelamento e mantenerlo a 4 °C per 15-30 minuti prima di iniziare l'esperimento.
2. Congelare una goccia di BMM da 50 μl in un crioviale. Procedere con la dissociazione meccanica dell'organoide come descritto al punto 4.3. Dopo la dissociazione, risospendere l'aggregato cellulare in 500 μL di mezzo di congelamento freddo, quindi trasferire delicatamente la sospensione nei crioviali e conservarla nel contenitore di congelamento.
3. Trasferire il contenitore di congelamento delle cellule a -80 °C e, dopo 24 ore, trasferire i crioviali in azoto liquido per la conservazione a lungo termine.

7. Scongelamento degli eHEPO

1. Preriscaldare un bagnomaria e Ad-DMEM/F12 a 37 °C.
2. Rimuovere una fiala di eHEPO dal deposito di azoto liquido utilizzando guanti criogenici. Mettere il flaconcino a bagnomaria a 37 °C fino a quando i cristalli di ghiaccio non si saranno sciolti. Trasferire la sospensione cellulare in una provetta conica da 15 mL e centrifugare a 200 x g per 5 minuti a 4°C.
3. Aspirare il surnatante e procedere alla semina degli eHEPO come descritto nella sezione 4. Sovrapporre la gocciolina BMM con il mezzo di espansione integrato con 10 μM di Y-27632 (vedere la Tabella dei materiali). Rinfrescare il terreno ogni 3 giorni e rimuovere l'inibitore ROCK dopo 3 giorni.

Risultati

In primo luogo, le cellule dei fibroblasti umani o le cellule mononucleate del sangue periferico (PBMC) sono state coltivate e convertite in iPSC tramite riprogrammazione episomiale. Il siero knockout fresco è stato essenziale per ottenere iPSC sane. Quindi, le iPSC sono state seminate nelle piastre di coltura rivestite di BMM con confluenza del 50%-60%. Avere colonie di iPSC di piccole/medie dimensioni ha migliorato l'efficienza di differenziazione. Quindi, le iPSC sono state ...

