A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.
Method Article
* These authors contributed equally
פרוטוקול זה מתאר את היצירה של אורגנואידים אנדודרמליים בכבד (eHEPOs) מהירים וניתנים לשחזור. בעזרת פרוטוקול זה, ניתן לייצר eHEPOs תוך שבועיים ולהתרחב לטווח ארוך (יותר משנה) מבלי לאבד את הבידול והפונקציונליות שלהם.
טכנולוגיית אורגנואידים אפשרה לנו ליצור מגוון של מיני מבנים דמויי איברים אנושיים, כגון עבור הכבד, המוח והמעי, במבחנה. ההתקדמות המדהימה במודלים אורגנואידים פתחה לאחרונה עידן ניסיוני חדש ליישומים שונים במודלים של מחלות, ביולוגיה התפתחותית וגילוי תרופות. תאי גזע בוגרים או אורגנואידים בכבד שמקורם בתאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים (iPSC) שולטים ביצירת הפטוציטים לשימוש ליישומים מגוונים. כאן, אנו מציגים פרוטוקול חזק וניתן לשחזור ליצירת אורגנואידים בכבד מתאי גזע פלוריפוטנטיים. פרוטוקול זה חל על תאים בריאים שמקורם בחולה. כדי להשיג אורגנואידים בכבד (eHEPOs) שמקורם באנדודרם תלת-ממדי, iPSCs התמיינו תחילה ישירות לתאים אנדודרמליים, ולאחר מכן נעשה שימוש בתאי EpCAM חיוביים (EpCAM+) מועשרים ב-FACS כדי לבסס אורגנואידים בכבד באמצעות מדיום ההתפשטות. אנו מספקים שיטה מהירה ויעילה ליצירת אורגנואידים בכבד תוך שבועיים. האורגנואידים הנוצרים מחקים את התכונות והתפקודים החיוניים של הפטוציטים, כגון הפרשת אלבומין, אחסון גליקוגן ופעילות אנזים ציטוכרום P450. מלבד הדמיון בביטוי הגנים הספציפיים לכבד, eHEPOs מורכבים מתאי אפיתל מקוטבים עם תעלות מרה ביניהם. בנוסף, ניתן להרחיב את ה-eHEPOs ולעבור מעברים סדרתיים לטווח ארוך (שנה) מבלי לאבד את יכולתם להתמיין להפטוציטים בוגרים. לפיכך, eHEPOs מספקים מקור חלופי לייצור הפטוציטים פונקציונליים.
אורגנואידים הם מבנים דמויי איברים ממוזערים הגדלים בתנאי תרבית תלת מימדיים המחקים את המיקרו-סביבה של האיבר וכוללים את הגורמים המהותיים הדרושים לארגון עצמי והתחדשות עצמית בהתפתחות האיברים עצמה. אורגנואידים יכולים להיגזר מתאי גזע פלוריפוטנטיים (PSCs) או מתאים בוגרים שמקורם ברקמות (תאי גזע או אב)1. למרות שהארגון המדויק דמוי האיבר והדמיון התפקודי לאיבר הספציפי הופכים אותם לכלים רבי ערך למידול מחלות, הם עדיין זקוקים לשיפורים נוספים במונחים של סטנדרטיזציה בתרבית. בפרט, פורסמו מספר פרוטוקולים ליצירת אורגנואידים בכבד, והם נבדלים זה מזה במורכבותם וביכולת השחזור שלהם2. לדוגמה, האורגנואידים של ניצני הכבד שפותחו על ידי Takebe ואחרים לובשים צורה של מבנים צפופים ורב-תאיים המכילים את תאי הגזע הפלוריפוטנטיים המושרים הבאים (iPSCs): אבות אנדודרמליים בכבד, תאי אנדותל וריד טבורי אנושי (HUVECs) ותאי גזע מזנכימליים (MSCs). עם זאת, לאורגנואידים אלה אין יכולת חידוש עצמי לטווח ארוך 3,4.
מנקודת מבט היסטורית, Huch et al. דיווחו לראשונה על ייצור אורגנואידים אפיתל כבד אנושי שמקורם ברקמה בוגרת, שבה התאים מקוטבים ומתמחים בשכפול היבטים של האפיתל המקומי5. לאחר מכן, גואן ועמיתיו השתמשו באורגנואידים בכבד שמקורם ב-iPSC כדי לדגמן את תסמונת אלגיל (ALGS), הפרעה גנטית נדירה הקשורה להפחתת דרכי המרה בכבד6. לשני האורגנואידים הללו יש יכולת חידוש עצמי ויכולים להשיג פונקציות הפטוציטים בוגרות, כגון הפרשת מרה ואלבומין, אחסון גליקוגן וניקוי רעלים ספציפי לכבד. במחקר שנערך לאחרונה, רמלי ועמיתיו הציגו מודל אורגנואיד כבד שמקורו ב-PSC המכיל רשתות תעלות מרה פונקציונליות בין תאים דמויי הפטוציטים מקוטבים (HLCs) המרוקנים תרופות כולסטטיות לציסטות מרה המורכבות מתאים דמויי כולנגיוציטים (CLCs)7.
מחקר זה מציג תרבית ייחודית ליצירת אורגנואידים אנדודרמליים בכבד שמקורם ב-iPSC, הנקראים eHEPOs. תרבית ה-iPSC וההתמיינות לאנדודרם מתוארים צעד אחר צעד, ומודגם יצירת eHEPOs מאבות EpCAM+ מועשרים. לבסוף, מתוארים אפיון הפונקציונליות והארגון המבני של ה-eHEPOs, כמו גם שימור בהקפאה של האורגנואידים.
אישורים הקשורים לצעדים ניסיוניים התקבלו מוועדת האתיקה המקומית למחקר קליני של הפקולטה לרפואה של אוניברסיטת דוקוז אילול (2013/25-4, 12 במאי 2013; 2016/30-29, 24 בנובמבר 2016).
1. הכנת פתרונות לתרבית תאים
2. הפשרת ה-iPSCs על הצלחת נטולת המזין
3. בידול אנדודרם
4. הקמת eHEPO
5. אפיון של eHEPOs
6. שימור בהקפאה של ה-eHEPOs
7. הפשרת ה-eHEPOs
ראשית, תאי פיברובלסטים אנושיים או תאים חד-גרעיניים בדם היקפי (PBMC) תורבו והומרו ל-iPSCs באמצעות תכנות מחדש אפיזומלי. סרום הנוקאאוט הטרי היה חיוני להשגת iPSCs בריאים. לאחר מכן, ה-iPSCs נזרעו לתוך לוחות התרבית המצופים ב-BMM עם מפגש של 50%-60%. קיומם של מושבות iPSC בגודל קטן/בינוני שיפר ?...
הפרוטוקול הנוכחי מתאר שיטה מקיפה לייצור, הרחבה והקפאה/הפשרה של אורגנואידים בכבד החל מ-iPSCs. פרוטוקול זה מכסה את כל השלבים, כולל תרבית ה-iPSCs על המזין והתרבית נטולת המזין, התמיינות אנדודרם דו-ממדית, העשרת תאי האב עם FACS והיווצרות אורגנואידים, ויצירת אורגנואידים המשפרים תפקוד. ...
למחברים אין מה לחשוף. למחברים אין ניגודי אינטרסים להצהיר עליהם. אסרא ארדל היא מייסדת שותפה של חברת הביוטכנולוגיה ORGANO-ID.
מחקר זה נתמך על ידי מועצת המחקר המדעי והטכנולוגי של טורקיה (TÜBİTAK) באמצעות פרויקטים SBAG-115S465 ו-SBAG-213S182. איור 1 נוצר באמצעות BioRender.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
15 mL conical centrifuge tubes | Corning | 430052 | |
37 °C water bath | Nüve | 210.NB9 | |
37 °C, 5 % CO2 incubator | Memmert | INCO 153 | |
50 mL conical centrifuge tubes | Corning | 430290 | |
70 µm and 40 µm Cell strainer | Falcon | 352350/ 352340 | |
70% Ethanol | Sigma | 1009832511 | |
A1AT | Abcam | ab166610 | Dilution: 1/500 (IF), 1/50 (IHC) |
A-83.01 (TGF-β inhibitor) | Tocris Biosciene | 2939 | |
Acetone | Isolab | 9,01,026 | |
Adhesive Microscope Slide | Histobond | C981040 | |
Advanced DMEM-F12 | Gibco | 12634-010 | |
AFP | Abcam | ab3980 | Dilution: 1/25 (IHC) |
Agar | EMS | 10200 | |
ALB | Abcam | ab10241 | Dilution: 1/100 (IF), 1/20 (IHC) |
Alexa Flour 488 (Mouse) | Invitrogen | A11001 | Dilution: 1/1000 (IF) |
Alexa Flour 488 (Rabbit) | Invitrogen | A110034 | Dilution: 1/1000 (IF) |
Alexa Flour 594 (Mouse) | Invitrogen | A11005 | Dilution: 1/1000 (IF) |
Alexa flour 594 (Rabbit) | Invitrogen | A11037 | Dilution: 1/1000 (IF) |
Ammonia Assay Kit | Sigma-Aldrich | MAK-310 | |
Ammonium cloride | Santa Cruz | sc-202936 | |
B27 Supplement 50x | Gibco | 12587010 | |
Base mold | Sakura | 4216 | |
b-FGF | Peprotech | 100-18B | |
Biosafety, CLASS II,SAFETY CABINET | Thermo | SAFE 2020 | |
Calibrated pipettes | Gilson | F167380 | |
Centrifuge | Eppendorf | 5702 | |
Cholylglycylamido-fluorescein | Corning | 451041 | |
Citrate Buffer pH 6.0 | Bio-optica | 15-M103 | |
CK-18 | Santa Cruz | sc-51582 | Dilution: 1/100 (IF), 1/20 (IHC) |
CK-19 | Santa Cruz | sc-6278 | Dilution: 1/100 (IF), 1/20 (IHC) |
Confocal Microscope | Zeiss | LSM880 | |
Cryogenic handling gloves and eye protection | Cryokit | 5274 | |
Cryostat | Leica | CM 1950 | |
Cryovial tubes | Corning | 430659 | |
DAB | Roche | 11718096001 | |
DAPT | Sigma-Aldrich | a5942 | |
Dexamethasone | Sigma-Aldrich | D4902 | |
Dispase | Stem Cell Technologies | 7923 | |
DMEM F12 | Gibco | 31330038 | |
E-CAD | Santa Cruz | sc-8426 | Dilution: 1/100 (IF), 1/20 (IHC) |
EDTA | Invitrogen | 15575-020 | |
Electron Microscope | Zeiss | Sigma500 | |
ELISA kit | Fortis life sciences bethyl | E88-129 | |
Embed 812 Embedding Kit | EMS | 14121 | |
Entellan | Merck | 107961 | |
Eosin Y %1 | Sigma-Aldrich | HT110332 | |
EpCAM | Miltenyi Biotec | 130-059-901 | Dilution: 1/11 (FACS) |
Ethanol | Merck | 1,00,98,32,511 | |
Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco | 26010066 | |
Forskolin (FSK) | Tocris Biosciene | 1099 | |
Freezing container (Mr. Frosty) | Thermo | 5100-0001 | |
Freezing Medium | Gibco | 12648010 | |
Glass Pasteur pipette | Isolab | 084.01.001 | |
Glutamax 100x | Gibco | 35050-068 | |
Gluteraldehyde %25, EM grade | EMS | 16210-1L | |
Goat Anti-Mouse HRP | Thermo Fisher | 62-6520 | Dilution: 1/1000 (IHC) |
Goat Anti-Rabbit HRP | Thermo Fisher | 31460 | Dilution: 1/1000 (IHC) |
Goat Serum | Gibco | 162-10-072 | |
H2O2 | Merck | 107209 | |
Hematoxylin | Millipore | HX86017674 | |
HEPES, 1 M | Gibco | 15630-056 | |
HNF-4α | Abcam | ab55223 | Dilution: 1/50 (IHC) |
Ice and dry ice | homemade | homemade | |
Incubator (65 °C) | Nüve | EN 400 | |
Isopropanol | Sigma-Aldrich | 24137 | |
Leu15 Gastrin I human | Sigma-Aldrich | G9145 | |
Luminometer | Berthold Tech | LB 960 | |
Master mix | Applied Biosystems | 43676659 | |
Matrigel matrix, hESC-Qualified | Corning | 354277 | |
Matrigel matrix, phenol-red-free | Corning | 356231 | |
Methanol | Merck | 179337 | |
Microcentrifuge tubes | Axygen | 321-02-501 | |
Microscope | Zeiss | AXIO VERT A1 | |
Microtome blade | Feather | S35, C35 | |
mTeSR1 | Stem Cell Technologies | sc-05850 | |
Multi well suspension culture plates | Sarstedt | 83,39,21,500 | |
N2 supplement 100x | Gibco | 17502048 | |
N-Acetylcysteine | Sigma-Aldrich | A9165 | |
Neutral Buffered Formalin %10 | Tekkim | TK.60161.05001 | |
Nicotinamide | Sigma-Aldrich | N0636 | |
Non-essential Amino Acide (NEAA) | Gibco | 11140050 | |
OCT | Tissue-Tek | 4583 | |
Osmium tetroxide | EMS | 19110 | |
P450-Glo Assays kit | Promega | V9001 | |
Pap-pen | Sigma | Z377821-1EA | |
Paraffin | Tekkim | TK.200661.01002 | |
PAS stain kit | Abcam | ab150680 | |
PBS | Lonza | be17-516 | |
Penicillin/Streptomycin | Gibco | 15630-056 | |
Phosphotungustic acid | Ted Pella | 19402 | |
Pipette aid | Axygen | Motopet-1 | |
Plate reader varioskan flash | Thermo | 5250040 | |
Prolong Antifade Mountant | Invitrogen | P36980 | |
Propylene Oxide, EM grade | EMS | 20401 | |
Real Time PCR system | Applied Biosystems | 7500 Fast | |
Recombinant human Activin A | R&D | 338-Ac-050 | |
Recombinant human BMP7 | Peprotech | 120-03 | |
Recombinant human EGF | Peprotech | af-100-15 | |
Recombinant human FGF10 | Peprotech | 100-26 | |
Recombinant human FGF19 | Peprotech | 100-32 | |
Recombinant human HGF | Peprotech | 100-39 | |
Rho kinase inhibitor, Y-27632 dihydrochloride | Sigma-Aldrich | Y0503 | |
RNase/DNase free 1.5 mL tube | Axygen | 31108101 | |
RNase/DNase free filter tips | Sarstedt | 703031255 | |
Rotary Microtome | Leica | RM 2245 | |
RPMI 1640 Medium | Gibco | 61870010 | |
Rspo1-conditioned medium | Homemade | ||
Slide master | Bio-optica | 15-MEQ001 | |
Sorenson’s Phosphate Buffer | EMS | 11600-10 | |
Spinner | Thermo | MY SPIN 6 | |
Sterile serological pipettes | Falcon | 357543 | |
Tissue Casette | Leica | 3802240 | |
Trimmer | Leica | EM TRIM2 | |
Triton X-100 | Thermo Scientific | 28314 | |
TrypLE Express Enzyme | Gibco | 12605010 | |
Trypsin-EDTA | Gibco | 25200-056 | |
Ultramicrotome | Leica | EM UC7 | |
Uranylacetate | EMS | 22400 | |
Vortex | Thermo | 88880018 | |
Wnt Surrogate-Fc Fusion Protein | ImmunoPrecise | N001 | |
Xylene | Sigma | 16446 | |
ZO-1 | Invitrogen | 40-2200 | Dilution: 1/400 (IF) |
Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article
Request PermissionThis article has been published
Video Coming Soon
Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved