JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

هنا ، نصف بروتوكولا ، طريقة زراعة الخلايا البطانية الممتدة (EECM) ، والتي تسمح بتمايز الخلايا الجذعية متعددة القدرات إلى خلايا تشبه الخلايا البطانية الوعائية الدقيقة في الدماغ (BMEC). تظهر هذه الخلايا تعبيرا جزيئيا عن التصاق الخلايا البطانية ، وبالتالي فهي نموذج حاجز دموي دماغي بشري مناسب لدراسة تفاعلات الخلايا المناعية في المختبر.

Abstract

يعد خلل الحاجز الدموي الدماغي (BBB) سمة مرضية مميزة للعديد من الأمراض التنكسية العصبية والالتهابية العصبية التي تؤثر على الجهاز العصبي المركزي (CNS). نظرا لمحدودية الوصول إلى عينات BBB المرتبطة بالمرض ، لا يزال من غير المفهوم جيدا ما إذا كان عطل BBB هو سبب لتطور المرض أو بالأحرى نتيجة لعملية الالتهاب العصبي أو التنكس العصبي. وبالتالي ، توفر الخلايا الجذعية متعددة القدرات التي يسببها الإنسان (hiPSCs) فرصة جديدة لإنشاء نماذج BBB في المختبر من المتبرعين الأصحاء والمرضى ، وبالتالي دراسة خصائص BBB الخاصة بالمرض من المرضى الفرديين. تم وضع العديد من بروتوكولات التمايز لاشتقاق الخلايا البطانية الوعائية الدقيقة في الدماغ (BMEC) من hiPSCs. النظر في سؤال البحث المحدد إلزامي للاختيار الصحيح لبروتوكول تمايز BMEC المعني. هنا ، نصف طريقة زراعة الخلايا البطانية الممتدة (EECM) ، والتي تم تحسينها للتمييز بين hiPSCs إلى خلايا شبيهة ب BMEC ذات نمط ظاهري مناعي ناضج ، مما يسمح بدراسة تفاعلات الخلايا المناعية و BBB. في هذا البروتوكول ، يتم تمييز hiPSCs أولا إلى خلايا سلفية بطانية (EPCs) عن طريق تنشيط إشارات Wnt / β-catenin. ثم يتم تمرير المزرعة الناتجة ، التي تحتوي على خلايا تشبه العضلات الملساء (SMLCs) ، بالتتابع لزيادة نقاء الخلايا البطانية (ECs) وللحث على خصائص خاصة ب BBB. تسمح الزراعة المشتركة ل EECM-BMECs مع هذه SMLCs أو الوسط المشروط من SMLCs بالتعبير القابل للتكرار والتأسيسي والمنظم بالسيتوكين لجزيئات التصاق EC. الأهم من ذلك ، أن الخلايا الشبيهة ب EECM-BMEC تنشئ خصائص حاجز مماثلة ل BMECs البشرية الأولية ، وبسبب تعبيرها عن جميع جزيئات التصاق EC ، تختلف الخلايا الشبيهة ب EECM-BMEC عن غيرها من نماذج BBB المشتقة من hiPSC. وبالتالي فإن الخلايا الشبيهة ب EECM-BMEC هي النموذج المفضل للتحقيق في التأثير المحتمل لعمليات المرض على مستوى BBB ، مع تأثير على تفاعل الخلايا المناعية بطريقة شخصية.

Introduction

تتكون وحدة الأوعية الدموية العصبية (NVU) في الجهاز العصبي المركزي (CNS) من الخلايا البطانية الوعائية الدقيقة عالية التخصص (ECs) ، والخلايا المحيطة المضمنة في الغشاء القاعدي البطاني بالإضافة إلى الغشاء القاعدي المتني ونهاية الخلاياالنجمية 1. داخل NVU ، الخلايا البطانية الوعائية الدقيقة في الدماغ (BMECs) هي المكونات الرئيسية التي تشكل الحاجز الدموي الدماغي (BBB). تشكل BMECs تقاطعات ضيقة معقدة ومستمرة ولها نشاط بينوسيتي منخفض للغاية مقارنة ب ECs الوعائية الدقيقة في الأعضاء الطرفية ، والتي تسمح ل BBB بتثبيط الانتشار الحر للجزيئات القابلة للذوبان في الماء في الجهاز العصبي المركزي. يضمن التعبير عن ناقلات التدفق المحددة ومضخات التدفق بواسطة BMECs امتصاص وتصدير العناصر الغذائية والجزيئات الضارة ، على التوالي ، من الجهاز العصبي المركزي2. بالإضافة إلى ذلك ، يتحكم BBB بشكل صارم في دخول الخلايا المناعية إلى الجهاز العصبي المركزي من خلال التعبير عن مستويات منخفضة من جزيئات التصاق البطانية الضرورية لتهريب الخلايا المناعية إلى الجهاز العصبيالمركزي 3. في ظل الظروف الفسيولوجية ، تكون مستويات التعبير عن جزيئات الالتصاق على سطح BMECs ، مثل جزيء الالتصاق بين الخلايا -1 (ICAM-1) وجزيء التصاق الخلايا الوعائية -1 (VCAM-1) ، منخفضة ، لكن هذه المستويات تزداد في بعض الاضطرابات العصبية2. تم الإبلاغ عن الانهيار المورفولوجي والوظيفي ل BBB في العديد من الأمراض العصبية ، مثل السكتة الدماغية4 والتصلب المتعدد (MS) 5 والعديد من الأمراض التنكسية العصبية6،7،8. التحقيق التفصيلي للخصائص الخلوية والجزيئية ل BMECs في ظل كل من الظروف الفسيولوجية والمرضية هو نهج لتحديد الاستراتيجيات العلاجية الجديدة التي تستهدف BBB.

حتى وقت قريب ، تم استخدام BMECs البشرية والقوارض الأولية أو الخالدة لدراسة BBB. ومع ذلك ، من غير الواضح ما إذا كانت الاستنتاجات المستندة إلى النماذج الحيوانية ل BBB قابلة للتطبيق بسهولة على BBB البشري ، لأن التعبير عن العديد من الجزيئات المهمة ، بما في ذلك جزيئات الالتصاق والبروتينات الحاملة للمذاب ، يختلف بين البشر والقوارض 9,10. على الرغم من أن خطوط BMEC البشرية مثل hCMEC / D3 تعبر عن مستويات مناسبة من جزيئات الالتصاق11 ، إلا أن BMECs الخالدة هذه لا تحتوي عموما على تقاطعات ضيقة معقدة وخصائص حاجز قوية12. تعد BMECs البشرية الأولية مفيدة لدراسة وظائف الحاجز13 ، لكنها ليست متاحة بسهولة لجميع الباحثين. علاوة على ذلك ، قد يكون من الصعب الحصول على BMECs الأولية من المرضى حيث يجب جمعها من خلال خزعة الدماغ أو الجراحة التي يتم إجراؤها فقط في ظل ظروف سريرية محددة.

سمحت التطورات الحديثة في تكنولوجيا الخلايا الجذعية بالتمايز بين أنواع الخلايا البشرية المختلفة ، الناشئة عن مصادر الخلايا الجذعية مثل الخلايا الجذعية متعددة القدرات التي يسببها الإنسان (hiPSCs). تسمح لنا النماذج المشتقة من hiPSC بإنشاء نماذج فيزيولوجية مرضية باستخدام عينات مشتقة من المريض. يمكن الجمع بين العديد من أنواع الخلايا المشتقة من hiPSC لإنشاء ثقافات مشتركة ذاتية أو عضويات تحاكي الظروف الفسيولوجية بشكل أفضل. يمكن استخدام العديد من البروتوكولات المستخدمة على نطاق واسع14،15،16،17،18،19 للتمييز بين الخلايا الشبيهة ب BMEC المشتقة من hiPSC والتي لها خصائص حاجز انتشار قوية مع التعبير عن الناقلات الخاصة ب BBB ومضخات التدفق ، وهي مفيدة لدراسة الانتشار شبه الخلوي للجزيئات الصغيرة وآليات النقل الجزيئي وتوصيل الدواء إلى الدماغ20,21. ومع ذلك ، فقد أظهرت الدراسات السابقة أن الخلايا الشبيهة ب BMEC المشتقة من hiPSC المستخدمة على نطاق واسع تفتقر إلى التعبير عن جزيئات التصاق البطانية الرئيسية ، بما في ذلك VCAM-1 و selectins و ICAM-2 ، المسؤولة عن التوسط في التفاعلات بين الخلايا المناعية و BBB22. علاوة على ذلك ، تم الإبلاغ عن BMECs السابقة المشتقة من hiPSC لإظهار خصائص بطانية وظهارية مختلطة على مستوى النسخ23. لذلك ، قمنا بتطوير طريقة زراعة الخلايا البطانية الممتدة (EECM) ، وهو بروتوكول جديد يسمح بتمايز hiPSCs إلى خلايا شبيهة ب BMEC تشبه BMECs البشرية الأولية فيما يتعلق بالتشكل وخصائص الحاجز وتعبير جزيء الالتصاق البطاني. يصف هذا البروتوكول الإجراءات المنهجية التفصيلية للتمييز بين hiPSCs والخلايا الشبيهة ب BMEC التي تعرض نمطا ظاهريا مناعيا ناضجا.

Protocol

figure-protocol-68
الشكل 1: نظرة عامة على البروتوكول. تقدم المخطوطة بروتوكولا خطوة بخطوة للتمييز بين hiPSCs إلى خلايا تشبه EECM-BMEC. تصور المخططات الصحيحة مجموعات الخلايا في كل خطوة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

تم توفير خط hiPSC ، HPS1006 ، من قبل RIKEN BRC من خلال المشروع الوطني للموارد الحيوية التابع ل MEXT / AMED ، اليابان.

1. تحريض تمايز hiPSC في الخلايا السلفية البطانية (EPCs)

  1. الصفائح والكواشف المغلفة بالمصفوفة خارج الخلية (ECM)
    1. قم بإعداد ألواح 12 بئرا مغلفة بمصفوفة الغشاء القاعدي عن طريق اقتباس 2.5 مجم من هلام المصفوفة في أنابيب طرد مركزي سعة 50 مل للتخزين عند -20 درجة مئوية لمدة تصل إلى 6 أشهر. أضف 30 مل من خليط النسر المتوسط / المغذي المعدل من Dulbecco F-12 (DMEM / F12) ، والذي تم حفظه في الثلاجة (4 درجات مئوية) ، في الأنبوب. امزج برفق عن طريق السحب حتى يذوب الجل ثم أضف 500 ميكرولتر من المحلول إلى كل بئر من اللوحة المكونة من 12 بئرا. ضع اللوحة في حاضنة (37 درجة مئوية ، 5٪ CO2) لمدة 1 ساعة على الأقل.
      ملاحظة: جل مصفوفة الغشاء القاعدي حساس لدرجة الحرارة ويجب التعامل معه وفقا لتعليمات الشركة المصنعة للاقتباس وطلاء الألواح. يمكن أن يختلف تركيز بروتينات المصفوفة خارج الخلية بين الدفعات. لضمان الدقة ، يجب الإشارة إلى التركيز الدقيق في ورقة شهادة الجودة للدفعة المحددة ، باستخدام رقم اللوت. على سبيل المثال ، إذا كان التركيز الدقيق 10.0 مجم / مل ، فاستخدم 250 ميكرولتر من الجل ليصبح المجموع 2.5 مجم.
    2. تحضير محلول مخزون مثبطات رو كيناز (ROCK) عن طريق إذابة مثبط ROCK في الماء المعقم إلى تركيز 10 mM (الجدول 1). قم بقسمة محلول المخزون بأحجام 100-200 ميكرولتر وخزنه في -20 درجة مئوية لتجنب دورات التجميد والذوبان.
    3. اصنع محلول مخزون 100 مجم / مل من حمض الأسكوربيك عن طريق إذابة 5 جم من حمض الأسكوربيك في 50 مل من الماء المعقم وتخزينه عند -20 درجة مئوية (الجدول 1). أضف 6.25 مل من الجلوتامين و 305 ميكرولتر من محلول مخزون حمض الأسكوربيك إلى 500 مل من DMEM / F12 المتقدم لعمل وسط LaSR24 (الجدول 1). يحفظ في درجة حرارة 2-8 درجة مئوية لمدة تصل إلى أسبوعين.
    4. تحضير محلول CHIR99021 عن طريق إذابة CHIR99021 في ثنائي ميثيل سلفوكسيد غير مخفف (DMSO) إلى تركيز نهائي قدره 10 mM (الجدول 1). قم بتقسيم المحلول إلى أحجام 100-200 ميكرولتر لتجنب دورات التجميد والذوبان وتخزينها في -20 درجة مئوية لمدة تصل إلى 1 سنة. قم بتخزين حصص العمل من محلول المخزون عند 4 °C لمدة تصل إلى 1 شهر.
    5. تحضير وسط DMEM / F12-10 بإضافة 50 مل من مصل الجنين البقري المعطل بالحرارة إلى 450 مل من DMEM / F12. قم بتخزين الوسط في درجة حرارة 2-8 درجة مئوية لمدة تصل إلى شهر واحد (الجدول 1).
    6. قم بإعداد مخزن التدفق المؤقت -1 بإضافة 33.3 مل من 7.5٪ من ألبومين مصل الأبقار (BSA) إلى 467 مل من محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) من Dulbecco (الجدول 1). يحفظ في درجة حرارة 2-8 درجة مئوية لمدة تصل إلى 6 أشهر.
  2. بذر hiPSCs المفردة والتوسع لتمايز EPC (اليوم -3 إلى اليوم -1)
    1. ابدأ التمايز عندما لا تظهر مستعمرات hiPSC في صفيحة ذات 6 آبار أي تمايز تلقائي ولها الكثافة المناسبة للمرور ، وعادة ما تكون حوالي 80٪ التقاء (2.5-3.5 × 106 خلايا). راقب بعناية الخلايا المتمايزة تلقائيا تحت المجهر للتأكد مما إذا كانت هناك حاجة إلى ممرات متعددة للقضاء على الخلايا غير المتمايزة. راجع الملاحظة الواردة أدناه الخطوة 1.4.15 للحصول على معلومات حول وسط زراعة الخلايا والمصفوفة خارج الخلية.
    2. نضح الوسط وإضافة 1 مل من كاشف التفكك إلى الآبار واحتضانه لمدة 5-7 دقائق عند 37 درجة مئوية. قم بفصل الخلايا وتفردها عن طريق سحب محلول كاشف التفكك برفق على أسطح الآبار مرتين أو ثلاث مرات.
    3. انقل الخلايا المنفصلة إلى أنبوب سعة 15 مل يحتوي على 4 مل من وسط صيانة hiPSC وأعد تعليق الخلايا جيدا. حجز 10 ميكرولتر من القسمة لعد الخلايا.
    4. قم بتكوير الخلايا عن طريق الطرد المركزي لمدة 5 دقائق عند 200 × جم عند 20-25 درجة مئوية. عد الخلايا واحسب الحجم المطلوب لتحقيق كثافة مناسبة من hiPSCs (75-400 × 103 لكل بئر) في صفيحة 12 بئرا مغلفة بمصفوفة غشاء القاع (الخطوة 1.1.1).
    5. قم بشفط محلول الطلاء من الآبار وأضف 1 مل من وسط hiPSC يحتوي على مثبط 10 ميكرومتر ROCK في كل بئر (1: 1000 تخفيف). بعد الطرد المركزي ، نضح المادة الطافية وافصل الحبيبات في 1 مل من وسط hiPSC.
    6. أضف الحجم المطلوب من hiPSC ، المحدد في الخطوة 1.2.4 ، إلى كل بئر من لوحة 12 بئرا. قد تكون لوحتان إلى أربع لوحات من 12 بئرا كافية للتمييز بين استنساخ hiPSC. راجع الخطوة 1.2.4 لتحديد عدد الألواح المطلوبة لخلايا البذر.
    7. ضع اللوحة في حاضنة (37 درجة مئوية ، 5٪ CO2). قم بتوزيع الخلايا بالتساوي عن طريق تحريك اللوحة برفق ذهابا وإيابا ثم جنبا إلى جنب في الحاضنة.
    8. في اليوم التالي (أي اليوم -2) ، استبدل الوسط ب 2 مل من وسط صيانة hiPSC الذي يفتقر إلى مثبط ROCK. في اليوم التالي (اليوم -1) ، استبدل الوسيط ب 2 مل من وسيط صيانة hiPSC الطازج.
  3. تحريض EPCs مع مثبط الجليكوجين سينسيز كيناز 3 (GSK-3) CHIR99021 (اليوم 0 إلى اليوم 5)
    1. في اليوم 0 ، استبدل وسيط صيانة hiPSC في كل بئر ب 2 مل من وسط LaSR يحتوي على 8 ميكرومتر CHIR99021.
    2. في اليوم 1 ، نضح الوسط وأضف 2 مل من وسط LaSR الطازج الذي يحتوي على 8 ميكرومتر CHIR99021.
    3. في الأيام 2 و 3 و 4 ، استبدل الوسط ب 2 مل من وسيط LaSR الطازج الذي يفتقر إلى CHIR99021.
  4. فرز الخلايا المنشطة مغناطيسيا (MACS) لتنقية CD31+ EPCs (اليوم 5)
    1. في اليوم الخامس ، نضح الوسط ثم أضف 1 مل من كاشف التفكك إلى كل بئر ، قبل الحضانة لمدة 6-8 دقائق عند 37 درجة مئوية.
    2. قم بفصل الخلايا وتفردها باستخدام ماصة دقيقة وتمر عبر مصفاة خلية 40 ميكرومتر لتصفية المعلق في أنبوب سعة 50 مل يحتوي على 10 مل من وسط DMEM / F12-10. قم بتصفية تعليق الخلية الذي تم جمعه من أكثر من لوحين من 12 بئرا إلى أنبوبين سعة 50 مل على الأقل.
    3. أوقف تفاعل الهضم بإضافة DMEM / F12-10 متوسط (حتى 50 مل). ماصة جيدا وحجز 10 ميكرولتر لحساب الخلايا. قم بتكوير الخلايا عن طريق الطرد المركزي لمدة 5 دقائق عند 200 × جم عند 20-25 درجة مئوية.
    4. بعد إزالة المادة الطافية ، أضف 10 مل من وسط DMEM / F12-10 وانقل تعليق الخلية إلى أنابيب جديدة سعة 15 مل. قم بتكوير الخلايا عن طريق الطرد المركزي لمدة 5 دقائق عند 200 × جم عند 20-25 درجة مئوية.
    5. نضح المادة الطافية وإعادة تعليقها في مخزن التدفق -1 بكثافة 1.0 × 107 خلايا لكل 100 ميكرولتر من المخزن المؤقت.
    6. أضف كاشف حجب FcR بنسبة 1: 100 واحتضن لمدة 5 دقائق قبل إضافة الجسم المضاد CD31 المسمى بالفلوريسئين إيزوثيوسيانات (FITC) المخفف 1: 200. احتضان المعلق لمدة 30 دقيقة في الظلام عند 20-25 درجة مئوية.
    7. أضف 10 مل من المخزن المؤقت للتدفق -1 ، مع الاحتفاظ ب 10 ميكرولتر من المعلق لتحليل قياس التدفق الخلوي لتحديد جزء خلايا CD31 + (الشكل 2).
    8. قم بإذابة الخلايا عن طريق الطرد المركزي عند 200 × جم لمدة 5 دقائق عند 20-25 درجة مئوية. بعد ذلك ، قم بإزالة المادة الطافية وإعادة التعليق إلى كثافة 1.0 × 107 خلايا لكل 100 ميكرولتر من محلول التدفق المخزن المؤقت -1. أضف كوكتيل اختيار FITC (5 ميكرولتر لكل 100 ميكرولتر من تعليق الخلية). تخلط جيدا عن طريق سحب الخناق وتحتضن في الظلام لمدة 15 دقيقة عند 20-25 درجة مئوية.
    9. أضف 5 ميكرولتر من الجسيمات النانوية المغناطيسية لكل 100 ميكرولتر من تعليق الخلية ، وبئر ماصة ، واحتضانها في الظلام لمدة 10 دقائق عند 20-25 درجة مئوية.
    10. انقل معلق الخلية إلى أنبوب قياس التدفق الخلوي سعة 5 مل وأضف محلول التدفق -1 لتحقيق حجم إجمالي قدره 2.5 مل. ضع أنبوب قياس التدفق الخلوي في المغناطيس لمدة 5 دقائق.
    11. في حركة مستمرة ، اقلب المغناطيس وصب تعليق الخلية الذي يحتوي على خلايا لم يتم تمييزها بالجسم المضاد FITC-CD31. حافظ على المغناطيس والأنبوب في الوضع المقلوب لمدة 2-3 ثوان ثم قم بإزالة السائل المتبقي. قم بشفط أي قطرات على حافة الأنبوب قبل إعادة الأنبوب إلى الوضع الرأسي.
    12. التقط أنبوب قياس التدفق الخلوي من المغناطيس وأضف 2.5 mL من المخزن المؤقت للتدفق -1 لغسل خلايا CD31+ المتبقية. أعد تعليق الخلايا عن طريق سحب الخلايا برفق لأعلى ولأسفل مرتين أو ثلاث مرات. ضع أنبوب التدفق في المغناطيس لمدة 5 دقائق.
    13. كرر الخطوات 1.4.11-1.4.12 ثلاث مرات ثم الخطوة 1.4.11 مرة أخرى ليصبح المجموع أربع غسلات.
    14. قم بإزالة أنبوب التدفق من المغناطيس وأضف الكمية المحددة من وسط مناسب (على سبيل المثال ، وسط خال من المصل البطاني البشري [hECSR] لثقافة EC الممتدة أو وسط التجميد للتجميد) إلى الأنبوب لإعادة تعليق خلايا CD31 + المنقى. احتفظ بقنصتين 10 ميكرولتر من التعليق ، واحدة لعد الخلايا والثانية لإجراء تحليل قياس التدفق الخلوي لتقييم نقاء خلايا CD31 + في عينات ما بعد MACS (الشكل 2). إذا لم يكن مقياس التدفق الخلوي متاحا على الفور ، فقم بتخزين القسمة عند 4 درجات مئوية حتى التحليل.
    15. إذا تعذر تنفيذ الخطوات التالية (من خلال الخطوة 2) على الفور ، فقم بتجميد CD31 + EPCs في هذه المرحلة. للتوسع والمرور الانتقائي ل EPCs ، انتقل إلى الخطوة 2.
      ملاحظة: يمكن استخدام ألواح 12 بئرا المطلية ب25 Vitronectin ووسيط صيانة hiPSC الأكثر ثباتا (mTeSR plus) بدلا من الألواح المغلفة بمصفوفة الغشاء القاعدي ووسط صيانة hiPSC (mTeSR1). لتحضير ألواح 12 بئرا المطلية بالفيترونيكتين ، قم بتخفيف الفيترونيكتين بمحلول التخفيف إلى تركيز نهائي قدره 10 ميكروغرام / مل ثم انقل 500 ميكرولتر من المحلول المخفف إلى كل بئر من ألواح 12 بئرا. اترك الألواح على حرارة 20-25 درجة مئوية لمدة 1 ساعة على الأقل. كثافة البذر ل hiPSCs المفردة قابلة للمقارنة مع تلك المستخدمة في الألواح المطلية بمصفوفة الغشاء القاعدي. قد يؤثر تغيير وسيط الاستزراع أو تكوين المصفوفة على الانتشار والتمايز التلقائي ل hiPSCs ، والتي تتطلب عادة 1-2 أسابيع للتكيف مع ظروف الاستزراع الجديدة. إذا تم استخدام وسيط صيانة hiPSC الأكثر استقرارا لصيانة hiPSC ، فيمكن استخدام هذا الوسيط لتمايز EPC بدلا من وسيط صيانة hiPSC. في هذه الحالة ، يجب تغيير وسيط صيانة hiPSC الأكثر استقرارا في اليوم -2 لإزالة مثبط ROCK ، ويمكن تخطي التبادل في اليوم -1.

2. طريقة زراعة الخلايا البطانية الموسعة (EECM) للتمييز بين الخلايا الشبيهة بالخلايا البطانية الوعائية الدقيقة في الدماغ (الخلايا الشبيهة ب BMEC) والخلايا الشبيهة بالعضلات الملساء (SMLCs)

  1. تحضير الألواح والكواشف المطلية بالكولاجين
    1. قم بإعداد ألواح 6 آبار مغلفة بالكولاجين عن طريق إذابة 5 ملغ من الكولاجين المتبلور من النوع الرابع في 5 مل من الماء المعقم. احتضان بين عشية وضحاها في 4 درجة مئوية قبل الاقتباس وتخزينها في -20 درجة مئوية. قم بتخفيف حصص الكولاجين الوريدي 1: 100 في الماء المعقم لإنتاج محاليل 10 ميكروغرام / مل وإضافة 1 مل من محاليل الكولاجين الوريدية 10 ميكروغرام / مل إلى كل بئر من الألواح المكونة من 6 آبار. احتضن الأطباق لمدة 30 دقيقة على الأقل عند 37 درجة مئوية. يمكن تخزين اللوحات في 37 درجة مئوية لمدة تصل إلى 1 أسبوع.
    2. قم بإعداد محلول مخزون لعامل نمو الخلايا الليفية البشرية 2 (FGF2) عن طريق إذابة 500 ميكروغرام من FGF في 5 مل من PBS من Dulbecco ، وإضافة 7.5٪ BSA إلى تركيز نهائي قدره 0.1٪ ، وتقسيم محلول المخزون إلى أحجام 20-200 ميكرولتر. يمكن تخزينها في -20 درجة مئوية لمدة تصل إلى 3 أشهر (الجدول 1). يمكن تخزين حلول المخزون في 4 °C لمدة تصل إلى 1 شهر ؛ تجنب دورات التجميد والذوبان. تحضير وسط hECSR بإضافة 2 مل من مكمل B-27 و 20 ميكرولتر من FGF2 إلى 98 مل من وسط hECSR (الجدول 1). يمكن تخزين وسيط hECSR في درجة حرارة 2-8 درجة مئوية لمدة تصل إلى أسبوعين.
    3. تحضير وسط التجميد ل EPCs والخلايا الشبيهة ب EECM-BMEC و SMLCs بإضافة 15 مل من مصل الأبقار الجنينية ، و 5 مل من DMSO ، و 25 ميكرولتر من محلول مثبط ROCK إلى 30 مل من وسط hECSR (الجدول 1). يمكن تخزين وسط التجميد في درجة حرارة 2-8 درجة مئوية لمدة تصل إلى أسبوعين.
  2. بذر EPCs لزراعة الخلايا البطانية الممتدة
    1. قم بإزالة محلول الكولاجين من الألواح المكونة من 6 آبار. بعد ذلك ، انقل 1.0-2.0 × 105 CD31 + EPCs المنقى في 2 مل من وسط hECSR يحتوي على مثبط 5 μM ROCK (تخفيف 1: 2000). ضع اللوحة في حاضنة (37 درجة مئوية ، 5٪ CO2). قم بتوزيع الخلايا بالتساوي عن طريق تحريك الألواح برفق ذهابا وإيابا ، ثم من جانب إلى آخر.
    2. في اليوم التالي ، قم بإزالة وسط hECSR الذي يحتوي على مثبطات ROCK وأضف 2 مل من وسط hECSR الطازج بدون مثبطات ROCK. تبادل وسيط hECSR كل يوم حتى يتم الوصول إلى التقاء 100٪.
      ملاحظة: إذا تعذر الحفاظ على جدول تغذية منتظم خلال عطلة نهاية الأسبوع ، فيمكن استبدال الوسيط في مساء يوم العمل الأخير من الأسبوع ومرة أخرى في الصباح الباكر بعد عطلة نهاية الأسبوع.
  3. ممر انتقائي لتنقية الخلايا الشبيهة ب EECM-BMEC و SMLCs
    1. قم بإزالة وسط hECSR من الألواح المكونة من 6 آبار والتي تحتوي على خليط من ECs والمجموعات غير EC. أضف 1 مل من كاشف التفكك إلى كل بئر.
    2. راقب مورفولوجيا الخلية بعناية تحت المجهر. عندما تظهر ECs (ولكن ليس غير ECs) ساطعة ومستديرة (عادة في غضون 2-5 دقائق) ، افصلها عن طريق النقر على حافة اللوحة. تظل معظم غير ECs متصلة باللوحة.
    3. اجمع ECs المنفصلة باستخدام micropipette ، مع الحرص على تجنب تعليق غير ECs. انقل ECs إلى أنبوب طرد مركزي سعة 15 مل أو 50 مل يحتوي على 4 مل من DMEM / F12-10 لكل 1 مل من كاشف التفكك.
    4. أضف 2 مل من وسط hECSR إلى الآبار التي تحتوي على ما تبقى من غير ECs المرفقة لإنشاء SMLCs. ضع اللوحة في الحاضنة.
    5. ماصة تعليق EC في أنبوب الطرد المركزي لخلط دقيق وحجز 10 ميكرولتر من التعليق لعد الخلايا. أجهزة الطرد المركزي الخلايا المتبقية لمدة 5 دقائق عند 200 × جم عند 20-25 درجة مئوية. قم بإزالة المادة الطافية من الحبيبات وأضف 2 مل من وسط hECSR لكل 1.0-2.0 × 105 ECs.
    6. عند إزالة محلول الكولاجين الوريدي من صفيحة جديدة ذات 6 آبار ، أضف 2 مل من معلق EC إلى كل بئر ، تليها الحضانة عند 37 درجة مئوية مع 5٪ CO2. لتوزيع الخلايا بالتساوي في اللوحة ، حركها برفق ذهابا وإيابا وحركة من جانب إلى جانب على رف الحاضنة.
    7. استبدل وسيط hECSR كل يوم حتى تصل ECs إلى التقاء 100٪.
    8. كرر الخطوات 2.3.1-2.3.7 حتى يتم الحصول على طبقة أحادية EC نقية. إذا تعذر تنفيذ الخطوات التالية ، فقم بتجميد ECs CD31 + (انظر الخطوة 2.4.2). لتحليل وظائف EC، انتقل إلى الخطوة 3.
      ملاحظة: بشكل عام ، هناك حاجة إلى ممرين أو ثلاثة مقاطع انتقائية للحصول على ثقافات نقية تقريبا من ECs مناسبة للتحليلات الوظيفية ، ونحن نعتبر هذه الخلايا خلايا تشبه EECM-BMEC. بعد أكثر من خمسة أو ستة مقاطع ، يتباطأ تكاثر الخلايا عادة ، على الرغم من أن هذا المتغير يعتمد على خط hiPSC.
    9. لاستزراع SMLCs ، استبدل وسيط hECSR كل يوم. لجمع الوسط المكيف SMLC (CM) ، قم بتمرير الوسيط الذي تم جمعه من خلال مرشح 0.22 ميكرومتر عند كل تغيير وسيط. يمكن استخدام CM لتنظيم تعبير VCAM-1 للخلايا الشبيهة ب EECM-BMEC. قم بتجميع SMLC-CM حتى تصل SMLCs إلى التقاء 100٪.
  4. EPC ، خلية شبيهة ب EECM-BMEC ، وحفظ وذوبان SMLC بالتبريد
    1. لتجميد EPCs ، بعد غسل MACS النهائي (الخطوة 1.4.13) ، أعد تعليق EPCs في وسط التجميد بدلا من وسط hECSR بكثافة 1.0-2.0 × 106 خلايا / مل. توزيع 1 مل من تعليق الخلية في أنابيب التبريد. ضع أنابيب التبريد في جهاز تجميد معدل التحكم وانقلها بسرعة إلى -80 درجة مئوية. للتخزين طويل الأجل ، انقل الأنابيب إلى خزان النيتروجين السائل بعد 24 إلى 48 ساعة من التجميد.
    2. لتجميد الخلايا الشبيهة ب EECM-BMEC و SMLCs ، بعد إزالة الوسط من الآبار ، أضف كاشف التفكك (1 مل / بئر) واحتضان اللوحة عند 37 درجة مئوية مع 5٪ CO2 حتى تنفصل الخلايا (5-7 دقائق و 20-30 دقيقة للخلايا الشبيهة ب EECM-BMEC و SMLCs ، على التوالي). اجمع الخلايا في أنبوب طرد مركزي سعة 15 مل أو 50 مل يحتوي على 4 مل من DMEM / F12-10 لكل 1 مل من كاشف التفكك.
    3. ماصة جيدا لخلط وحجز 10 ميكرولتر من تعليق الخلية لعد الخلايا. قم بإذابة الخلايا عن طريق الطرد المركزي عند 200 × جم لمدة 5 دقائق عند 20-25 درجة مئوية. قم بإزالة المادة الطافية وأعد تعليق الخلايا تماما في وسط التجميد إلى كثافة 1.0-2.0 × 106 خلايا / مل. توزيع 1 مل من تعليق الخلية في أنابيب التبريد الطازجة.
    4. ضع أنابيب التبريد في جهاز تجميد معدل التحكم فيه وانقلها على الفور إلى -80 درجة مئوية. للتخزين طويل الأجل ، يمكن نقل الأنابيب إلى خزان النيتروجين السائل بعد 24 إلى 48 ساعة من التجميد.
    5. لإذابة EPCs ، والخلايا الشبيهة ب EECM-BMEC ، و SMLCs ، قم بلف قوارير من أنابيب التبريد بين اليدين أو احتضانها في حمام مائي 37 درجة مئوية حتى يتم إذابة الخلايا بالكامل تقريبا. أضف 500 ميكرولتر من DMEM / F12-10 وانقل تعليق الخلية برفق إلى أنبوب سعة 15 مل يحتوي على 4 مل من وسط DMEM / F12-10. اغسل أنبوب التبريد مرة واحدة بإضافة 1 مل من DMEM / F12-10 ثم قم بطرد الخلايا عند 200 × جم لمدة 5 دقائق عند 20-25 درجة مئوية.
    6. نضح المادة الطافية وإعادة تعليق الحبيبات في 2 مل من وسط hECSR الذي يحتوي على مثبطات 5 ميكرومتر ROCK (1: 2000 تخفيف) إلى كثافة 1.0-2.0 × 10 5 خلايا لكل 2 مل ل EPCs ، و 2.0-3.0 × 105 خلايا لكل 2 مل للخلايا الشبيهة ب EECM-BMEC و SMLCs. قم بتوزيع تعليق الخلية بين آبار ألواح 6 آبار المطلية بالكولاجين بعد شفط محلول الكولاجين.
    7. حرك الألواح برفق ذهابا وإيابا ، ثم من جانب إلى آخر ، على رف الحاضنة عند 37 درجة مئوية ، 5٪ CO2 لتوزيع الخلايا بالتساوي في الآبار.
    8. في اليوم التالي ، استبدل الوسط بوسط hECSR جديد يفتقر إلى مثبطات ROCK. تبادل وسيط hECSR كل يوم حتى يتم تحقيق التقاء 100٪. بعد ذلك ، انتقل إلى التمرير الانتقائي ل EPCs (انظر الخطوة 2.3) والتحليلات الوظيفية للخلايا الشبيهة ب EECM-BMEC (انظر الخطوة 3). قبل إجراء التوصيف الجزيئي والمقايسات الوظيفية ، يجب أن تكون الخلايا الشبيهة ب EECM-BMEC متقاربة بنسبة 100٪ ، والتي تتحقق عادة بعد 2-3 أيام من الذوبان.

3. التحقق من صحة الخلايا الشبيهة ب EECM-BMEC و SMLCs

  1. مقايسة النفاذية لمقتفيات الجزيئات الصغيرة
    1. تقييم سلامة حاجز الخلية الشبيه ب EECM-BMEC عن طريق قياس نفاذية فلوريسئين الصوديوم ، كما وصفها Nishihara et al.26. قم بزرع الخلايا الشبيهة ب EECM-BMEC على إدخالات المرشح لتطوير طبقة أحادية كاملة وقياس نفاذية فلوريسئين الصوديوم.
  2. تلطيخ المناعي لتقييم الجزيئات الرئيسية.
    1. من أجل تلطيخ التألق المناعي لمراقبة التعبير عن الجزيئات الموصلة أو جزيئات الالتصاق أو البروتينات الهيكلية الخلوية للخلايا الشبيهة ب EECM-BMEC في أحادي الطبقات أو SMLCs ، استخدم شرائح الغرفة أو ألواح 96 بئرا أو الأغشية مع مرشحات إدراج. تقييم التعبير الخلوي الشبيه ب EECM-BMEC لجزيئات التصاق سطح الخلية مع أو بدون تحفيز السيتوكين الالتهابي ، كما وصفه Nishihara et al.26.
  3. قياس التدفق الخلوي لتحليل التعبير عن جزيئات التصاق سطح الخلية على الخلايا الشبيهة ب EECM-BMEC
    1. استخدم قياس التدفق الخلوي لتقييم التعبير شبه الكمي لجزيئات التصاق سطح الخلية المشاركة في هجرة الخلايا المناعية إلى الجهاز العصبي المركزي ، بما في ذلك ICAM-1 و ICAM-2 و VCAM-1 و P-selectin و E-selectin و CD99 وجزيء التصاق الخلايا البطانية للصفائح الدموية -1 (PECAM-1) ، كما وصفها Nishihara et al.26. استزرع الخلايا الشبيهة ب EECM-BMEC مع وسط مكيف SMLC في وجود وغياب السيتوكينات الالتهابية لمدة 16-18 ساعة.
  4. مقايسة التصاق الخلايا المناعية في ظل ظروف ثابتة لتقييم التعبير عن جزيئات الالتصاق الوظيفية
    1. استخدم الطريقة التي وصفها Nishihara et al.26 لتحديد ما إذا كانت جزيئات التصاق سطح الخلية للخلايا الشبيهة ب EECM-BMEC وظيفية.
    2. باختصار ، قم بزرع الخلايا الشبيهة ب EECM-BMEC على شريحة حجرة بسرعة 5.5 × 104 / سم2 وتنمو إلى التقاء. بعد حوالي 24 ساعة ، قم بتغيير وسط الاستزراع إلى وسط مكيف SMLC في وجود أو عدم وجود السيتوكينات المؤيدة للالتهابات ، واحتضان الخلايا الشبيهة ب EECM-BMEC لمدة 16 ساعة إضافية.
    3. في يوم التجربة ، قم بإذابة الخلايا المناعية المحفوظة بالتبريد (على سبيل المثال ، الخلايا التائية أو خلايا الدم أحادية النواة المحيطية [PBMCs]) باستخدام مخزن مؤقت لغسل الخلايا التائية (الجدول 1) والملصق بأصباغ الفلورسنت (على سبيل المثال ، أصباغ تعقب الخلايا) في وسط الخلايا التائية (الجدول 1). يجب أن يكون تحسين وسط المزرعة للخلايا المناعية مصمما وفقا لنوع معين من الخلايا المناعية قيد الدراسة.
    4. في شريحة غرفة مكونة من 16 بئرا ، أضف 2 × 104 خلايا Th1 إلى الخلايا الشبيهة ب EECM-BMEC. على وجه التحديد ، عند العمل مع الخلايا التائية المستجيبة مثل خلايا Th1 ، لوحظ أنها تظهر ارتباطا أكبر بالخلايا الشبيهة ب EECM-BMEC مقارنة ب PBMCs (Nishihara. et al. [2022]). وبالتالي ، يجب أن يكون عدد PBMCs المراد إضافتها إلى الخلايا الشبيهة ب EECM-BMEC أعلى مقارنة بالخلايا التائية المستجيبة النقية.
    5. احتضان الخلايا المناعية بطبقة أحادية من الخلايا الشبيهة ب EECM-BMEC لمدة 30 دقيقة في وسط مقايسة الهجرة (الجدول 1). بعد 30 دقيقة ، اغسل الشريحة برفق ، مرتين عن طريق غمرها في برطمان يحتوي على PBS من Dulbecco ثم ثبته بمحلول جلوتارالدهيد 2.5٪ عند 4 درجات مئوية لمدة ساعتين.
    6. بعد التثبيت ، اغسل الشريحة مرتين عن طريق غمرها في جرة تحتوي على PBS من Dulbecco وقم بتركيبها باستخدام غطاء غطاء. احصل لاحقا على صور مجهرية مضان لمركز الطبقة الأحادية على الشرائح لحساب الخلايا المناعية المرتبطة بطبقة أحادية الخلية الشبيهة ب EECM-BMEC.

النتائج

مقايسة النفاذية
تم حساب نفاذية فلوريسئين الصوديوم عن طريق قياس شدة مضان الوسط الذي تم جمعه من الغرفة السفلية في 15 و 30 و 45 و 60 دقيقة. يتم أخذ عينات من ما مجموعه 150 ميكرولتر من الوسط في كل نقطة زمنية ويتم استبدال الحجم المفقود البالغ 150 ميكرولتر بوسط hECSR. تتم قراءة شدة التألق باستخدام قارئ لوحة الفلورسنت (إثارة 485 نانومتر / انبعاث 530 نانومتر) ويتم حساب الإشارات الصحيحة وأحجام الخلوص والنفاذية باستخدام الصيغةالموصوفة سابقا 18 (الجدول 2). يوصى بتأكيد ما إذا كانت شدة مضان فلوريسئين الصوديوم تزداد بمرور الوقت. يجب استخدام مرشحات متعددة - على الأقل ثلاث نسخ - لفحص واحد لضمان قابلية التكاثر. بالنسبة للخلايا الشبيهة ب EECM-BMEC المشتقة من التحكم الصحي ، يجب أن تكون نفاذية فلوريسئين الصوديوم (376 دا) أقل من 0.3 × 10-3 سم / دقيقة. لتأكيد تكوين طبقة أحادية الخلية تشبه EECM-BMEC ، يجب إجراء تلطيخ التألق المناعي للبروتينات الموصلة للخلايا الشبيهة ب EECM-BMEC لكل مرشح مستخدم في فحوصات النفاذية بعد هذا الفحص.

تلطيخ المناعي
تم استخدام تلطيخ التألق المناعي لجزيئات تقاطع الخلايا الشبيهة ب EECM-BMEC ، بما في ذلك claudin-5 و occludin و VE-cadherin1 ، لتقييم مورفولوجيا الخلية ووجود تقاطعات مستمرة وناضجة (الشكل 4). تم تثبيت الطبقات الأحادية للخلايا الشبيهة ب EECM-BMEC على أغشية إدخالات المرشح بالميثانول البارد (-20 درجة مئوية) لمدة 20 ثانية ، وتم حظرها بحاجز مانع (الجدول 1) ، ثم حضنت بأجسام مضادة أولية وثانوية. أظهرت الخلايا الشبيهة ب EECM-BMEC أشكالا تشبه المغزل وتقاطعات متعرجة الشكل ، وكلاهما من السمات المورفولوجية المميزة ل BMECs27. تحفيز الخلايا الشبيهة ب EECM-BMEC المصنفة على شرائح الغرفة مع السيتوكينات المؤيدة للالتهابات ، مثل عامل نخر الورم α (TNF-α) والإنترفيرون γ (INF-γ) (0.1 نانوغرام / مل TNF-α + 2 وحدة دولية / مل IFN- γ) المخفف في وسط مكيف مشتق من SMLC ، ينظم التعبير عن جزيئات الالتصاق ، مثل ICAM-1 و VCAM-128 (الشكل 5). يوضح الشكل 6 صورا تمثيلية لعلامات الخلايا العضلية الملساء، بما في ذلك أكتين العضلات الملساء (SMA) α) والكالبونين، وبروتين العضلات الملساء 22-ألفا (SM22a)29. تم تثبيت SMLCs المصنفة على شريحة الغرفة بنسبة 4٪ بارافورمالدهيد لمدة 10 دقائق ، وتم حظرها بحاجز مانع ، ثم حضنتها بأجسام مضادة أولية وثانوية.

تحليل التدفق الخلوي لتعبير جزيء التصاق سطح الخلية بواسطة الخلايا الشبيهة ب EECM-BMEC
النتائج التمثيلية لتعبير سطح الخلية لجزيئات الالتصاق البطانية على الخلايا الشبيهة ب EECM-BMEC موضحة في الشكل 7. أدى التحفيز باستخدام السيتوكينات المؤيدة للالتهابات ، مثل TNF-α و INF-γ ، إلى تنظيم تعبير سطح الخلية للعديد من جزيئات الالتصاق ، بما في ذلك ICAM-1 و VCAM-1 و P-selectin. زراعة خلايا شبيهة ب EECM-BMEC مع تعبير سطح خلية VCAM-1 البطاني المكيف SMLC. قد يختلف تأثير تحريض تعبير سطح الخلية VCAM-1 بين دفعات الوسط المكيف SMLC. يوصى بتخزين عدة دفعات من الوسط المكيف الذي يتم حصاده من SMLCs ، المشتقة من نفس مصدر hiPSC ، عند التمييز بين SMLCs ، من أجل التحقق من الدفعة التي تحفز التعبير المناسب ل VCAM-1.

مقايسة التصاق الخلايا المناعية في ظل ظروف ثابتة
يرتبط عدد الخلايا المناعية المرتبطة بمستوى التعبير عن جزيئات الالتصاق الوظيفية على سطح الخلايا الشبيهة ب EECM-BMEC. أدى التحفيز باستخدام السيتوكينات الالتهابية إلى تنظيم التعبير عن جزيئات الالتصاق البطانية وتعزيز زيادة عدد الخلايا المناعية التي التصقت بطبقات الخلايا الأحادية الشبيهة ب EECM-BMEC (الشكل 8). أظهرت التجربة الحالية وظيفة جزيئات الالتصاق على الخلايا الشبيهة ب EECM-BMEC ، مما يجعل هذا النموذج مناسبا لدراسة تفاعلات الخلايا المناعية و EC.

figure-results-3813
الشكل 2: تنقية CD31+ ECs. مخططات نقطية لبيانات قياس التدفق الخلوي التمثيلية من بوابات التشتت ل ECs وتلطيخ CD31 المسمى FITC لمجموعات الخلايا قبل (الخطوة 1.4.7) وبعد (الخطوة 1.4.14) MACS. يعمل MACS على تحسين نقاء CD31 + EPCs في السكان. الاختصارات: SSC = مبعثر جانبي ؛ FSC = مبعثر أمامي ؛ FITC = فلوريسئين إيزوثيوسيانات ؛ MACS = فرز الخلايا المنشطة المغناطيسية. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-4535
الشكل 3: نفاذية EECM-BMEC أحادية الطبقة (10-3 سم / دقيقة) محسوبة من شدة التألق الخام لفلوريسئين الصوديوم. يتم حساب الميل الخطي لحجم الخلوص باستخدام الانحدار الخطي لكل مرشح (الشكل 3 أ). يتم حساب نفاذية فلوريسئين الصوديوم باستخدام صيغتين (الشكل 3B). (أ) تم حساب الميل الخطي لحجم الخلوص مقابل الوقت باستخدام الانحدار الخطي للمرشح 1 (mc1) والمرشح الفارغ (mf). m c1 و m f هما معاملان ل Xc1 و Xf ، على التوالي. (ب) صيغة لحساب نفاذية الفلوريسئين (Pe) باستخدام mc و mf (الصيغة 1). تم تحويل وحدات Pe باستخدام مساحة سطح المرشح (الفورمولا 2). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-5635
الشكل 4: تعرض الخلايا الشبيهة بEECM-BMEC تقاطعات خلوية ناضجة. تلطيخ التألق المناعي للكلاودين -5 أو الإطباق أو VE-cadherin (الأحمر) في الخلايا الشبيهة ب EECM-BMEC المزروعة على أغشية مرشحات الإدراج. تم تلطيخ النوى باستخدام 4 ′،6-دياميدينو -2-فينيليندول (DAPI) (أزرق). تم إجراء التلوين على نفس إدخالات المرشح المستخدمة في مقايسات النفاذية. شريط المقياس = 50 ميكرومتر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

figure-results-6341
الشكل 5: التعبير عن جزيئات التلاصق البطانية بواسطة خلايا شبيهة ب EECM-BMEC. تم إجراء تلطيخ التألق المناعي على الخلايا الشبيهة ب EECM-BMEC المزروعة على أغشية إدراج المرشح في وجود CM المشتق من SMLC. يظهر التلوين المناعي ل ICAM-1 أو VCAM-1 (أحمر) للخلايا غير المحفزة و 1 نانوغرام / مل TNF-α + 20 وحدة دولية / مل IFN- γ الخلايا الشبيهة ب EECM-BMEC. كانت النوى ملطخة ب DAPI (أزرق). شريط المقياس = 50 ميكرومتر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

figure-results-7087
الشكل 6: توصيف SMLCs. يتم عرض الكيمياء المناعية للأكتين العضلي α الملساء (SMA) أو الكالبونين أو بروتين العضلات الملساء 22-Alpha (SM22a) (أحمر) ل SMLCs المزروعة على شرائح الغرفة. كانت النوى ملطخة ب DAPI (أزرق). شريط المقياس = 50 ميكرومتر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

figure-results-7666
الشكل 7: تعبير سطح الخلية البطانية لجزيئات التلاصق على الخلايا الشبيهة ب EECM-BMEC. تظهر نتائج تحليل قياس التدفق الخلوي لتعبير جزيء التصاق سطح EC على الخلايا الشبيهة ب EECM-BMEC. تم استزراع الخلايا الشبيهة ب EECM-BMEC باستخدام وسط مشروط مشتق من SMLC. تظهر الخطوط الزرقاء والحمراء والرمادية لتراكبات الرسم البياني الحالة غير المحفزة (NS) ، 1 نانوغرام / مل TNF-α + 20 وحدة دولية / مل حالة تحفيز IFN-γ ، والتحكم في النمط المتماثل ، على التوالي. تم تقييم تعبير سطح الخلية لجزيئات الالتصاق البطانية ، بما في ذلك جزيء الالتصاق بين الخلايا 1 (ICAM-1) ، ICAM-2 ، جزيء التصاق الخلايا الوعائية 1 (VCAM-1) ، P-selectin ، E-selectin ، CD99 ، وجزيء التصاق الخلايا البطانية للصفائح الدموية -1 (PECAM-1). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-8697
الشكل 8: التصاق الخلايا المناعية على الخلايا الشبيهة ب EECM-BMEC. (أ) صور الخلايا المناعية الملتصقة الموسومة بالفلورسنت على الخلايا أحادية الطبقة الشبيهة ب EECM-BMEC غير المحفزة (NS) و 0.1 نانوغرام/مل TNF-α + 2 وحدة دولية/مل محفز ب IFN-γ (TNF-α + IFN-γ) أحادية الطبقة الشبيهة بالخلايا الشبيهة ب EECM-BMEC. تتوافق الصور مع مراكز الآبار. شريط المقياس = 50 ميكرومتر. (ب) عدد الخلايا المناعية الموسومة بالفلورسنت على الطبقات الأحادية من الخلايا الشبيهة ب NS و TNF-α + IFN-γ المحفزة EECM-BMEC. تم عد الخلايا المناعية الملتصقة / مجالات الرؤية (FOVs) تلقائيا باستخدام برنامج FIJI. تمثل النقاط عدد الخلايا التائية المرفقة. تظهر الأشرطة القيمة المتوسطة، وتظهر أشرطة الخطأ الانحراف المعياري (SD) لثماني محاكمات. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الجدول 1: تفاصيل الكواشف المحددة للمقايسات. يتم وصف الاسم والكمية الدقيقة للمكونات لكل كاشف محدد. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الجدول.

الجدول 2: مثال على البيانات الأولية لقارئ لوحة التألق لحساب Pe. الأرقام في النوع الغامق هي شدة التألق الخام لفلوريسئين الصوديوم التي يقيسها قارئ اللوحة. من أجل تحليل البيانات بدقة ، من الضروري إزالة إشارة الخلفية من القيم الأولية وحساب أي فقدان للإشارة ناتج عن أخذ عينات من الغرفة السفلية ، ثم تصحيح الإشارة لاحقا. على سبيل المثال ، بعد طرح الخلفية ، تعرض العينة التي تبلغ مدتها 15 دقيقة إشارة من 100 وحدة مضان نسبية (RFU) ، وتعرض العينة التي تبلغ مدتها 30 دقيقة إشارة تبلغ 150 RFU. الإشارة المصححة عند 30 دقيقة هي (150 RFU + القيم المفقودة عند 15 دقيقة [100 RFU × 150 μL / 1,500 μL]) ، وهي 150 RFU + 10 RFU = 160 RFU. حجم الخلوص = (1500 × [S B، t]) / (S T، 60 دقيقة)، حيث 1500 هو حجم الغرفة السفلية (1500 ميكرولتر)، S B، t هي الإشارة المصححة في الوقتt، و S T، 60 دقيقة هي إشارة الغرفة العلوية عند60 دقيقة. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الجدول.

Discussion

النقاط الحرجة واستكشاف الأخطاء وإصلاحها
قبل البدء في تمايز EPC ، يجب على الباحثين التأكد من عدم حدوث أحداث تمايز الخلايا التلقائية في ثقافات hiPSC. يعد عدم وجود خلايا متمايزة تلقائيا واستخدام مستعمرات hiPSC النقية أمرا بالغ الأهمية للحصول على نتائج قابلة للتكرار. تعد كثافة البذر hiPSC في اليوم -3 مهمة للحصول على درجة نقاء عالية من CD31 + EPCs بعد MACS. قد تتطلب كثافة البذر لكل خط hiPSC وكل ممر التحسين. اعتمادا على خط hiPSC ورقم المرور ، يمكن أن تتراوح كثافة البذر بين 75 × 10 3 إلى 400 × 10 3 hiPSCs لكل بئر من صفيحة 12 بئرا (20-100 × 103 / سم2). نقطة تفتيش الكثافة الدنيا ل hiPSCs هي كثافة الخلية في اليوم 2. يجب أن تصل hiPSCs إلى التقاء 100٪ بحلول اليوم 2 على أبعد تقدير. إذا لم تكن hiPSCs متقاربة بحلول اليوم 2 ، فإن نقاء CD31 + EPCs بعد MACS عادة ما يكون منخفضا جدا. في هذه الحالة ، يمكن زيادة كثافة البذر hiPSC. إذا انفصلت أعداد كبيرة من الخلايا المتمايزة عن اللوحة في حوالي اليوم 3 إلى اليوم 5 ، فيمكن تقليل كثافة البذر الأولية hiPSC. 7-8 ميكرومتر CHIR99021 في تجربتنا هو التركيز الأمثل لخطوط hiPSCs المستخدمة هنا ، ولكن قد يلزم تحسين التركيز لخطوط hiPSC الأخرى التي قد تستجيب بشكل مختلف للعلاج المثبط. يجب تأكيد نقاء CD31 + EPCs قبل وبعد MACS. قبل متابعة MACS ، يجب أن يكون خليط الخلايا الذي تم فرزه مسبقا >10٪ خلايا CD31 +. عادة ما تؤدي النسب المئوية لخلايا CD31 + البالغة <6٪ إلى EPCs بنسبة <80٪ بعد MACS. هناك حاجة إلى تحسين كثافة البذر الأولية و / أو تركيز CHIR99021 في هذه الحالة.

من أجل النجاح في المرور الانتقائي وتوليد طبقات أحادية EC نقية ، يعد نقاء CD31 + EPCs بعد MACS أمرا بالغ الأهمية. إذا كانت درجة النقاء بعد MACS <90٪ ، يوصى بغسلة أو غسلتين إضافيتين (الخطوات 1.4.11-1.4.12). من الناحية المثالية ، يجب أن تكون نقاء ما بعد MACS >95٪. يجب تحسين كثافة البذر EPC على الألواح المطلية بالكولاجين وفقا لخط hiPSC لتحقيق التقاء 100٪ في غضون 3-7 أيام. عادة ما يؤدي الانتظار حتى تتلاقى ECs بنسبة 100٪ إلى مرور انتقائي ناجح. ومع ذلك ، حتى بالنسبة ل ECs المتقاربة بنسبة 100٪ ، فإن بعض SMLCs الخاصة بخطوط hiPSC تنفصل أيضا مبكرا. في هذه الحالة ، قد يكون المرور الانتقائي عند التقاء أقل (على سبيل المثال ، ≤80٪) فعالا. إذا انفصلت بعض SMLCs في وقت أبكر من ECs ، فغالبا ما لا يمكن إنقاذ ECs من مجموعة EC-SMLC المختلطة. في هذه الحالة ، قد يكون من المفيد تقصير وقت التنشيط لكاشف التفكك في تمرير ECs والمرور الانتقائي المتكرر. يعد استخدام كاشف التفكك التجاري بدلا من التربسين ككاشف تفكك مفيدا للتمرير الانتقائي ، حيث لا يسمح التربسين بالانفصال المنفصل لل ECs و SMLCs. تشير مقايسات النفاذية لدينا باستخدام متتبعات الجزيئات الصغيرة واختبار مستويات التعبير عن جزيء التقاطع والالتصاق الضيق إلى أنه يمكن تخزين EPCs والخلايا الشبيهة ب EECM-BMEC و SMLCs في النيتروجين السائل لمدة 2 سنوات على الأقل.

أهمية وحدود الطريقة
تميز الطريقة CD31 + EPCs عن hiPSCs من خلال استخدام مثبطات GSK-3 الكيميائية لتنشيط إشارات Wnt / β-catenin. بعد الاختيار الإيجابي ل CD31 + EPCs بواسطة MACS ، يتم استزراع EPCs في وسط بطاني محدد يعزز التمايز إلى مجموعات بطانية مختلطة و SMLC. يسمح المرور الانتقائي لهذه المجموعات المختلطة ذات الخصائص اللاصقة المختلفة بفصل ECs عن SMLCs. بعد مرور واحد أو اثنين ، تظهر الخلايا الشبيهة ب EECM-BMEC خصائص حاجز وتعبير عن جزيئات الالتصاق البطانية التي تلخص تلك الخاصة ب BMECs البشرية الأولية. تؤدي الثقافة المشتركة مع SMLCs أو المواد الطافية الخاصة بها إلى التعبير الناجم عن السيتوكين ل VCAM-1.

في الجسم الحي ، يحافظ BBB على توازن الجهاز العصبي المركزي من خلال إنشاء نفاذية منخفضة للجزيئات شبه الخلوية وعبر الخلايا ، من خلال نقل العناصر الغذائية عبر ناقلات محددة والتحكم في الاتجار بالخلايا المناعية في الجهاز العصبي المركزي. بالنسبة لدراسات BBB ، من الضروري وجود نموذج مناسب يعرض الجزيئات والوظائف ذات الأهمية المعنية. يوفر إنتاج الخلايا الشبيهة ب EECM-BMEC باستخدام كواشف وعينات محددة من المرضى أو الأشخاص الأصحاء نموذج BBB بشري قابل للتطوير. مزايا النموذج الذي يستخدم خلايا شبيهة ب EECM-BMEC على نماذج BBB الأخرى هي: 1) مورفولوجيا وملف تعريف النسخ البطاني30 الذي يشبه نموذج BMECs البشري الأساسي. 2) وجود تقاطعات ضيقة ناضجة ؛ 3) خصائص الحاجز المرغوب فيها ؛ و 4) التعبير القوي لجزيئات التصاق البطانية ، بما في ذلك ICAM-1 و ICAM-2 و VCAM-1 و E- و P-selectin و CD99 وجزيء التصاق خلايا سرطان الجلد (MCAM) وجزيء التصاق خلايا الكريات البيض المنشط (ALCAM) 22. وبالتالي ، فإن هذا النموذج مفيد بشكل خاص لدراسة التفاعلات بين الخلايا المناعية و BMECs. على الرغم من أن نفاذية متتبعات الجزيئات الصغيرة أعلى بالنسبة للخلايا الشبيهة ب EECM-BMEC من تلك التي تم الإبلاغ عنها سابقا للخلايا الشبيهة ب BMEC المشتقة من iPSC14,15 ، إلا أن خصائص الحاجز تقارن جيدا بتلك الموصوفة ل BMECs البشرية الأولية. يشير هذا التشابه إلى أن الخلايا الشبيهة ب EECM-BMEC من المحتمل أن تكون نموذجا جيدا في المختبر ل BBB. يجب أن يؤخذ تعبير E-selectin على الخلايا الشبيهة ب EECM-BMEC في ظل الظروف الفسيولوجية في الاعتبار عند استخدام هذا النموذج لدراسة BBBs غير الملتهبة التي تفتقر إلى تعبير E-selectin التأسيسي في الجسم الحي31. في دراستنا السابقة ، أثبتنا أن الخلايا الشبيهة ب EECM-BMEC يمكن أن تنسخ BBB ، كما لوحظ في أدمغة مرضى التصلب العصبي المتعدد فيما يتعلق بالوصلات الضيقة المعطلة. ينتج عن هذا نفاذية أعلى للجزيئات الصغيرة وزيادة التعبير عن جزيء الالتصاق الوظيفي ، مما يتوسط في زيادة الالتصاق وانتقال الخلايا المناعية عبر الخلايا الشبيهة ب BMEC32. علاوة على ذلك ، أظهرنا أن تنشيط إشارات Wnt / β-catenin يمكن أن يخفف من اضطراب التقاطعات الضيقة وزيادة تعبير VCAM-1 في الخلايا الشبيهة ب EECM-BMEC المشتقة منMS 32. تشير هذه النتائج إلى أن النموذج مفيد بالفعل لدراسة دور BBB في أمراض المناعة العصبية ، مثل مرض التصلب العصبي المتعدد.

مجتمعة ، تعد الخلايا الشبيهة ب EECM-BMEC أداة واعدة لفهم متعمق للآليات الفيزيولوجية المرضية على مستوى BBB وكأداة لتطوير أهداف علاجية جديدة لتثبيت BBB. في المستقبل ، يمكن تطبيق النموذج لدراسة خلل BBB في مجموعة واسعة من الأمراض ويمكن أن يفتح سبلا لنهج علاجية جديدة.

Disclosures

تلقت BE منحة من Biogen لدراسة الجرعات الممتدة من Natalizumab على هجرة الخلايا التائية عبر الحاجز الدموي الدماغي ومنحة من CSL Behring للتحقيق في الأسس الجزيئية لخلل الحاجز الدموي الدماغي في الاضطرابات العصبية. HN و BE هما مخترعا طلبات براءات الاختراع الأمريكية المؤقتة المتعلقة بالخلايا الشبيهة ب EECM-BMEC (63/084980 و 63/185815).

Acknowledgements

تم دعم HN من قبل مؤسسة Uehara Memorial Foundation ، وهي زمالة تبادل أبحاث ما بعد الدكتوراه ECTRIMS ، JSPS في إطار برنامج البحث المشترك الذي تم تنفيذه بالاشتراك مع SNSF (JRPs) رقم المنحة JPJSJRP20221507 و KAKENHI Grant رقم 22K15711 ، برنامج JST FOREST (رقم المنحة JPMJFR2269 ، اليابان) ، مؤسسة YOKOYAMA لعلم الصيدلة السريرية رقم المنحة YRY-2217 ، مؤسسة إيشيرو كانهارا ، مؤسسة ناريشيج لأبحاث علم الأعصاب ، مؤسسة نوفارتيس (اليابان) لتعزيز العلوم ، وصندوق جامعة ياماغوتشي. تم دعم BE من قبل الجمعية السويسرية للتصلب المتعدد والمؤسسة الوطنية السويسرية للعلوم (المنح 310030_189080 و ZLJZ3_214086) ومنحة البرنامج الاستراتيجي الياباني السويسري للعلوم والتكنولوجيا (SJSSTP) IZLJZ3_214086.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
0.22 mm Syringe filterTPP99722
15 mL Centrifuge tubeFalcon352196
40 μm Falcon cell strainerFalcon352340
5 mL Round-bottom tubeSPL40005
50 mL Centrifuge tubeFalcon352070
96-Well plate, round bottomSPL34096
AccutaseSigma-AldrichA6964-500ml
Acetic acidSigma-Aldrich695092
Advanced DMEM/F12Life Technologies12634
All-in-One Fluorescence MicroscopeKeyenceBZ-X810
B-27 Supplement (503), serum freeThermo Fischer Scientific17504044
Bovine serum albumin (BSA), 7.5% in dPBSSigma-AldrichA8412
CellAdhere Dilution BufferSTEMCELL TechnologiesST-07183
CellTracker Green CMFDA DyeInvitrogenC7025
Chamber slidesThermo Fischer Scientific178599
CHIR99021Selleck ChemicalsS1263
Collagen IV from human placentaSigma-AldrichC5533
Corning tissue culture plates (12-well)Corning3512
Corning tissue culture plates (6-well)Corning3506
Cryo tube innercap 2.0 mLWatson1396-201S
Dimethylsulfoxide (DMSO), sterileSigma-AldrichD2650
DMEM (13), [+] 4.5 g/L D-glucose, [-] L-glutamine, [-] pyruvateThermo Fischer Scientific31053-028
Dulbecco’s (d) PBS (without calcium, magnesium)Thermo Fisher14190250
Dulbecco’s modified Eagle’s medium/nutrient mixture F-12 (DMEM-F12)Thermo Fischer Scientific11320074
EasySepFITC Positive Selection Kit IISTEMCELL Technologies18558
EasySepMagnetStemcell Technologies18000
Ethylenediaminetetraacetic Acid Solution0.02% in DPBSSigmaE8008-100ML
Fetal Bovine Serum, qualifiedThermo Fischer Scientific10270106
Fibronectin from bovine plasmaSigma-AldrichF1141
Ficoll-Paque PLUSSigma-AldrichGE17144002
FIJI software (Version 2.0.0)Image J, USA
FlowJo version10BD
Fluorescein sodium saltSigma-AldrichF6377
GlutaMAX SupplementThermo Fischer Scientific35050-061
Glutaraldehyde solutionSigma-AldrichG6257
HCLSigma-AldrichH1758
HEPES buffer solutionThermo Fischer Scientific15630-056
Human Endothelial Serum Free Medium (hESFM)Thermo Fischer Scientific11111-044
Human fibroblast growth factor 2 (FGF2)Tocris233-FB-500
iPS human induced pluripotent stem cellsRiken RBCHPS1006
Kanamycin Sulfate (100x)Thermo Fischer Scientific15160-047
L-Ascorbic acid 2-phosphate sesquimagnesium salt hydrateSigma-AldrichA8960-5G
L-Glutamine 200 mM (1003)Thermo Fischer Scientific25030-024
Matrigel, growth factor reducedCorning354230
MEM NEAA (1003)Thermo Fischer Scientific11140-035
MethanolSigma-Aldrich32213
MowiolSigma-Aldrich81381
mTeSR Plus-cGMPSTEMCELL TechnologiesST-100-0276
mTeSR1 complete kit (basal medium plus 53 supplement)STEMCELL Technologies85850
NaClSigma-Aldrich71376
ParaformaldehydeMillipore104005
Pen StrepThermo Fischer Scientific15140-122
Recombinant Human IFN-gamma ProteinR&D Systems285-IF-100
Recombinant Human IL-2BD Biosciences554603
Recombinant Human TNF-alpha ProteinR&D Systems210-TA-020
ROCK inhibitor Y-27632Tocris1254
RPMI medium 1640Thermo Fischer Scientific21875-034
ScalpelFEATHER2975-11
Skim milkBD Biosciences232100
Sodium azide (NaN3)Sigma-Aldrich71290
Sodium pyruvateThermo Fischer Scientific11360-039
Transwells, PC Membrane, 0.4 mm, 12 mm, TC-TreatedCorning3401
Tris baseSigma-Aldrich93362
Triton X-100Sigma-AldrichX100
Vitronectin XFSTEMCELL Technologies078180
Water, sterile, cell cultureSigma-AldrichW3500

References

  1. Castro Dias, M., Mapunda, J. A., Vladymyrov, M., Engelhardt, B. Structure and junctional complexes of endothelial, epithelial and glial brain barriers. International Journal of Molecular Sciences. 20 (21), 5372 (2019).
  2. Engelhardt, B., Sorokin, L. The blood-brain and the blood-cerebrospinal fluid barriers: function and dysfunction. Seminars in Immunopathology. 31 (4), 497-511 (2009).
  3. Marchetti, L., Engelhardt, B. Immune cell trafficking across the blood-brain barrier in the absence and presence of neuroinflammation. Vascular Biology. 2 (1), H1-H18 (2020).
  4. Yang, C., Hawkins, K. E., Dore, S., Candelario-Jalil, E. Neuroinflammatory mechanisms of blood-brain barrier damage in ischemic stroke. American Journal of Physiology. Cell Physiology. 316 (2), C135-C153 (2019).
  5. Nishihara, H., Engelhardt, B. Brain barriers and multiple sclerosis: novel treatment approaches from a brain barriers perspective. Handbook of Experimental Pharmacology. 273, 295-329 (2020).
  6. Pan, Y., Nicolazzo, J. A. Altered blood-brain barrier and blood-spinal cord barrier dynamics in amyotrophic lateral sclerosis: Impact on medication efficacy and safety. British Journal of Pharmacology. 179 (11), 2577-2588 (2022).
  7. Sweeney, M. D., Sagare, A. P., Zlokovic, B. V. Blood-brain barrier breakdown in Alzheimer disease and other neurodegenerative disorders. Nature Reviews Neurology. 14 (3), 133-150 (2018).
  8. Desai, B. S., Monahan, A. J., Carvey, P. M., Hendey, B. Blood-brain barrier pathology in Alzheimer's and Parkinson's disease: implications for drug therapy. Cell Transplantation. 16 (3), 285-299 (2007).
  9. Song, H. W., et al. Transcriptomic comparison of human and mouse brain microvessels. Scientific Reports. 10 (1), 12358 (2020).
  10. Lecuyer, M. A., et al. Dual role of ALCAM in neuroinflammation and blood-brain barrier homeostasis. Proceedings of the National Academy of Sciences. 114 (4), E524-E533 (2017).
  11. Weksler, B. B., et al. Blood-brain barrier-specific properties of a human adult brain endothelial cell line. The FASEB Journal. 19 (13), 1872-1874 (2005).
  12. DeStefano, J. G., Jamieson, J. J., Linville, R. M., Searson, P. C. Benchmarking in vitro tissue-engineered blood-brain barrier models. Fluids and Barriers of the CNS. 15 (1), 32 (2018).
  13. Lyck, R., et al. ALCAM (CD166) is involved in extravasation of monocytes rather than T cells across the blood-brain barrier. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 37 (8), 2894-2909 (2017).
  14. Lippmann, E. S., et al. Derivation of blood-brain barrier endothelial cells from human pluripotent stem cells. Nature Biotechnology. 30 (8), 783-791 (2012).
  15. Qian, T., et al. Directed differentiation of human pluripotent stem cells to blood-brain barrier endothelial cells. Science Advances. 3 (11), e1701679 (2017).
  16. Cecchelli, R., et al. A stable and reproducible human blood-brain barrier model derived from hematopoietic stem cells. PLoS One. 9 (6), e99733 (2014).
  17. Hollmann, E. K., et al. Accelerated differentiation of human induced pluripotent stem cells to blood-brain barrier endothelial cells. Fluids and Barriers of the CNS. 14 (1), 9 (2017).
  18. Stebbins, M. J., et al. Differentiation and characterization of human pluripotent stem cell-derived brain microvascular endothelial cells. Methods. 101, 93-102 (2016).
  19. Praca, C., et al. Derivation of brain capillary-like endothelial cells from human pluripotent stem cell-derived endothelial progenitor cells. Stem Cell Reports. 13 (4), 599-611 (2019).
  20. Al-Ahmad, A. J. Comparative study of expression and activity of glucose transporters between stem cell-derived brain microvascular endothelial cells and hCMEC/D3 cells. American Journal of Physiology. Cell Physiology. 313 (4), C421-C429 (2017).
  21. Canfield, S. G., et al. An isogenic neurovascular unit model comprised of human induced pluripotent stem cell-derived brain microvascular endothelial cells, pericytes, astrocytes, and neurons. Fluids and Barriers of the CNS. 16 (1), 25 (2019).
  22. Nishihara, H., et al. Advancing human induced pluripotent stem cell-derived blood-brain barrier models for studying immune cell interactions. The FASEB Journal. 34 (12), 16693-16715 (2020).
  23. Lu, T. M., et al. Pluripotent stem cell-derived epithelium misidentified as brain microvascular endothelium requires ETS factors to acquire vascular fate. Proceedings of the National Academy of Sciences. 118 (8), e2016950118 (2021).
  24. Lian, X., et al. Efficient differentiation of human pluripotent stem cells to endothelial progenitors via small-molecule activation of WNT signaling. Stem Cell Reports. 3 (5), 804-816 (2014).
  25. Aisenbrey, E. A., Murphy, W. L. Synthetic alternatives to Matrigel. Nature Reviews Materials. 5 (7), 539-551 (2020).
  26. Nishihara, H., et al. Differentiation of human pluripotent stem cells to brain microvascular endothelial cell-like cells suitable to study immune cell interactions. STAR Protocols. 2 (2), 100563 (2021).
  27. Calabria, A. R., Weidenfeller, C., Jones, A. R., de Vries, H. E., Shusta, E. V. Puromycin-purified rat brain microvascular endothelial cell cultures exhibit improved barrier properties in response to glucocorticoid induction. Journal of Neurochemistry. 97 (4), 922-933 (2006).
  28. Engelhardt, B., Capture Ransohoff, R. M. crawl, cross: the T cell code to breach the blood-brain barriers. Trends in Immunology. 33 (12), 579-589 (2012).
  29. Duband, J. L., Gimona, M., Scatena, M., Sartore, S., Small, J. V. Calponin and SM 22 as differentiation markers of smooth muscle: spatiotemporal distribution during avian embryonic development. Differentiation. 55 (1), 1-11 (1993).
  30. Gastfriend, B. D., et al. Wnt signaling mediates acquisition of blood-brain barrier properties in naïve endothelium derived from human pluripotent stem cells. eLife. 10, e70992 (2021).
  31. Eppihimer, M. J., Wolitzky, B., Anderson, D. C., Labow, M. A., Granger, D. N. Heterogeneity of expression of E- and P-selectins in vivo. Circulation Research. 79 (3), 560-569 (1996).
  32. Nishihara, H., et al. Intrinsic blood-brain barrier dysfunction contributes to multiple sclerosis pathogenesis. Brain. 145 (12), 4334-4348 (2022).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

JoVE 195

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved