Fonksiyonel Endodermal Hepatik Organoidlerin Üretimi

Özet

Bu protokol, hızlı ve tekrarlanabilir endodermal hepatik organoidlerin (eHEPO'lar) oluşumunu tanımlar. Bu protokol ile eHEPO'lar 2 hafta içinde üretilebilmekte ve farklılaşma ve işlevselliklerini kaybetmeden uzun vadede (1 yıldan fazla) genişleyebilmektedir.

Özet

Organoid teknolojisi, in vitro olarak karaciğer, beyin ve bağırsak gibi çeşitli insan organı benzeri mini yapılar üretmemize izin verdi. Organoid modellerdeki kayda değer gelişmeler, son zamanlarda hastalık modellemesi, gelişimsel biyoloji ve ilaç keşfinde çeşitli uygulamalar için yeni bir deneysel çağ açmıştır. Yetişkin kök hücreler veya indüklenmiş pluripotent kök hücre (iPSC) türevi karaciğer organoidleri, çeşitli uygulamalar için kullanılacak hepatositlerin oluşumunu yönetir. Burada, pluripotent kök hücrelerden hepatik organoidler üretmek için sağlam ve tekrarlanabilir bir protokol sunuyoruz. Bu protokol sağlıklı ve hasta kaynaklı hücrelere uygulanabilir. 3D endoderm türevli hepatik organoidler (eHEPO'lar) elde etmek için, iPSC'ler doğrudan önce endodermal hücrelere farklılaştırıldı ve daha sonra genişleme ortamını kullanarak hepatik organoidler oluşturmak için FACS ile zenginleştirilmiş EpCAM pozitif (EpCAM +) hücreler kullanıldı. 2 hafta içinde hepatik organoidler üretmek için hızlı ve verimli bir yöntem sunuyoruz. Üretilen organoidler, albümin salgılanması, glikojen depolanması ve sitokrom P450 enzim aktivitesi gibi hepatositlerin temel özelliklerini ve işlevlerini taklit eder. Karaciğere özgü gen ekspresyonu benzerliklerinin yanı sıra, eHEPO'lar aralarında safra kanalikülleri bulunan polarize epitel hücreleri içerir. Ek olarak, eHEPO'lar matür hepatositlere farklılaşma kapasitelerini kaybetmeden uzun süreli (1 yıl) genişletilebilir ve seri geçişler yapılabilir. Bu nedenle, eHEPO'lar fonksiyonel hepatositler üretmek için alternatif bir kaynak sağlar.

Giriş

Organoidler, organ mikro çevresini taklit eden ve organ gelişiminin kendisinde kendi kendini organize etme ve kendini yenileme için gerekli içsel faktörleri içeren 3 boyutlu kültür koşullarında yetiştirilen minyatür organ benzeri yapılardır. Organoidler, pluripotent kök hücrelerden (PSC'ler) veya yetişkin doku kaynaklı hücrelerden (kök veya progenitör ^hücreler) türetilebilir1. Doğru organ benzeri organizasyonları ve belirli bir organa işlevsel benzerlikleri onları hastalık modellemesi için değerli araçlar haline getirse de, kültürde standardizasyon açısından daha fazla iyileştirmeye ihtiyaçları vardır. Özellikle, karaciğer organoidlerinin üretilmesi için çeşitli protokoller yayınlanmıştır ve bunlar karmaşıklıkları ve tekrarlanabilirlikleri bakımından farklılık gösterir². Örneğin, Takebe ve ark. tarafından geliştirilen karaciğer tomurcuğu organoidleri, aşağıdaki indüklenmiş pluripotent kök hücreleri (iPSC'ler) içeren yoğun, çok hücreli yapılar şeklini alır: hepatik endodermal progenitörler, insan göbek damarı endotel hücreleri (HUVEC'ler) ve mezenkimal kök hücreler (MSC'ler). Bununla birlikte, bu organoidlerin uzun vadeli kendini yenileme kapasitesi yoktur ^3,4.

Tarihsel bir perspektiften bakıldığında, Huch ve ark. ilk olarak, hücrelerin polarize olduğu ve doğal epitelin özelliklerini çoğaltmak için uzmanlaştığı yetişkin dokusundan türetilen insan hepatik epitel organoidlerinin üretimini bildirmiştir⁵. Daha sonra, Guan ve ark. karaciğerde safra kanalı azalması ile ilişkili nadir bir genetik bozukluk olan Alagille sendromunu (ALGS) modellemek için iPSC'den türetilmiş hepatik organoidler kullandılar⁶. Bu organoidlerin her ikisi de kendini yenileme kapasitesine sahiptir ve safra ve albümin sekresyonu, glikojen depolanması ve karaciğere özgü ilaç detoksifikasyonu gibi olgun hepatosit fonksiyonları kazanabilir. Yakın tarihli bir çalışmada, Ramli ve ark. kolestatik ilaçları kolanjiyosit benzeri hücrelerden (CLC'ler) oluşan safra kistlerine boşaltan polarize hepatosit benzeri hücreler (HLC'ler) arasında fonksiyonel safra kanalikülleri ağları içeren PSC'den türetilmiş bir karaciğer organoid modelini ^tanıttı7.

Bu çalışma, eHEPO'lar olarak adlandırılan iPSC'den türetilmiş endodermal hepatik organoidler üretmek için benzersiz bir kültür sunmaktadır. iPSC kültürü ve endoderme farklılaşma adım adım açıklanır ve zenginleştirilmiş EpCAM + progenitörlerinden eHEPO'ların üretilmesi gösterilmiştir. Son olarak, eHEPO'ların işlevselliğinin ve yapısal organizasyonunun karakterizasyonunun yanı sıra organoidlerin dondurularak saklanması açıklanmaktadır.

Protokol

Deneysel adımlarla ilgili izinler Dokuz Eylül Üniversitesi Tıp Fakültesi yerel Klinik Araştırmalar Etik Kurulu'ndan alınmıştır (2013/25-4, 12 Mayıs 2013; 2016/30-29, 24 Kasım 2016).

1. Hücre kültürü için çözeltilerin hazırlanması

1. Aşağıdaki bileşenleri laminer bir akış başlığında karıştırarak endoderm farklılaşma ortamını hazırlayın: %1 B27, 100 ng/mL Aktivin A, Wnt3a veya %30 wnt3a-CM ve R-spo1 veya %10 R-spo1-CM (Malzeme Tablosuna bakınız).
2. Floresanla aktive edilen hücre sıralama (FACS) tamponunu aşağıdaki bileşimle hazırlayın: PBS, 1 mM EDTA, 25 mM HEPES, %1 FBS.
3. Genleşme ortamını (EM) hazırlayın:% 1 N2,% 1 B27, 1.25 mM N-asetil-L-sistein, 50 ng / mL EGF,% 10 R-spo1 şartlandırılmış ortam, 100 ng / mL FGF 10, 10 mM nikotinamid, 5 μM A8301 ve Gelişmiş DMEM / F-12'de 10 μM forskolin (FSK). 10 nM Y-27632 ve 0.3 nM WNT3a ekleyin ( Malzeme Tablosuna bakın).
   NOT: Tüm ortamı 2-2 °C'de en fazla 8 hafta tutun.
4. Farklılaşma ortamını (DM) hazırlayın:% 1 N2,% 1 B27, 10 nM gastrin, 50 ng / mL EGF, 100 ng / mL FGF 10, 25 ng / mL HGF, 500 nM A8301, 10 μM DAPT, 25 ng / mL BMP7 ve Ad-DMEM / F-12'de 30 μM deksametazon ( Malzeme Tablosuna bakınız).
   NOT: Tüm ortamı 2-8 °C'de 2 hafta boyunca saklayın.

2. Besleyici içermeyen plaka üzerindeki iPSC'lerin çözülmesi

1. Hücre kültürü plakasını bazal membran matrisi (BMM) ile kaplayın.
   1. Kaplamaya başlamadan önce bir şişe BMM alikotunu gece boyunca veya en az 2 saat buzda çözün. 15 mL'lik konik bir tüpe 6 mL soğuk DMEM/F-12 ekleyin, hemen 80 μL çözülmüş BMM ekleyin ve iyice karıştırın.
   2. Doku kültürü ile muamele edilmiş kuyucuk plakaları kullanın, kültür plakasını BMM çözeltisi ile kaplayın ve kuyu plakası yüzeyini kaplayacak şekilde dağıtın. Plakayı kullanmadan önce en az 1 saat 37 °C'lik bir inkübatörde inkübe edin. Kuluçka süresinden sonra, BMM çözeltisini atın ve hemen iPSC'ye özgü ortamı ekleyin.
2. Kriyojenik eldivenler kullanarak sıvı nitrojen deposundan bir şişe iPSC'yi çıkarın. Şişeyi hemen yüzer bir tüp rafına yerleştirin ve buz kristalleri eriyene kadar rafı 37 ° C'lik bir su banyosuna daldırın.
   1. Şişeyi su banyosundan çıkarın ve dışını% 70 etanol ile iyice silin. Ardından, laminer başlığa yerleştirin. Bu adımda hızlı olmak önemlidir.
   2. Aseptik koşullar altında, laminer bir başlıkta, çözülmüş hücreleri 5 mL iPSC'ye özgü ortam içeren steril 15 mL konik bir tüpe aktarın.
      1. Hücreleri 200 × g'da (oda sıcaklığında) 3 dakika santrifüjleyin. Süpernatanı yavaşça atın, 5 mL'lik bir serolojik pipetle birkaç kez çok nazikçe pipetleyerek hücreleri 2 mL iPSC'ye özgü ortamda yeniden süspanse edin ve hücreleri kaplanmış kuyucuklara tohumlayın.
   3. Hücreleri kuyu yüzeyi boyunca dağıtmak için plakayı hızlı bir şekilde hareket ettirin. Plakayı 37 °C,% 5 CO₂ inkübatöre inkübe edin.
   4. Kültür ortamını her gün yenileyin.

3. Endoderm farklılaşması

1. Bölüm 1'de belirtildiği gibi, iPSC'leri bölmeden önce 2 saat yeni bir kuyu plakasını BMM ile kaplayın.
2. Işık mikroskobu altında iPSC'lerin bütünlüğünü ve canlılığını kontrol edin. Farklılaşmamış iPSC'ler, büyük çekirdeklere, küçük sitoplazmaya ve farklı kenarlara sahip kompakt hücre kolonilerine sahip hücrelerdir.
   NOT: Hücreleri bölmek için iki enzimatik çözüm vardır. Dispas (1 U / mL) kullanılması durumunda, farklılaşmış hücrelerin alanları çıkarılmalıdır. Spesifik bir enzim kullanılıyorsa, bölgeleri kazıma veya emme ile manuel olarak ayırt etmeye gerek yoktur. Spesifik enzimi oda sıcaklığında tutun.
3. iPSC ortamını oda sıcaklığına ısıtın. Ortamı aspire edin ve iPSC plakasını DMEM / F-12 veya D-PBS ile durulayın. 6 oyuklu bir plakanın bir oyuğuna 1 mL spesifik enzim ekleyin, oda sıcaklığında 1 dakika inkübe edin ve ardından spesifik enzimi aspire edin ve plakayı 37 ° C'de 5-7 dakika inkübe edin.
   NOT: Enzimlerle en uygun tedavi süresi, kullanılan iPSC hattına göre optimize edilmelidir.
4. İnkübasyon süresinden sonra, 1 mL önceden ısıtılmış iPSC ortamı ekleyin ve farklılaşmamış koloni agregalarını plakanın yüzeyinden ayırmak için plakanın yan tarafına hafifçe vurun. Agregaların optimal boyutu 50-200 μM'dir.
   1. 5 mL'lik bir serolojik pipet ile süspansiyonu nazikçe karıştırın ve ardından hücre süspansiyonunu istenen yoğunlukta BMM kaplı kuyucuğa tohumlayın. % 70'lik bir birleşmeye ulaşmak için hücreleri 37 ° C'de 3-5 gün inkübe edin.
5. Farklılaşmaya başlamadan önce, iPSC ortamını endoderm ortamı ile değiştirin (adım 1.1). Ortamı her gün yenileyin. Farklılaşma adımları sırasında hücrelerin morfolojik değişikliklerini kontrol edin. Farklılaşmayı takiben hücre-hücre etkileşimleri ortaya çıkmaya başlar ve hücreler dikenli bir şekil alır.

4. eHEPO kuruluşu

1. EpCAM+ endodermal hücrelerin FACS ile zenginleştirilmesini gerçekleştirin.
   1. Hücre sıralama deneyinden önce bir organoid spesifik BMM şişesini (Malzeme Tablosuna bakınız) buz üzerinde çözdürün. Hücre sıralama deneyinden önce doku kültürü plakalarını gece boyunca 37 °C'de önceden ısıtın.
   2. Endoderm hücrelerini 1x PBS ile durulayın. 300 μL tripsin ekleyin ve inkübatörde 5 dakika inkübe edin. 3 mL soğuk DMEM-F12 ekleyin ve tek hücreler oluşturmak için 1.000 μL filtre uçlarıyla pipetleyin.
   3. Hücre süspansiyonunu 15 mL'lik konik bir tüpte toplayın. Hücreleri 300 x g'da (oda sıcaklığında) 5 dakika santrifüjleyin. Süpernatanı atın ve peleti 10 mL FACS tamponu ile yıkayın (adım 1.2).
   4. Tek hücreli bir süspansiyon yapmak için, hücreleri önce 100 μm'lik bir gözenekli süzgeç ve ardından 40 μm'lik bir gözenekli süzgeç ile filtreleyin.
      NOT: Süzgeci kullanmadan önce süzgecin yüzeyini 1 mL FACS tamponu ile durulayın.
   5. Hücre süspansiyonunu 300 x g'da (oda sıcaklığında) 5 dakika santrifüjleyin. Tripan Blue⁸ ile hücre numarasını sayın.
   6. Boyama oranı 1:11'dir. Örneğin, 105 μL FACS tamponu ile 15 x 10⁶ hücreyi yeniden süspanse edin ve 45 μL FcR ve 15 μL EpCAM ekleyin ( Malzeme Tablosuna bakın). Hücreleri 40 ° C'de 10 dakika inkübe edin ve tüpü ışıktan koruyun. İnkübasyondan sonra, hücre süspansiyonunu yıkamak için 500 μL FACS tamponu ekleyin. Hücreleri 300 x g'da (oda sıcaklığında) 5 dakika santrifüjleyin.
   7. Peletleri 500 μL FACS tamponunda yeniden süspanse edin. Ölü hücreleri ölçmek için hücre süspansiyonuna DAPI (0.5 μM / 1 mL, son konsantrasyon) ekleyin. Hücre sıralama adımına başlayana kadar hücreleri buz üzerinde tutun.
2. EpCAM'i ve sıralanmış hücreleri BMM'ye gömün. Hücre tasnif işleminden sonra, FACS tamponunu geri çekmek için hücreleri 5 dakika boyunca 300 x g'da santrifüjleyin. Süpernatanı çıkarın ve 20 μL BMM'de 3.000-5.000 hücreyi yeniden süspanse edin.
   1. Her 48 oyuklu plakanın ortasına bir damla BMM ekleyerek hücreleri tohumlayın. BMM katılaşana kadar hücreleri 37 ° C'de 2 dakika inkübe edin. Plakayı dikkatlice geri takın ve 10 dakika daha inkübatörde tutun. Damlacığı genleşme ortamı ile kaplayın (48 oyuklu bir plaka için oyuk başına 250 μL).
   2. Organoid ortamı her 3 günde bir yenileyin. 10-11. günlerde organoid boyutu 100 μm'den daha büyük olacaktır.
3. eHEPO mekanik ayrışma ve farklılaşma gerçekleştirin.
   1. Her organoid damlacığı 1:4 oranında bölün. Bölmek için organoid ortamı atın ve 500 μL soğuk Ad-DMEM/F12 ekleyin. 1.000 μL filtre uçları ile BMM damlacıklarını kuvvetlice pipetleyin.
   2. 15 mL konik tüplere maksimum 10 BMM damlacık toplayın ve 5 mL soğuk Ad-DMEM / F12 ekleyin. Tüpü 3-5 dakika buz üzerinde tutun.
   3. Hücreleri 200 x g'da 4 ° C'de 5 dakika santrifüjleyin. Süpernatanı 1 mL kalana kadar atın. 200 μL filtre uçları kullanarak hücre peletini 30-40 kez kuvvetlice pipetleyin. Organoid boyutunu ışık mikroskobu altında kontrol edin, tek hücreli bir süspansiyon oluşumundan dikkatlice kaçının.
   4. Mekanik ayrışmadan sonra, 5 mL soğuk Ad-DMEM / F12 ekleyin ve hücreleri 4 ° C'de 5 dakika boyunca 200 x g'da santrifüjleyin.
   5. Süpernatanı atın ve hücreleri tohumlayana kadar süspansiyonu buz üzerinde tutun.
   6. 50 μL'lik bir BMM damlacığı tohumlayın (24 oyuklu bir plaka için oyuk başına 35 μL BMM + 15 μL hücre ve Ad-DMEM/F-12 içerir).
   7. EM ortamına BMP7 (25 ng / mL, Malzeme Tablosuna bakınız) ekleyin ve 3 gün boyunca kültürleyin. 4. günde, ortamı farklılaştırma ortamıyla değiştirin (adım 1.4). Ortamı her 3 günde bir yenileyin ve hücreleri en az 14 gün boyunca kültürleyin.

5. eHEPO'ların karakterizasyonu

1. Histolojik incelemeler yapın.
   1. Parafin gömme işlemini gerçekleştirin.
      1. Ortamı çıkarın, 1-2 mL soğuk 1x PBS ekleyin ve BMM'yi soğuk 1x PBS'de yavaşça yeniden askıya alın. Organoidleri dikkatlice 15 mL'lik bir santrifüj tüpüne aktarın. Organoidlerin yerçekimi altında yerleşmesine izin verin ve ardından PBS'yi dikkatlice aspire edin. Yıkama adımını üç kez tekrarlayın.
      2. Organoidlere 10 mL taze fiksatif (% 10 nötr tamponlu formalin) ekleyin ve 30 dakika inkübe edin. Sabitleyiciyi nazikçe çıkarın, 10 mL soğuk 1x PBS ekleyin ve 10 dakika inkübe edin. PBS'yi dikkatlice aspire edin.
      3. Organoidleri, oda sıcaklığında 30 dakika boyunca% 96 etanol içinde çözülmüş% 0.5 eozin ( Malzeme Tablosuna bakınız) çözeltisinde boyayın.
         NOT: İmmün boyama yapılacaksa eozin ile boyama yapmayın.
      4. Organoidleri, her biri oda sıcaklığında 5 dakika boyunca bir alkol serisi (%70 etanol, %80 etanol ve %96 etanol) kullanarak yıkayarak kurutun. Organoidleri 30 dakika boyunca %100 etanol (mutlak etanol) içinde bekletin.
      5. Organoidleri ksilen kullanarak temizleyin ( Malzeme Tablosuna bakın) her seferinde 20 dakika boyunca^{üç kez 9}.
         DİKKAT: Ksilen çok toksik ve yanıcı bir bileşiktir, bu nedenle uygun güvenlik donanımı kullanarak kullanın. Büyük miktarlarda çalışmaktan kaçının.
      6. Organoidleri, plastik bir pipet kullanarak erimiş parafin ile önceden ısıtılmış bir metal tabanlı kalıba ( Malzeme Tablosuna bakın) yavaşça aktarın. Organoidleri erimiş parafin içinde her biri 65 ° C'lik bir inkübatörde 30 dakika boyunca üç kez tutun (her değişiklikte yeni taze erimiş parafin ile değiştirin).
      7. Ardından, organoidleri yeni taze parafine gömün. Organoidleri yavaşça metal taban kalıbının ortasına hareket ettirin.
         NOT: Bu adım için hızlı çalışmak çok önemlidir çünkü parafin oda sıcaklığında katılaşır.
      8. Organoidleri stabilize etmek için metal taban kalıbını 10-20 saniye boyunca soğuk plakaya aktarın. Ardından, metal tabanlı kalıbı kaplamak için erimiş parafin dökün ve etiketleme için metal tabanlı kalıbın üstüne bir doku kaseti ( Malzeme Tablosuna bakın) ekleyin. Kalıpta yeterince parafin olduğundan emin olun ve ardından soğuk plaka üzerinde katılaşmasına izin verin. Metal taban kalıbını çıkarın.
      9. Standart bir mikrotom kullanarak 5-7 μm kalınlığında kesitler kesin (Malzeme Tablosuna bakınız). Seri parafin bölümlerini yapışkan mikroskop slaytlarına yerleştirin. Slaytları gece boyunca kurumaya bırakın.
   2. Hematoksilen ve eozin (H & E) ve periyodik asit-Shiff (PAS) boyaması yapın.
      1. Parafine gömülü slaytları deparafinizasyon için gece boyunca 63 ° C'lik bir inkübatöre koyun. Ertesi gün, slaytları her seferinde 20 dakika boyunca üç kez ksilene yerleştirin. Slaytların kurumasına izin vermeyin.
      2. Slaytları kademeli bir alkol serisi (%100 etanol, %96 etanol, %80 etanol ve %70 etanol) ile 2 dakika boyunca yeniden sulandırın. Daha sonra slaytları 1 dakika boyunca damıtılmış suya koyun.
      3. H&E boyama için aşağıdaki adımları gerçekleştirin.
      4. Slaytları 5 dakika hematoksilen çözeltisine koyun. Slaytları akan musluk suyunda 5 dakika durulayın. Slaytları %1 eozin Y solüsyonu ile 10 saniye boyayın ( Malzeme Tablosuna bakınız).
      5. Bölümleri her biri 30 saniye boyunca bir dizi %80 etanol, %96 etanol ve iki adet %100 etanol değişikliği ile kurutun.
      6. Her seferinde 20 dakika boyunca üç kez temizlemek için slaytları ksilenin içine koyun.
      7. Lamelleri, bir montaj ortamı ile cam kızaklar üzerindeki bölümlere dikkatlice monte edin ( Malzeme Tablosuna bakın). Kabarcık kalmadığından emin olun.
      8. PAS boyama için, 5.1.2.4-5.1.2.6 adımlarını ve ardından Akbari ve ^ark.10 tarafından bildirilen PAS boyama prosedürlerini gerçekleştirin. Daha sonra lamelleri montaj ortamı ile cam kızaklar üzerindeki bölümlere dikkatlice monte edin. Kabarcık kalmadığından emin olun.
   3. İmmünohistokimya (IHC) boyaması yapın.
      1. H & E boyama protokolünde adım 5.1.2.1 ve adım 5.1.2.2'yi gerçekleştirin.
      2. Slaytları 0.1 M sitrat tamponunda (pH 6.0) mikrodalgada 10 dakika ısıtın.
      3. Slaytlar oda sıcaklığına soğuyana kadar (yaklaşık 20 dakika) tutun ve slaytları damıtılmış suyla durulayın.
      4. Slaytları oda sıcaklığında 10 dakika boyunca metanol içinde taze hazırlanmış% 3 H₂O₂ içine koyun. Ardından slaytları damıtılmış suda 1 dakika durulayın.
      5. Bölümleri bir bloke edici solüsyon (% 2 serum +% 0.1 Triton X-100 +% 0.1 BSA) ile oda sıcaklığında 1 saat inkübe ederek primer antikorların spesifik olmayan bağlanmasını bloke edin.
      6. Blokaj solüsyonunu nazikçe çıkarın ve gece boyunca 4 ° C'de bloke edici solüsyon içinde seyreltilmiş birincil antikorları (E-CAD, ALB, EpCAM, A1AT, CK19) ekleyin ( Malzeme Tablosuna bakınız).
      7. Ertesi gün, slaytları 10 dakika boyunca iki kez dikkatlice durulayın (.
      8. İkincil antikorları (Keçi Tavşan Karşıtı, Keçi Fare Önleyici) ( Malzeme Tablosuna bakınız) oda sıcaklığında 1 saat ekleyin ve slaytları damıtılmış suda 5 dakika (üç kez) durulayın.
      9. 3'3 diaminobenzidin tetrahidroklorür (DAB, Malzeme Tablosuna bakınız) çözeltisi hazırlayın (bu, kullanımdan 30 dakika önce hazırlanmalıdır).
      10. DAB solüsyonunu slaytlara 1-5 dakika uygulayın ve slaytları damıtılmış suda 5 dakika (üç kez) durulayın.
      11. Bölümleri 1 dakika hematoksilen ile karşı boyayın ve slaytları 1 dakika akan musluk suyunda durulayın.
      12. Bölümleri her biri 30 saniye boyunca bir dizi %80 etanol, %96 etanol ve iki adet %100 etanol değişikliği ile kurutun.
      13. Slaytları 20 dakika (üç kez) ksilene koyun.
      14. Lameli bir montaj ortamı ile cam sürgü üzerindeki bölüme dikkatlice monte edin. Kabarcık kalmadığından emin olun.
   4. OCT ekleme işlemini gerçekleştirin.
      1. Organoidleri taze hazırlanmış soğuk %4 PFA kullanarak gece boyunca 4 ° C'de sabitleyin. Sabitleyiciyi dikkatlice çıkarın ve 1x PBS ile 15 dakika (üç kez) yıkayın.
      2. Damıtılmış su kullanarak% 30'luk bir sükroz çözeltisi (a / h) hazırlayın. 1x PBS'yi çıkarın ve organoidleri kurutmak için% 30 sükroz ekleyin.
      3. Organoidleri gece boyunca 4 ° C'de inkübe edin. Başlangıçta, çoğu doku% 30 sükroz içinde yüzer ve geçirgenlik tamamlandığında batar. Kriyoproteksiyon bu noktada tamamlanmış olarak kabul edilebilir.
      4. Gömme işlemi için kuru buz veya sıvı nitrojen hazırlayın.
      5. Plastik kriyokalıplara iki ila üç damla OCT ( Malzeme Tablosuna bakınız) koyun. Organoidleri kesmek için doğru yönde üstüne yerleştirin.
      6. OCT'yi yavaşça ve dikkatlice organoidlerin üzerine dökün. Kabarcıklardan kaçınmak için dikkatli olun. Organoidlerin oda sıcaklığında 10-15 dakika yerçekimi altında çökmesine izin verin.
      7. Dondurma adımından önce kriyokalıpları etiketleyin. Hızlı dondurma için kalıpları kuru buz veya sıvı nitrojen üzerine yerleştirin. Kriyokalıpları -80 °C'ye aktarın ve kesit alma işlemine kadar orada saklayın.
   5. İmmünofloresan (IF) boyama yapın.
      1. Donmuş bölüm boyama işlemini gerçekleştirin.
         1. Kriyo bölümlerini oda sıcaklığında 20-30 dakika havayla kurutun. Slaytları 5 dakika (üç kez) damıtılmış suyla yeniden sulandırın. Dokuyu bir pap-pen kullanarak hidrofobik bir bariyer ile çevreleyin (Malzeme Tablosuna bakınız).
         2. Bölüm başına 200-300 μL %0,2 Triton X-100 ekleyin. Slaytları 5 dakika (üç kez) dikkatlice yıkayın. Yıkama adımları sırasında bölümlerin kızaklardan düşmemesine dikkat edin.
         3. Oda sıcaklığında 1 saat boyunca bloke edici çözelti (% 2 serum +% 0.1 Triton X-100 +% 0.1 BSA) ekleyin.
         4. Blokaj solüsyonunu nazikçe çıkarın, blokaj solüsyonunda seyreltilmiş primer antikorları (E-CAD, A1AT, HNF4α) ekleyin ( Malzeme Tablosuna bakınız) ve slaytları gece boyunca 4 °C'de inkübe edin.Ertesi gün, slaytları 10 dakika (iki kez) dikkatlice durulayın.
         5. Oda sıcaklığında 1 saat boyunca uygun ikincil antikorlar (Alexa Fluor 488 [Fare], Alexa Fluor 594 [Fare], Alexa Fluor 594 [Tavşan]) ekleyin ( Malzeme Tablosuna bakın) ve slaytları damıtılmış suda 5 dakika (üç kez) durulayın.
         6. Bölüm başına 3 dakika boyunca 100-200 μL Hoechst veya DAPI nükleer boya ekleyin, slaytları 1x PBS ile yıkayın ve yıkama adımını üç kez tekrarlayın.
         7. Lamelleri, solmaya karşı dayanıklı bir montaj ortamı ile cam kızaklar üzerindeki bölümlere monte edin. Slaytları gece boyunca 4 °C'de tutun ve görüntüleme işlemine kadar ışıktan koruyun.
      2. Tam montajlı boyama yapın.
         1. Parafin gömme prosedüründe adım 5.1.1.1 ve adım 5.1.1.2'yi gerçekleştirin.
         2. Bloke edici çözelti ekleyin (1x PBS'de% 0.1 -% 1 Triton X-100,% 1 DMSO,% 1 BSA ve% 1 keçi serumu, Malzeme Tablosuna bakınız) ve organoidleri oda sıcaklığında 2-3 saat boyunca bloke edici çözelti ile inkübe edin.
         3. Blokaj solüsyonunu nazikçe çıkarın ve bloke edici solüsyon içinde seyreltilmiş primer antikorları (CK19, CK18, ZO-1, ALB) gece boyunca 4 °C'de ekleyin ( Malzeme Tablosuna bakınız).
         4. Ertesi gün, çözeltiyi yavaşça çıkarın ve 1x PBS ekleyin. Organoidlerin yerçekimi altında 10 dakikaya kadar yerleşmesine izin verin. Solüsyonu dikkatlice çıkarın ve yıkama adımını üç kez tekrarlayın.
         5. Organoidleri ikincil antikorlarla (Alexa Fluor 594 [Fare], Alexa Fluor 488 [Tavşan], Alexa Fluor 488 [Fare]) oda sıcaklığında en az 1 saat inkübe edin. Solüsyonu dikkatlice çıkarın ve yıkama adımını dört kez tekrarlayın.
         6. Nükleer boyama için, organoidleri Hoechst veya DAPI nükleer boya ile 10 dakika inkübe edin. Organoidleri 1x PBS ekleyerek yıkayın ve yıkama adımını üç kez tekrarlayın. Organoidlerin tüpün dibine yerleşmesine izin verin.
         7. Plastik bir Pasteur pipeti kullanarak organoidleri tüpten çıkarın ve cam slaytların üzerine yerleştirin. Organoidlere en az zarar vererek yaptığınızdan emin olun.
         8. Fazla PBS'yi çıkarın ve bir miktar (bir ila iki damla) montaj ortamı ekleyin. Lamelleri, montaj ortamı ile cam kızaklar üzerindeki organoidlerin üzerine dikkatlice monte edin. Slaytları 4 °C'de tutun ve görüntüleme işlemine kadar ışıktan koruyun.
2. Elektron mikroskobu yapın.
   1. Organoidleri Karnovsky çözeltisi (0,1 M sodyum fosfat tamponunda [Sorensen tamponu], pH 7.4, Malzeme Tablosuna bakınız) kullanarak gece boyunca 4 ° C'de Karnovsky çözeltisi (% 2,5 tamponlu glutaraldehit +% 2 paraformaldehit) kullanarak sabitleyin.
   2. Organoidleri 0.1 M Sorenson tamponu + 0.1 M sükroz (1: 1) ile 15 dakika (üç kez) yıkayın. Ardından, organoidleri %2 sodyum fosfat tamponlu osmiyum tetroksit içinde ( Malzeme Tablosuna bakınız) 90 dakika boyunca sabitleyin.
   3. Organoidleri %2 ılık agarın içine gömün. Bir neşter kullanarak organoidlerin etrafındaki fazla agarı kesin. Organoidleri Sorensen'in tamponunda 15 dakika (üç kez) yıkayın.
   4. 15 dakika (iki kez)% 50 aseton kullanarak kurutun.
   5. 4 °C'de %70 aseton + %1 fosfotungstik asit + %0,5 uranil asetat ( Malzeme Tablosuna bakınız) kullanarak gece boyunca kontrast oluşturun.
   6. Ertesi gün, organoidleri bir aseton serisi (%80 aseton, %90 aseton, %96 aseton ve %100 aseton) kullanarak 15 dakika (iki kez) kurutun.
   7. Propilen oksit kullanarak organoidleri 10 dakika (iki kez) temizleyin ve ardından organoidleri oda sıcaklığında 30 dakika boyunca bir epon:propilen oksit ( Malzeme Tablosuna bakınız) karışımına koyun.
   8. Organoidlere yeni bir epon çözeltisi ekleyin ve gece boyunca 4 ° C'de inkübe edin.
   9. Ertesi gün, temel kalıba yeni bir taze epon çözeltisi koyun ve ardından organoidleri gömün. Polimerizasyon için 65 ° C'de 48 saat inkübatöre koyun.
   10. Organoid epon bloklarını 50-100 nm kesit kalınlığına ayarlanmış bir ultramikrotom ile kesin. Bölümleri formvar kaplı ızgaralara koyun.
3. CYP3A4 enzim aktivitesini ölçün.
   1. Üreticinin talimatlarını izleyerek piyasada bulunan bir kit ( Malzeme Tablosuna bakınız) kullanarak CYP aktivitesini ölçün.
      NOT: CYP enzimleri, substratı saptanabilir bir ara ürüne^{dönüştürür} 11,12,13. CYP enzim aktivitesini ölçmek için iki seçenek (hücre litik ve litik olmayan) vardır. Kit, bileşik tedaviden sonra bazal CYP aktivitelerini ve indüklenen CYP aktivitelerini analiz etmek için bir uygulama sağlar.
   2. Denemeyi üç nüsha halinde çalıştırın. Lüminesansı bir luminometre ile okuyun ve sinyali hesaplayın. Normalleştirmek için organoidleri tripsinize edin ve hücre sayısını sayın.
4. İnsan albümin ölçümü yapın.
   1. ELISA testinden 24 saat önce hücre kültürü ortamını taze bir ortamla değiştirin. 24 saatlik inkübasyondan sonra, hücre kültürü ortamını (300-500 μL) toplayın ve hücre kalıntılarını ve partiküllerini çıkarmak için 500 x g'da (4 ° C'de) 2 dakika santrifüjleyin. Süpernatanı ayırın ve numuneleri -80 ° C'de (3 aya kadar) saklayın.
   2. Standardı ve örneği çift olarak çalıştırın. Olgunlaşmış organoidler albümini kültür ortamına salgılar; bu albümini bir ELISA miktar tayin kiti ile ölçün (Malzeme Tablosuna bakınız). Çözelti ilavesini durdurduktan sonra 30 dakika içinde 450 nm'de bir ELISA plaka okuyucu ile absorbansı ölçün. Organoidleri tripsinize edin ve normalleştirilecek hücre sayısını sayın.
5. Amonyak eliminasyon testini gerçekleştirin.
   1. Üreticinin talimatlarına göre amonyak eliminasyon testini gerçekleştirin ( Malzeme Tablosuna bakın). Kısaca, kültür ortamına 1.5 mM_NH4Cl ekleyin ve 24 saat inkübe edin.
   2. İnkübasyondan sonra, bir amonyak tahlil kiti ile amonyak konsantrasyonunu belirleyin ( Malzeme Tablosuna bakınız). Çok modlu bir çoklu plaka okuyucu kullanarak ölçümleri hesaplayın ve değerleri hücre numaralarına göre normalleştirin.
6. Kolilglisilaminido-floresein (CLF) testini gerçekleştirin.
   1. Kısaca, organoidleri 10 μmol / L CLF ile muamele edin ( Malzeme Tablosuna bakınız) ve 37 ° C'lik bir inkübatörde 1 saat inkübe edin. İnkübasyondan sonra, organoidleri 1x PBS ile yıkayın. Floresan mikroskobu kullanarak görüntüleme yapın.
7. Gen ekspresyon analizi yapın.
   1. eHEPO'lardan toplam RNA'yı izole etmek için RNeasy kiti ( Malzeme Tablosuna bakın) talimatlarını izleyin.
   2. Üreticinin talimatlarını izleyerek, piyasada bulunan bir ana karışım kullanarak ( Malzeme Tablosuna bakın) PCR reaksiyonunu ayarlayın. Her bir primer seti için PCR karışımını hazırladıktan sonra, her numuneden 10 μL'yi 96 oyuklu qPCR plakalarına yerleştirin (Tablo 1).
   3. Plakaları yapışkan sızdırmazlık maddesi ile kapatın ve ardından plakaları oda sıcaklığında 2 dakika boyunca 1.000 x g'da santrifüjleyin. Plakaları bir PCR makinesine yükleyin. Göreceli gen ekspresyonunu bir dahili kontrole normalleştirin (RPL41, Tablo 1) ve 2−ΔΔCt yöntemini ¹⁴ kullanarak analiz edin.

6. eHEPO'ların dondurularak saklanması

1. Kriyovialleri nitrojene dayanıklı bir işaretleyici ile etiketleyin. Dondurma kabının izopropanol seviyesini kontrol edin ve deneye başlamadan önce 15-30 dakika boyunca 4 ° C'de tutun.
2. Bir 50 μL BMM damlacığını bir kriyoviyalde dondurun. Adım 4.3'te açıklandığı gibi organoid mekanik ayrışma ile devam edin. Ayrışmadan sonra, hücre agregasını 500 μL soğuk dondurma ortamında yeniden süspanse edin, ardından süspansiyonu nazikçe kriyoviyallere aktarın ve bunları dondurma kabında tutun.
3. Hücre dondurma kabını −80 °C'ye aktarın ve 24 saat sonra kriyoviyalleri uzun süreli saklama için sıvı nitrojene aktarın.

7. eHEPO'ların çözülmesi

1. Bir su banyosunu ve Ad-DMEM/F12'yi 37 °C'ye önceden ısıtın.
2. Kriyojenik eldivenler kullanarak sıvı nitrojen deposundan bir eHEPO şişesini çıkarın. Buz kristalleri eriyene kadar şişeyi 37 °C'lik bir su banyosuna yerleştirin. Hücre süspansiyonunu 15 mL'lik konik bir tüpe aktarın ve 4 ° C'de 5 dakika boyunca 200 x g'da santrifüjleyin.
3. Süpernatanı aspire edin ve bölüm 4'te açıklandığı gibi eHEPO'ları tohumlamaya devam edin. BMM damlacığını 10 μM Y-27632 ile desteklenmiş genleşme ortamı ile kaplayın ( Malzeme Tablosuna bakın). Ortamı her 3 günde bir yenileyin ve 3 gün sonra ROCK inhibitörünü çıkarın.

Sonuçlar

İlk olarak, insan fibroblast hücreleri veya periferik kan mononükleer hücreleri (PBMC) hücreleri kültürlendi ve epizomal yeniden programlama yoluyla iPSC'lere dönüştürüldü. Taze nakavt serumu, sağlıklı iPSC'ler elde etmek için gerekliydi. Daha sonra, iPSC'ler% 50 -% 60 birleşme ile BMM kaplı kültür plakalarına ekildi. Küçük/orta büyüklükte iPSC kolonilerine sahip olmak, farklılaşma verimliliğini artırdı. Daha sonra, iPSC'ler 5 gün boyunca Activi...

Tartışmalar

Mevcut protokol, iPSC'lerden başlayarak hepatik organoidlerin üretilmesi, genişletilmesi ve dondurulması/çözülmesi için kapsamlı bir yöntemi açıklamaktadır. Bu protokol, iPSC'lerin besleyici ve besleyici içermeyen kültürde kültürlenmesi, 2 boyutlu endoderm farklılaşması, progenitör hücrelerin FACS ve organoid oluşumu ile zenginleştirilmesi ve fonksiyon kazandıran organoidlerin üretilmesi dahil olmak üzere tüm adımları kapsar. Ayrıca, organoidlerin doğrula...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
15 mL conical centrifuge tubes	Corning	430052
37 °C water bath	Nüve	210.NB9
37 °C, 5 % CO2 incubator	Memmert	INCO 153
50 mL conical centrifuge tubes	Corning	430290
70 µm and 40 µm Cell strainer	Falcon	352350/ 352340
70% Ethanol	Sigma	1009832511
A1AT	Abcam	ab166610	Dilution: 1/500 (IF), 1/50 (IHC)
A-83.01 (TGF-β inhibitor)	Tocris Biosciene	2939
Acetone	Isolab	9,01,026
Adhesive Microscope Slide	Histobond	C981040
Advanced DMEM-F12	Gibco	12634-010
AFP	Abcam	ab3980	Dilution: 1/25 (IHC)
Agar	EMS	10200
ALB	Abcam	ab10241	Dilution: 1/100 (IF), 1/20 (IHC)
Alexa Flour 488 (Mouse)	Invitrogen	A11001	Dilution: 1/1000 (IF)
Alexa Flour 488 (Rabbit)	Invitrogen	A110034	Dilution: 1/1000 (IF)
Alexa Flour 594 (Mouse)	Invitrogen	A11005	Dilution: 1/1000 (IF)
Alexa flour 594 (Rabbit)	Invitrogen	A11037	Dilution: 1/1000 (IF)
Ammonia Assay Kit	Sigma-Aldrich	MAK-310
Ammonium cloride	Santa Cruz	sc-202936
B27 Supplement 50x	Gibco	12587010
Base mold	Sakura	4216
b-FGF	Peprotech	100-18B
Biosafety, CLASS II,SAFETY CABINET	Thermo	SAFE 2020
Calibrated pipettes	Gilson	F167380
Centrifuge	Eppendorf	5702
Cholylglycylamido-fluorescein	Corning	451041
Citrate Buffer pH 6.0	Bio-optica	15-M103
CK-18	Santa Cruz	sc-51582	Dilution: 1/100 (IF), 1/20 (IHC)
CK-19	Santa Cruz	sc-6278	Dilution: 1/100 (IF), 1/20 (IHC)
Confocal Microscope	Zeiss	LSM880
Cryogenic handling gloves and eye protection	Cryokit	5274
Cryostat	Leica	CM 1950
Cryovial tubes	Corning	430659
DAB	Roche	11718096001
DAPT	Sigma-Aldrich	a5942
Dexamethasone	Sigma-Aldrich	D4902
Dispase	Stem Cell Technologies	7923
DMEM F12	Gibco	31330038
E-CAD	Santa Cruz	sc-8426	Dilution: 1/100 (IF), 1/20 (IHC)
EDTA	Invitrogen	15575-020
Electron Microscope	Zeiss	Sigma500
ELISA kit	Fortis life sciences bethyl	E88-129
Embed 812 Embedding Kit	EMS	14121
Entellan	Merck	107961
Eosin Y %1	Sigma-Aldrich	HT110332
EpCAM	Miltenyi Biotec	130-059-901	Dilution: 1/11 (FACS)
Ethanol	Merck	1,00,98,32,511
Fetal Bovine Serum (FBS)	Gibco	26010066
Forskolin (FSK)	Tocris Biosciene	1099
Freezing container (Mr. Frosty)	Thermo	5100-0001
Freezing Medium	Gibco	12648010
Glass Pasteur pipette	Isolab	084.01.001
Glutamax 100x	Gibco	35050-068
Gluteraldehyde %25, EM grade	EMS	16210-1L
Goat Anti-Mouse HRP	Thermo Fisher	62-6520	Dilution: 1/1000 (IHC)
Goat Anti-Rabbit HRP	Thermo Fisher	31460	Dilution: 1/1000 (IHC)
Goat Serum	Gibco	162-10-072
H2O2	Merck	107209
Hematoxylin	Millipore	HX86017674
HEPES, 1 M	Gibco	15630-056
HNF-4α	Abcam	ab55223	Dilution: 1/50 (IHC)
Ice and dry ice	homemade	homemade
Incubator (65 °C)	Nüve	EN 400
Isopropanol	Sigma-Aldrich	24137
Leu15 Gastrin I human	Sigma-Aldrich	G9145
Luminometer	Berthold Tech	LB 960
Master mix	Applied Biosystems	43676659
Matrigel matrix, hESC-Qualified	Corning	354277
Matrigel matrix, phenol-red-free	Corning	356231
Methanol	Merck	179337
Microcentrifuge tubes	Axygen	321-02-501
Microscope	Zeiss	AXIO VERT A1
Microtome blade	Feather	S35, C35
mTeSR1	Stem Cell Technologies	sc-05850
Multi well suspension culture plates	Sarstedt	83,39,21,500
N2 supplement 100x	Gibco	17502048
N-Acetylcysteine	Sigma-Aldrich	A9165
Neutral Buffered Formalin %10	Tekkim	TK.60161.05001
Nicotinamide	Sigma-Aldrich	N0636
Non-essential Amino Acide (NEAA)	Gibco	11140050
OCT	Tissue-Tek	4583
Osmium tetroxide	EMS	19110
P450-Glo Assays kit	Promega	V9001
Pap-pen	Sigma	Z377821-1EA
Paraffin	Tekkim	TK.200661.01002
PAS stain kit	Abcam	ab150680
PBS	Lonza	be17-516
Penicillin/Streptomycin	Gibco	15630-056
Phosphotungustic acid	Ted Pella	19402
Pipette aid	Axygen	Motopet-1
Plate reader varioskan flash	Thermo	5250040
Prolong Antifade Mountant	Invitrogen	P36980
Propylene Oxide, EM grade	EMS	20401
Real Time PCR system	Applied Biosystems	7500 Fast
Recombinant human Activin A	R&D	338-Ac-050
Recombinant human BMP7	Peprotech	120-03
Recombinant human EGF	Peprotech	af-100-15
Recombinant human FGF10	Peprotech	100-26
Recombinant human FGF19	Peprotech	100-32
Recombinant human HGF	Peprotech	100-39
Rho kinase inhibitor, Y-27632 dihydrochloride	Sigma-Aldrich	Y0503
RNase/DNase free 1.5 mL tube	Axygen	31108101
RNase/DNase free filter tips	Sarstedt	703031255
Rotary Microtome	Leica	RM 2245
RPMI 1640 Medium	Gibco	61870010
Rspo1-conditioned medium	Homemade
Slide master	Bio-optica	15-MEQ001
Sorenson’s Phosphate Buffer	EMS	11600-10
Spinner	Thermo	MY SPIN 6
Sterile serological pipettes	Falcon	357543
Tissue Casette	Leica	3802240
Trimmer	Leica	EM TRIM2
Triton X-100	Thermo Scientific	28314
TrypLE Express Enzyme	Gibco	12605010
Trypsin-EDTA	Gibco	25200-056
Ultramicrotome	Leica	EM UC7
Uranylacetate	EMS	22400
Vortex	Thermo	88880018
Wnt Surrogate-Fc Fusion Protein	ImmunoPrecise	N001
Xylene	Sigma	16446
ZO-1	Invitrogen	40-2200	Dilution: 1/400 (IF)