Discussione

Il presente protocollo descrive un metodo completo per la generazione, l'espansione e il congelamento/scongelamento di organoidi epatici a partire da iPSC. Questo protocollo copre tutte le fasi, tra cui la coltura delle iPSC sul feeder e la coltura senza feeder, la differenziazione dell'endoderma bidimensionale, l'arricchimento delle cellule progenitrici con FACS e formazione di organoidi e la generazione di organoidi che acquisiscono funzione. Inoltre, vengono fornite istruzioni dettagl...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
15 mL conical centrifuge tubes	Corning	430052
37 °C water bath	Nüve	210.NB9
37 °C, 5 % CO2 incubator	Memmert	INCO 153
50 mL conical centrifuge tubes	Corning	430290
70 µm and 40 µm Cell strainer	Falcon	352350/ 352340
70% Ethanol	Sigma	1009832511
A1AT	Abcam	ab166610	Dilution: 1/500 (IF), 1/50 (IHC)
A-83.01 (TGF-β inhibitor)	Tocris Biosciene	2939
Acetone	Isolab	9,01,026
Adhesive Microscope Slide	Histobond	C981040
Advanced DMEM-F12	Gibco	12634-010
AFP	Abcam	ab3980	Dilution: 1/25 (IHC)
Agar	EMS	10200
ALB	Abcam	ab10241	Dilution: 1/100 (IF), 1/20 (IHC)
Alexa Flour 488 (Mouse)	Invitrogen	A11001	Dilution: 1/1000 (IF)
Alexa Flour 488 (Rabbit)	Invitrogen	A110034	Dilution: 1/1000 (IF)
Alexa Flour 594 (Mouse)	Invitrogen	A11005	Dilution: 1/1000 (IF)
Alexa flour 594 (Rabbit)	Invitrogen	A11037	Dilution: 1/1000 (IF)
Ammonia Assay Kit	Sigma-Aldrich	MAK-310
Ammonium cloride	Santa Cruz	sc-202936
B27 Supplement 50x	Gibco	12587010
Base mold	Sakura	4216
b-FGF	Peprotech	100-18B
Biosafety, CLASS II,SAFETY CABINET	Thermo	SAFE 2020
Calibrated pipettes	Gilson	F167380
Centrifuge	Eppendorf	5702
Cholylglycylamido-fluorescein	Corning	451041
Citrate Buffer pH 6.0	Bio-optica	15-M103
CK-18	Santa Cruz	sc-51582	Dilution: 1/100 (IF), 1/20 (IHC)
CK-19	Santa Cruz	sc-6278	Dilution: 1/100 (IF), 1/20 (IHC)
Confocal Microscope	Zeiss	LSM880
Cryogenic handling gloves and eye protection	Cryokit	5274
Cryostat	Leica	CM 1950
Cryovial tubes	Corning	430659
DAB	Roche	11718096001
DAPT	Sigma-Aldrich	a5942
Dexamethasone	Sigma-Aldrich	D4902
Dispase	Stem Cell Technologies	7923
DMEM F12	Gibco	31330038
E-CAD	Santa Cruz	sc-8426	Dilution: 1/100 (IF), 1/20 (IHC)
EDTA	Invitrogen	15575-020
Electron Microscope	Zeiss	Sigma500
ELISA kit	Fortis life sciences bethyl	E88-129
Embed 812 Embedding Kit	EMS	14121
Entellan	Merck	107961
Eosin Y %1	Sigma-Aldrich	HT110332
EpCAM	Miltenyi Biotec	130-059-901	Dilution: 1/11 (FACS)
Ethanol	Merck	1,00,98,32,511
Fetal Bovine Serum (FBS)	Gibco	26010066
Forskolin (FSK)	Tocris Biosciene	1099
Freezing container (Mr. Frosty)	Thermo	5100-0001
Freezing Medium	Gibco	12648010
Glass Pasteur pipette	Isolab	084.01.001
Glutamax 100x	Gibco	35050-068
Gluteraldehyde %25, EM grade	EMS	16210-1L
Goat Anti-Mouse HRP	Thermo Fisher	62-6520	Dilution: 1/1000 (IHC)
Goat Anti-Rabbit HRP	Thermo Fisher	31460	Dilution: 1/1000 (IHC)
Goat Serum	Gibco	162-10-072
H2O2	Merck	107209
Hematoxylin	Millipore	HX86017674
HEPES, 1 M	Gibco	15630-056
HNF-4α	Abcam	ab55223	Dilution: 1/50 (IHC)
Ice and dry ice	homemade	homemade
Incubator (65 °C)	Nüve	EN 400
Isopropanol	Sigma-Aldrich	24137
Leu15 Gastrin I human	Sigma-Aldrich	G9145
Luminometer	Berthold Tech	LB 960
Master mix	Applied Biosystems	43676659
Matrigel matrix, hESC-Qualified	Corning	354277
Matrigel matrix, phenol-red-free	Corning	356231
Methanol	Merck	179337
Microcentrifuge tubes	Axygen	321-02-501
Microscope	Zeiss	AXIO VERT A1
Microtome blade	Feather	S35, C35
mTeSR1	Stem Cell Technologies	sc-05850
Multi well suspension culture plates	Sarstedt	83,39,21,500
N2 supplement 100x	Gibco	17502048
N-Acetylcysteine	Sigma-Aldrich	A9165
Neutral Buffered Formalin %10	Tekkim	TK.60161.05001
Nicotinamide	Sigma-Aldrich	N0636
Non-essential Amino Acide (NEAA)	Gibco	11140050
OCT	Tissue-Tek	4583
Osmium tetroxide	EMS	19110
P450-Glo Assays kit	Promega	V9001
Pap-pen	Sigma	Z377821-1EA
Paraffin	Tekkim	TK.200661.01002
PAS stain kit	Abcam	ab150680
PBS	Lonza	be17-516
Penicillin/Streptomycin	Gibco	15630-056
Phosphotungustic acid	Ted Pella	19402
Pipette aid	Axygen	Motopet-1
Plate reader varioskan flash	Thermo	5250040
Prolong Antifade Mountant	Invitrogen	P36980
Propylene Oxide, EM grade	EMS	20401
Real Time PCR system	Applied Biosystems	7500 Fast
Recombinant human Activin A	R&D	338-Ac-050
Recombinant human BMP7	Peprotech	120-03
Recombinant human EGF	Peprotech	af-100-15
Recombinant human FGF10	Peprotech	100-26
Recombinant human FGF19	Peprotech	100-32
Recombinant human HGF	Peprotech	100-39
Rho kinase inhibitor, Y-27632 dihydrochloride	Sigma-Aldrich	Y0503
RNase/DNase free 1.5 mL tube	Axygen	31108101
RNase/DNase free filter tips	Sarstedt	703031255
Rotary Microtome	Leica	RM 2245
RPMI 1640 Medium	Gibco	61870010
Rspo1-conditioned medium	Homemade
Slide master	Bio-optica	15-MEQ001
Sorenson’s Phosphate Buffer	EMS	11600-10
Spinner	Thermo	MY SPIN 6
Sterile serological pipettes	Falcon	357543
Tissue Casette	Leica	3802240
Trimmer	Leica	EM TRIM2
Triton X-100	Thermo Scientific	28314
TrypLE Express Enzyme	Gibco	12605010
Trypsin-EDTA	Gibco	25200-056
Ultramicrotome	Leica	EM UC7
Uranylacetate	EMS	22400
Vortex	Thermo	88880018
Wnt Surrogate-Fc Fusion Protein	ImmunoPrecise	N001
Xylene	Sigma	16446
ZO-1	Invitrogen	40-2200	Dilution: 1/400 (IF)