Differenziazione delle cellule staminali pluripotenti indotte umane in cellule simili a cellule microvascolari simili a cellule endoteliali microvascolari del cervello con un fenotipo immunitario maturo

Riepilogo

Qui, descriviamo un protocollo, il metodo di coltura cellulare endoteliale estesa (EECM), che consente la differenziazione delle cellule staminali pluripotenti in cellule simili alle cellule endoteliali microvascolari del cervello (BMEC). Queste cellule mostrano l'espressione della molecola di adesione delle cellule endoteliali e sono quindi un modello di barriera emato-encefalica umana adatto a studiare le interazioni delle cellule immunitarie in vitro.

Abstract

La disfunzione della barriera emato-encefalica (BBB) è un segno patologico distintivo di molte malattie neurodegenerative e neuroinfiammatorie che colpiscono il sistema nervoso centrale (SNC). A causa del limitato accesso ai campioni di BBB correlati alla malattia, non è ancora ben compreso se il malfunzionamento della BEE sia causale dello sviluppo della malattia o piuttosto una conseguenza del processo neuroinfiammatorio o neurodegenerativo. Le cellule staminali pluripotenti indotte umane (hiPSC) offrono quindi una nuova opportunità per stabilire modelli di BBB in vitro da donatori e pazienti sani, e quindi per studiare le caratteristiche della BEE specifiche della malattia da singoli pazienti. Sono stati stabiliti diversi protocolli di differenziazione per derivare cellule simili alle cellule endoteliali microvascolari cerebrali (BMEC) da hiPSC. La considerazione della specifica domanda di ricerca è obbligatoria per la corretta scelta del rispettivo protocollo di differenziazione BMEC. Qui, descriviamo il metodo di coltura cellulare endoteliale estesa (EECM), che è ottimizzato per differenziare le hiPSC in cellule BMEC-simili con un fenotipo immunitario maturo, consentendo lo studio delle interazioni cellula immunitaria-BBB. In questo protocollo, le hiPSCs vengono prima differenziate in cellule progenitrici endoteliali (EPCs) attivando la segnalazione Wnt/β-catenina. La coltura risultante, che contiene cellule simili a muscoli lisci (SMLC), viene quindi fatta passare sequenzialmente per aumentare la purezza delle cellule endoteliali (ECs) e indurre proprietà specifiche della BBB. La co-coltura di EECM-BMECs con questi SMLC o terreno condizionato da SMLC consente l'espressione riproducibile, costitutiva e regolata da citochine di molecole di adesione CE. È importante sottolineare che le cellule simil-EECM-BMEC stabiliscono proprietà barriera paragonabili ai BMEC umani primari e, grazie alla loro espressione di tutte le molecole di adesione CE, le cellule simil-EECM-BMEC sono diverse da altri modelli di BBB in vitro derivati dall'hiPSC. Le cellule simil-BMEC EECM sono quindi il modello di scelta per studiare il potenziale impatto dei processi patologici a livello della BBB, con un impatto sull'interazione delle cellule immunitarie in modo personalizzato.

Introduzione

L'unità neurovascolare (NVU) nel sistema nervoso centrale (SNC) è costituita dalle cellule endoteliali microvascolari altamente specializzate (ECs), dai periciti incorporati nella membrana basale endoteliale, nonché dalla membrana basale parenchimale e dai piedi terminali degli astrociti¹. All'interno della NVU, le cellule endoteliali microvascolari cerebrali (BMEC) sono i componenti chiave che formano la barriera emato-encefalica (BBB). I BMEC formano giunzioni strette complesse e continue e hanno un'attività pinocitotica estremamente bassa rispetto alle EC microvascolari negli organi periferici, che consentono alla BBB di inibire la libera diffusione paracellulare di molecole idrosolubili nel SNC. L'espressione di specifici trasportatori di afflusso e pompe di efflusso da parte dei BMEC garantisce l'assorbimento e l'esportazione di nutrienti e molecole nocive, rispettivamente, dal SNC². Inoltre, la BBB controlla rigorosamente l'ingresso delle cellule immunitarie nel SNC esprimendo bassi livelli di molecole di adesione endoteliale cruciali per il traffico di cellule immunitarie nel SNC³. In condizioni fisiologiche, i livelli di espressione delle molecole di adesione sulla superficie dei BMEC, come la molecola di adesione intercellulare-1 (ICAM-1) e la molecola di adesione delle cellule vascolari-1 (VCAM-1), sono bassi, ma questi livelli aumentano in alcuni disturbi neurologici². La degradazione morfologica e funzionale della BEE è riportata in molte malattie neurologiche, come l'ictus⁴, la sclerosi multipla (SM)⁵ e diverse malattie neurodegenerative ^6,7,8. L'indagine dettagliata delle caratteristiche cellulari e molecolari dei BMEC sia in condizioni fisiologiche che patologiche è un approccio per identificare nuove strategie terapeutiche che colpiscono la BEE.

Fino a poco tempo fa, i BMEC umani e roditori primari o immortalizzati venivano utilizzati per studiare la BBB. Tuttavia, non è chiaro se le conclusioni basate su modelli animali della BEE siano facilmente applicabili alla BEE umana, poiché l'espressione di diverse molecole importanti, tra cui molecole di adesione e proteine trasportatrici di soluti, differisce tra l'uomo e i roditori ^9,10. Sebbene le linee BMEC umane come hCMEC/D3 esprimano livelli appropriati di molecole di adesione¹¹, questi BMEC immortalizzati generalmente non hanno giunzioni strette complesse e robuste proprietà^{barriera 12}. I BMEC umani primari sono utili per studiare le funzioni di barriera¹³, ma non sono prontamente disponibili per tutti i ricercatori. Inoltre, i BMEC primari dei pazienti possono essere difficili da ottenere poiché devono essere raccolti attraverso una biopsia cerebrale o un intervento chirurgico che viene eseguito solo in condizioni cliniche specifiche.

I recenti progressi nella tecnologia delle cellule staminali hanno permesso la differenziazione di vari tipi di cellule umane, derivanti da fonti di cellule staminali come le cellule staminali pluripotenti indotte umane (hiPSC). I modelli derivati dall'hiPSC ci permettono di stabilire modelli fisiopatologici utilizzando campioni derivati dal paziente. Diversi tipi di cellule derivate dall'hiPSC possono essere combinati per stabilire co-colture autologhe o organoidi che imitano meglio le condizioni fisiologiche. Diversi protocolli ampiamente utilizzati 14,15,16,17,18,19 possono essere usati per differenziare cellule simili a BMEC derivate da hiPSC che hanno robuste proprietà di barriera alla diffusione con l'espressione di trasportatori BBB-specifici e pompe di efflusso e sono utili per studiare la diffusione paracellulare di piccole molecole, i meccanismi di trasporto molecolare e il rilascio di farmaci al cervello ^20,21. Tuttavia, studi precedenti hanno dimostrato che le cellule simili a BMEC derivate dall'hiPSC ampiamente utilizzate mancano dell'espressione di molecole chiave di adesione endoteliale, tra cui VCAM-1, selectine e ICAM-2, che sono responsabili della mediazione delle interazioni tra le cellule immunitarie e la BBB²². Inoltre, sono stati riportati precedenti BMEC derivati da hiPSC che mostrano caratteristiche endoteliali ed epiteliali miste a livello trascrizionale²³. Pertanto, abbiamo sviluppato il metodo di coltura cellulare endoteliale estesa (EECM), un nuovo protocollo che consente la differenziazione delle hiPSC in cellule simili a BMEC che assomigliano ai BMEC umani primari per quanto riguarda la morfologia, le caratteristiche della barriera e l'espressione della molecola di adesione endoteliale. Questo protocollo descrive le procedure metodologiche dettagliate per differenziare le hiPSC in cellule simili a BMEC che mostrano un fenotipo immunitario maturo.

Protocollo

Figura 1: Panoramica del protocollo. Il manoscritto presenta un protocollo passo-passo per differenziare le hiPSC in cellule simili a EECM-BMEC. Gli schemi giusti descrivono le popolazioni cellulari in ogni fase. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

La linea hiPSC, HPS1006, è stata fornita dal RIKEN BRC attraverso il National Bio-Resource Project del MEXT/AMED, Giappone.

1. Induzione del differenziamento di hiPSC in cellule progenitrici endoteliali (EPCs)

1. Piastre e reagenti rivestiti di matrice extracellulare (ECM)
   1. Preparare piastre a 12 pozzetti rivestite con membrana basale aliquotando 2,5 mg di gel di matrice in provette da centrifuga da 50 ml per la conservazione a -20 °C per un massimo di 6 mesi. Aggiungere nel tubo 30 ml di miscela fredda di Eagle F-12 (DMEM/F12) modificata di Dulbecco, conservata in frigorifero (4 °C). Mescolare delicatamente mediante pipettaggio fino a quando il gel non si è scongelato, quindi aggiungere 500 μL della soluzione a ciascun pozzetto della piastra a 12 pozzetti. Porre la piastra in un incubatore (37 °C, 5% CO₂) per almeno 1 ora.
      NOTA: Il gel della matrice della membrana basale è sensibile alla temperatura e deve essere maneggiato secondo le istruzioni del produttore per l'aliquotazione e il rivestimento della piastra. La concentrazione di proteine della matrice extracellulare può variare tra i lotti. Per garantire l'accuratezza, la concentrazione esatta deve essere indicata sulla scheda del certificato di qualità per il lotto specifico, utilizzando il numero di lotto. Ad esempio, se la concentrazione esatta è 10,0 mg / ml, utilizzare 250 μL di gel per un totale di 2,5 mg.
   2. Preparare la soluzione madre di inibitore della rho-chinasi (ROCK) sciogliendo l'inibitore ROCK in acqua sterile fino a una concentrazione di 10 mM (Tabella 1). Aliquotare la soluzione madre in volumi di 100-200 μL e conservare a -20 °C per evitare cicli di gelo-disgelo.
   3. Preparare una soluzione madre di acido L-ascorbico da 100 mg/mL sciogliendo 5 g di acido L-ascorbico in 50 mL di acqua sterile e conservare a -20 °C (Tabella 1). Aggiungere 6,25 ml di glutammina e 305 μL di soluzione madre di acido L-ascorbico in 500 ml di DMEM/F12 avanzato per ottenere un mezzo LaSR²⁴ (Tabella 1). Conservare a 2-8 °C per un massimo di 2 settimane.
   4. Preparare la soluzione di CHIR99021 sciogliendo CHIR99021 in dimetilsolfossido (DMSO) non diluito fino ad una concentrazione finale di 10 mM (Tabella 1). Aliquotare la soluzione in volumi di 100-200 μL per evitare cicli di gelo-scongelamento e conservare a -20 °C per un massimo di 1 anno. Conservare le aliquote di lavoro della soluzione madre a 4 °C per un massimo di 1 mese.
   5. Preparare il terreno DMEM/F12-10 aggiungendo 50 ml di siero bovino fetale inattivato dal calore a 450 ml di DMEM/F12. Conservare il terreno a 2-8 °C per un massimo di 1 mese (Tabella 1).
   6. Preparare il tampone di flusso-1 aggiungendo 33,3 ml di albumina sierica bovina al 7,5% (BSA) a 467 ml di soluzione salina tamponata fosfato (PBS) di Dulbecco (Tabella 1). Conservare a 2-8 °C per un massimo di 6 mesi.
2. Semina di hiPSC singolarizzate, ed espansione per differenziazione EPC (dal Giorno -3 al Giorno -1)
   1. Inizia la differenziazione quando le colonie hiPSC in una piastra a 6 pozzetti non mostrano alcuna differenziazione spontanea e hanno la densità appropriata per il passaggio, tipicamente intorno all'80% di confluenza (2,5-3,5 x 10⁶ cellule). Monitorare attentamente le cellule differenziate spontaneamente al microscopio per assicurarsi che siano necessari più passaggi per eliminare le cellule non differenziate. Fare riferimento alla nota fornita di seguito al punto 1.4.15 per informazioni riguardanti il terreno di coltura cellulare e la matrice extracellulare.
   2. Aspirare il mezzo e aggiungere 1 mL di reagente di dissociazione nei pozzetti e incubare per 5-7 minuti a 37 °C. Dissociare e singolarizzare le cellule pipettando delicatamente la soluzione di reagente di dissociazione sulle superfici dei pozzetti due o tre volte.
   3. Trasferire le cellule staccate in una provetta da 15 mL contenente 4 mL di mezzo di mantenimento hiPSC e risospendere accuratamente le cellule. Riservare un'aliquota di 10 μL per il conteggio delle cellule.
   4. Pellettare le celle centrifugando per 5 minuti a 200 x g a 20-25 °C. Contare le celle e calcolare il volume richiesto per ottenere una densità appropriata di hiPSC (75-400 x 10³ per pozzetto) in una piastra a 12 pozzetti rivestita con matrice di membrana basale (fase 1.1.1).
   5. Aspirare la soluzione di rivestimento dai pozzetti e aggiungere 1 mL di mezzo hiPSC contenente 10 μM di inibitore ROCK in ciascun pozzetto (diluizione 1:1.000). Dopo la centrifugazione, aspirare il surnatante e dissociare il pellet in 1 mL di mezzo hiPSC.
   6. Aggiungere il volume richiesto di hiPSC, determinato al punto 1.2.4, a ciascun pozzetto della piastra a 12 pozzetti. Da due a quattro piastre da 12 pozzetti possono essere sufficienti per differenziare un clone hiPSC. Fare riferimento al punto 1.2.4 per determinare il numero di piastre necessarie per le celle di semina.
   7. Posizionare la piastra in un incubatore (37 °C, 5% CO₂). Distribuire uniformemente le celle facendo scorrere delicatamente la piastra avanti e indietro e poi da un lato all'altro nell'incubatore.
   8. Il giorno seguente (cioè il giorno -2), scambiare il terreno con 2 ml di terreno di mantenimento hiPSC privo di inibitore ROCK. Il giorno successivo (Giorno -1), sostituire il terreno con 2 mL di terreno di mantenimento hiPSC fresco.
3. Induzione di EPCs con l'inibitore della glicogeno sintasi chinasi 3 (GSK-3) CHIR99021 (dal Giorno 0 al Giorno 5)
   1. Il giorno 0, sostituire il mezzo di mantenimento hiPSC in ciascun pozzetto con 2 mL di terreno LaSR contenente 8 μM CHIR99021.
   2. Il giorno 1, aspirare il terreno e aggiungere 2 ml di terreno LaSR fresco contenente 8 μM CHIR99021.
   3. Nei giorni 2, 3 e 4, sostituire il terreno con 2 ml di terreno LaSR fresco privo di CHIR99021.
4. Selezione cellulare attivata magnetica (MACS) per purificare CD31⁺ EPC (Giorno 5)
   1. Il giorno 5, aspirare il mezzo e quindi aggiungere 1 mL di reagente di dissociazione a ciascun pozzetto, prima di incubare per 6-8 minuti a 37 °C.
   2. Dissociare e singolarizzare le cellule con una micropipetta e passare attraverso un filtro cellulare da 40 μm per filtrare la sospensione in un tubo da 50 mL contenente 10 mL di terreno DMEM/F12-10. Filtrare la sospensione cellulare raccolta da più di due piastre da 12 pozzetti in almeno due tubi da 50 ml.
   3. Interrompere la reazione di digestione aggiungendo DMEM/F12-10 terreno (fino a 50 ml). Pipettare accuratamente e riservare 10 μL per il conteggio delle celle. Pellettare le celle centrifugando per 5 minuti a 200 x g a 20-25 °C.
   4. Dopo aver rimosso il surnatante, aggiungere 10 mL di terreno DMEM/F12-10 e trasferire la sospensione cellulare in provette fresche da 15 ml. Pellettare le celle centrifugando per 5 minuti a 200 x g a 20-25 °C.
   5. Aspirare il surnatante e risospenderlo in flow buffer-1 ad una densità di 1,0 x 10⁷ cellule per 100 μL di tampone.
   6. Aggiungere il reagente bloccante FcR in un rapporto di 1:100 e incubare per 5 minuti prima di aggiungere l'anticorpo CD31 marcato con isotiocianato di fluoresceina (FITC) diluito 1:200. Incubare la sospensione per 30 minuti al buio a 20-25 °C.
   7. Aggiungere 10 ml di buffer di flusso-1, riservando 10 μL della sospensione per l'analisi della citometria a flusso per determinare la frazione di cellule CD31⁺ (Figura 2).
   8. Pellettare le celle centrifugando a 200 x g per 5 minuti a 20-25 °C. Quindi, rimuovere il surnatante e risospendere a una densità di 1,0 x 10⁷ cellule per 100 μL di soluzione tampone di flusso-1. Aggiungere il cocktail di selezione FITC (5 μL per 100 μL di sospensione cellulare). Mescolare accuratamente mediante pipettaggio e incubare al buio per 15 minuti a 20-25 °C.
   9. Aggiungere 5 μL di nanoparticelle magnetiche per 100 μL di sospensione cellulare, pipettare bene e incubare al buio per 10 minuti a 20-25 °C.
   10. Trasferire la sospensione cellulare in un tubo citometrico a flusso da 5 mL e aggiungere il buffer di flusso-1 per ottenere un volume totale di 2,5 ml. Posizionare il tubo di citometria a flusso nel magnete per 5 minuti.
   11. In un movimento continuo, invertire il magnete e decantare la sospensione cellulare contenente cellule che non sono state marcate con l'anticorpo FITC-CD31. Mantenere il magnete e il tubo in posizione invertita per 2-3 secondi e quindi rimuovere il liquido rimanente. Aspirare eventuali goccioline sul bordo del tubo prima di riportare il tubo in posizione verticale.
   12. Prelevare il tubo di citometria a flusso dal magnete e aggiungere 2,5 ml di buffer di flusso-1 per lavare le cellule CD31⁺ rimanenti. Risospendere le cellule pipettando delicatamente le cellule su e giù due o tre volte. Posizionare il tubo di flusso nel magnete per 5 minuti.
   13. Ripetere i passaggi 1.4.11-1.4.12 tre volte e poi il passaggio 1.4.11 ancora una volta per un totale di quattro lavaggi.
   14. Rimuovere il tubo di flusso dal magnete e aggiungere la quantità indicata di un mezzo adatto (ad esempio, mezzo privo di siero endoteliale umano [hECSR] per colture EC estese o mezzo di congelamento per congelamento) al tubo per risospendere le cellule CD31⁺ purificate. Riservare due aliquote da 10 μL della sospensione, una per il conteggio delle cellule e la seconda per effettuare l'analisi della citometria a flusso per valutare la purezza delle cellule CD31⁺ nei campioni post-MACS (Figura 2). Se un citometro a flusso non è disponibile immediatamente, conservare l'aliquota a 4 °C fino all'analisi.
   15. Se i passaggi successivi (fino al passaggio 2) non possono essere eseguiti immediatamente, congelare le EPC CD31⁺ a questo punto. Per l'espansione e il passaggio selettivo degli EPC, procedere al passaggio 2.
       NOTA: Le piastre a 12 pozzetti rivestite con vitronectina²⁵ e il mezzo di manutenzione hiPSC più stabile (mTeSR plus) possono essere utilizzati al posto delle piastre rivestite con matrice della membrana basale e del mezzo di manutenzione hiPSC (mTeSR1). Per preparare le piastre a 12 pozzetti rivestite di vitronectina, diluire la vitronectina con tampone di diluizione ad una concentrazione finale di 10 μg/mL e quindi trasferire 500 μL della soluzione diluita in ciascun pozzetto delle piastre a 12 pozzetti. Lasciare le piastre a 20-25 °C per almeno 1 ora. La densità di semina delle hiPSC singolarizzate, è paragonabile a quella utilizzata per le piastre rivestite con matrice di membrana basale. La modifica del terreno di coltura o della composizione della matrice può influire sulla proliferazione e sulla differenziazione spontanea delle hiPSC, che in genere richiedono 1-2 settimane per adattarsi alle nuove condizioni di coltura. Se il mezzo di manutenzione hiPSC più stabile viene utilizzato per la manutenzione hiPSC, questo mezzo può essere utilizzato per la differenziazione EPC anziché il mezzo di manutenzione hiPSC. In questo caso, il mezzo di mantenimento hiPSC più stabile deve essere cambiato al giorno -2 per rimuovere l'inibitore ROCK e lo scambio al giorno -1 può essere saltato.

2. Metodo di coltura cellulare endoteliale estesa (EECM) per differenziare le cellule microvascolari simili alle cellule endoteliali del cervello (cellule BMEC-like) e le cellule simili al muscolo liscio (SMLC)

1. Preparazione di piastre e reagenti rivestiti di collagene
   1. Preparare piastre a 6 pozzetti rivestite di collagene sciogliendo 5 mg di collagene cristallizzato di tipo IV in 5 ml di acqua sterile. Incubare per una notte a 4 °C prima di aliquotare e conservare a -20 °C. Diluire le aliquote di collagene IV 1:100 in acqua sterile per produrre soluzioni da 10 μg/mL e aggiungere 1 mL di soluzioni di collagene IV da 10 μg/mL a ciascun pozzetto delle piastre a 6 pozzetti. Incubare le piastre per almeno 30 minuti a 37 °C. Le piastre possono essere conservate a 37 °C per un massimo di 1 settimana.
   2. Preparare una soluzione madre di fattore di crescita dei fibroblasti umani 2 (FGF2) sciogliendo 500 μg di FGF in 5 mL di PBS di Dulbecco, aggiungere il 7,5% di BSA ad una concentrazione finale dello 0,1% e aliquotare la soluzione madre in volumi di 20-200 μL. Questi possono essere conservati a -20 °C per un massimo di 3 mesi (Tabella 1). Le soluzioni madre possono essere conservate a 4 °C per un massimo di 1 mese; Evitare cicli di congelamento-disgelo. Preparare il terreno hECSR aggiungendo 2 mL di supplemento di B-27 e 20 μL di FGF2 in 98 mL di terreno hECSR (Tabella 1). Il terreno hECSR può essere conservato a 2-8 °C per un massimo di 2 settimane.
   3. Preparare il mezzo di congelamento per le EPC, le cellule simil-EECM-BMEC e le SMLC aggiungendo 15 ml di siero bovino fetale, 5 ml di DMSO e 25 μL di soluzione inibitrice di ROCK a 30 ml di terreno hECSR (Tabella 1). Il mezzo di congelamento può essere conservato a 2-8 °C per un massimo di 2 settimane.
2. EPC di semina per colture cellulari endoteliali estese
   1. Rimuovere la soluzione di collagene dalle piastre a 6 pozzetti. Quindi, trasferire 1,0-2,0 x 10 5 EPC CD31⁺ purificate in 2 ml di terreno hECSR contenente⁵ μM di inibitore ROCK (diluizione 1:2.000). Posizionare la piastra in un incubatore (37 °C, 5% CO₂). Distribuire uniformemente le celle facendo scorrere delicatamente le piastre avanti e indietro, quindi da un lato all'altro.
   2. Il giorno successivo, rimuovere il terreno hECSR contenente l'inibitore ROCK e aggiungere 2 ml di terreno hECSR fresco senza inibitore ROCK. Sostituire il mezzo hECSR a giorni alterni fino a raggiungere la confluenza del 100%.
      NOTA: Se un programma di alimentazione regolare non può essere mantenuto durante un fine settimana, il terreno può essere sostituito la sera dell'ultimo giorno lavorativo della settimana e di nuovo la mattina presto dopo il fine settimana.
3. Passaggio selettivo per purificare cellule simil-settec e SMLC
   1. Rimuovere il mezzo hECSR dalle piastre a 6 pozzetti contenenti una miscela di popolazioni EC e non EC. Aggiungere 1 mL di reagente di dissociazione a ciascun pozzetto.
   2. Monitorare attentamente la morfologia cellulare al microscopio. Quando le EC (ma non le EC non EC) appaiono luminose e rotonde (in genere entro 2-5 minuti), staccarle toccando il bordo della piastra. La maggior parte dei non-EC rimane attaccata alla piastra.
   3. Raccogliere le EC staccate utilizzando una micropipetta, avendo cura di evitare di risospendere le non-EC. Trasferire le EC in una provetta da centrifuga da 15 mL o 50 mL contenente 4 mL di DMEM/F12-10 per 1 mL di reagente di dissociazione.
   4. Aggiungere 2 mL di terreno hECSR ai pozzetti contenenti i rimanenti non-EC collegati per stabilire SMLC. Posizionare la piastra nell'incubatore.
   5. Pipettare la sospensione EC nel tubo della centrifuga per miscelare accuratamente e riservare 10 μL della sospensione per il conteggio delle cellule. Centrifugare le celle rimanenti per 5 minuti a 200 x g a 20-25 °C. Rimuovere il surnatante dal pellet e aggiungere 2 ml di terreno hECSR per 1,0-2,0 x 10⁵ ECs.
   6. Dopo aver rimosso la soluzione di collagene IV da una nuova piastra a 6 pozzetti, aggiungere 2 ml di sospensione EC a ciascun pozzetto, quindi incubare a 37 °C con CO₂ al 5%. Per distribuire uniformemente le celle nella piastra, spostarla delicatamente in un movimento avanti e indietro e da un lato all'altro sul ripiano dell'incubatore.
   7. Sostituire il mezzo hECSR a giorni alterni fino a quando le EC raggiungono il 100% di confluenza.
   8. Ripetere i punti 2.3.1-2.3.7 fino ad ottenere un monostrato EC puro. Se non è possibile eseguire le seguenti operazioni, congelare le EC CD31⁺ (vedere punto 2.4.2). Per analizzare le funzioni EC, procedere al passaggio 3.
      NOTA: In generale, sono necessari due o tre passaggi selettivi per ottenere colture quasi pure di EC adatte per analisi funzionali, e consideriamo queste cellule come cellule simil-settec come EECM-BMEC-like. Dopo più di cinque o sei passaggi, la proliferazione cellulare tipicamente rallenta, sebbene questa variabile dipenda dalla linea hiPSC.
   9. Per la coltura di SMLC, sostituire il mezzo hECSR a giorni alterni. Per raccogliere il mezzo con SMLC (CM), far passare il mezzo raccolto attraverso un filtro da 0,22 μm ad ogni modifica del fluido. La CM può essere utilizzata per sovraregolare l'espressione di VCAM-1 di cellule simil-EECM-BMEC. Raggruppare SMLC-CM fino a quando gli SMLC raggiungono il 100% di confluenza.
4. Crioconservazione e scongelamento di cellule simili a EPC, EECM-BMEC e SMLC
   1. Per congelare gli EPC, dopo il lavaggio finale MACS (fase 1.4.13), risospendere gli EPC in mezzo di congelamento anziché in mezzo hECSR ad una densità di 1,0-2,0 x 10⁶ celle/ml. Distribuire 1 mL della sospensione cellulare in criotubi. Inserire i criotubi in un dispositivo di congelamento a velocità controllata e trasferirli rapidamente a -80 °C. Per la conservazione a lungo termine, spostare i tubi in un serbatoio di azoto liquido da 24 a 48 ore dopo il congelamento.
   2. Per congelare cellule simil-settec e SMLC, dopo aver rimosso il mezzo dai pozzetti, aggiungere il reagente di dissociazione (1 mL/pozzetto) e incubare la piastra a 37 °C con il 5% di CO₂ fino al distacco delle cellule (5-7 min e 20-30 min per le cellule simil-EECM-BMEC e SMLC, rispettivamente). Raccogliere le cellule in una provetta da centrifuga da 15 ml o 50 ml contenente 4 ml di DMEM/F12-10 per 1 mL di reagente di dissociazione.
   3. Pipettare accuratamente per miscelare e riservare 10 μL della sospensione cellulare per il conteggio delle cellule. Pellettare le celle centrifugando a 200 x g per 5 minuti a 20-25 °C. Rimuovere il surnatante e risospendere completamente le cellule in mezzo di congelamento ad una densità di 1,0-2,0 x 10⁶ cellule/ml. Distribuire 1 mL della sospensione cellulare in criotubi freschi.
   4. Collocare i criotubi in un dispositivo di congelamento a velocità controllata e trasferirli immediatamente a -80 °C. Per la conservazione a lungo termine, i tubi possono essere trasferiti in un serbatoio di azoto liquido da 24 a 48 ore dopo il congelamento.
   5. Per lo scongelamento di EPC, cellule simil-EECM-BMEC e SMLC, arrotolare flaconcini di criotubi tra le mani o incubare in un bagno d'acqua a 37 °C fino a quando le cellule sono quasi completamente scongelate. Aggiungere 500 μL di DMEM/F12-10 e trasferire delicatamente la sospensione cellulare in un tubo da 15 mL contenente 4 mL di terreno DMEM/F12-10. Lavare il criotubo una volta aggiungendo 1 mL di DMEM/F12-10 e quindi centrifugare le cellule a 200 x g per 5 minuti a 20-25 °C.
   6. Aspirare il surnatante e risospendere il pellet in 2 mL di mezzo hECSR contenente 5 μM di inibitore ROCK (diluizione 1:2.000) ad una densità di 1,0-2,0 x 10 5 cellule per 2 mL per EPC e 2,0-3,0 x 10⁵ cellule per 2 mL per cellule ECM-BMEC-simili e SMLC. Distribuire la sospensione cellulare tra i pozzetti delle piastre a 6 pozzetti rivestite di collagene dopo aver aspirato la soluzione di collagene.
   7. Spostare delicatamente le piastre avanti e indietro, quindi da un lato all'altro, sul ripiano di un'incubatrice a 37 °C, 5 % CO₂ per distribuire uniformemente le celle nei pozzetti.
   8. Il giorno successivo, sostituire il terreno con un terreno hECSR fresco privo di inibitore ROCK. Sostituire il mezzo hECSR a giorni alterni fino a raggiungere il 100% di confluenza. Quindi, procedere al passaggio selettivo per EPC (vedi passo 2.3) e alle analisi funzionali per celle simil-BMEC EECM (vedi fase 3). Prima di eseguire la caratterizzazione molecolare e i saggi funzionali, le cellule simil-settec devono essere confluenti al 100%, che si ottengono tipicamente 2-3 giorni dopo lo scongelamento.

3. Validazione di cellule simil-EECM-BMEC e SMLC

1. Saggio di permeabilità per traccianti di piccole molecole
   1. Valutare l'integrità della barriera cellulare simile a EECM-BMEC misurando la permeabilità alla fluoresceina di sodio, come descritto da Nishihara et ^al.26. Seminare le cellule simili a EECM-BMEC su inserti filtranti per sviluppare monostrati completi e misurare la permeabilità della fluoresceina di sodio.
2. Colorazione a immunofluorescenza per valutare le molecole chiave.
   1. Per la colorazione a immunofluorescenza per monitorare l'espressione di molecole giunzionali, molecole di adesione o proteine citoscheletriche di cellule simil-EECM-BMEC in monostrati o di SMLC, utilizzare vetrini a camera, piastre a 96 pozzetti o membrane con filtri di inserimento. Valutare l'espressione cellulare EECM-BMEC-like di molecole di adesione superficiale cellulare con o senza stimolazione infiammatoria delle citochine, come descritto da Nishihara et ^al.26.
3. Citometria a flusso per analizzare l'espressione di molecole di adesione superficiale cellulare su cellule simil-settec
   1. Utilizzare la citometria a flusso per valutare l'espressione semi-quantitativa delle molecole di adesione della superficie cellulare coinvolte nella migrazione delle cellule immunitarie nel SNC, tra cui ICAM-1, ICAM-2, VCAM-1, P-selectina, E-selectina, CD99 e la molecola di adesione delle cellule endoteliali piastriniche-1 (PECAM-1), come descritto da Nishihara et ^al.26. Coltura di cellule simil-EECM-BMEC con terreno condizionato da SMLC in presenza e assenza di citochine infiammatorie per 16-18 ore.
4. Saggio di adesione delle cellule immunitarie in condizioni statiche per valutare l'espressione di molecole di adesione funzionale
   1. Utilizzare il metodo descritto da Nishihara et ^al.26 per determinare se le molecole di adesione della superficie cellulare delle cellule simil-BMEC sono funzionali.
   2. In breve, seminare le cellule simili a EECM-BMEC su un vetrino a camera a 5,5 x 10⁴ / cm² e crescere fino alla confluenza. Circa 24 ore dopo, cambiare il terreno di coltura in terreno condizionato da SMLC in presenza o assenza di citochine pro-infiammatorie e incubare le cellule simil-EECM-BMEC per ulteriori 16 ore.
   3. Il giorno dell'esperimento, scongelare le cellule immunitarie crioconservate (ad esempio, cellule T o cellule mononucleate del sangue periferico [PBMC]) con tampone di lavaggio delle cellule T (Tabella 1) ed etichettare con coloranti fluorescenti (ad esempio, coloranti per localizzatori cellulari) in mezzo di cellule T (Tabella 1). L'ottimizzazione del terreno di coltura per le cellule immunitarie dovrebbe essere adattata al tipo specifico di cellule immunitarie studiate.
   4. In una diapositiva a 16 pozzetti, aggiungere 2 x 10^{celle 4} Th1 alle celle simil-BMEC EECM. In particolare, quando si lavora con cellule T effettrici come le cellule Th1, è stato osservato che mostrano un maggiore attaccamento alle cellule simili a EECM-BMEC rispetto alle PBMC (Nishihara. et al. [2022]). Di conseguenza, il numero di PBMC da aggiungere alle celle simil-EECM-BMEC deve essere maggiore rispetto alle cellule T effettrici pure.
   5. Incubare le cellule immunitarie con il monostrato di cellule simil-EECM-BMEC per 30 minuti nel mezzo di saggio di migrazione (Tabella 1). Dopo 30 minuti, lavare delicatamente il vetrino, due volte immergendolo in un barattolo contenente PBS di Dulbecco e successivamente fissare con soluzione di glutaraldeide al 2,5% a 4 °C per 2 ore.
   6. Dopo la fissazione, lavare due volte il vetrino immergendolo in un barattolo contenente il PBS di Dulbecco e montarlo con un coprivetrino. Successivamente acquisire immagini al microscopio a fluorescenza del centro del monostrato sui vetrini per il conteggio delle cellule immunitarie attaccate ai monostrati cellulari simili a EECM-BMEC.

Risultati

Saggio di permeabilità
La permeabilità della fluoresceina di sodio è stata calcolata misurando l'intensità di fluorescenza del mezzo raccolto dalla camera inferiore a 15, 30, 45 e 60 min. Un totale di 150 μL di terreno viene campionato in ogni punto temporale e il volume mancante di 150 μL viene sostituito con terreno hECSR. l'intensità di fluorescenza viene letta utilizzando un lettore di piastre fluorescenti (eccitazione 485 nm/emissione 530 nm) e i segnali, i volumi di clearance e le permeabilità corretti vengono calcolati utilizzando una formula¹⁸ precedentemente descritta (Tabella 2). Si raccomanda di confermare se l'intensità di fluorescenza della fluoresceina di sodio aumenta nel tempo. Per un test dovrebbero essere utilizzati più filtri, almeno triplicati, per garantire la riproducibilità. Per le cellule sane di tipo EECM-BMEC derivate dal controllo, la permeabilità alla fluoresceina di sodio (376 Da) deve essere inferiore a 0,3 x ^10-3 cm/min. Per confermare la formazione di un monostrato cellulare confluente simile a EECM-BMEC, la colorazione a immunofluorescenza per le proteine giunzionali delle cellule simil-EECM-BMEC di ciascun filtro utilizzato nei saggi di permeabilità deve essere eseguita dopo questo test.

Colorazione con immunofluorescenza
La colorazione a immunofluorescenza di molecole giunzionali cellulari simili a EECM-BMEC, tra cui claudina-5, occludina e VE-caderina¹, è stata utilizzata per valutare la morfologia cellulare e la presenza di giunzioni continue e mature (Figura 4). I monostrati di cellule simil-EECM-BMEC sulle membrane degli inserti filtranti sono stati fissati con metanolo freddo (-20 °C) per 20 s, bloccati con tampone bloccante (Tabella 1) e quindi incubati con anticorpi primari e secondari. Le cellule simil-BMEC mostravano forme simili a fusi e giunzioni a zigzag, entrambe caratteristiche morfologiche dei BMEC²⁷. La stimolazione delle cellule simil-settec seminate su vetrini da camera con citochine pro-infiammatorie, come il fattore di necrosi tumorale α (TNF-α) e l'interferone-γ (INF-γ) (0,1 ng/mL TNF-α + 2 UI/mL IFN- γ) diluite in mezzo condizionato derivato da SMLC, ha sovraregolato l'espressione di molecole di adesione, come ICAM-1 e VCAM-1²⁸ (Figura 5). Le immagini rappresentative dei marcatori delle cellule muscolari lisce, tra cui l'actina α-liscia (SMA), la calponina e la proteina 22-alfa (SM22a)²⁹, sono mostrate nella Figura 6. Gli SMLC seminati sul vetrino della camera sono stati fissati con paraformaldeide al 4% per 10 minuti, bloccati con tampone bloccante e quindi incubati con anticorpi primari e secondari.

Analisi di citometria a flusso dell'espressione di molecole di adesione superficiale cellulare da parte di cellule simil-settec
I risultati rappresentativi per l'espressione della superficie cellulare delle molecole di adesione endoteliale su cellule simili a EECM-BMEC sono mostrati nella Figura 7. La stimolazione con citochine pro-infiammatorie, come TNF-α e INF-γ, ha sovraregolato l'espressione della superficie cellulare di diverse molecole di adesione, tra cui ICAM-1, VCAM-1 e P-selectina. Coltivazione di cellule simil-settec con espressione superficiale endoteliale VCAM-1 con mezzo termolavorata da SMLC. L'effetto dell'induzione dell'espressione della superficie cellulare VCAM-1 può variare tra lotti di mezzo condizionato da SMLC. Si raccomanda di conservare diversi lotti di terreno condizionato prelevato da SMLC, derivati dalla stessa sorgente hiPSC, quando si differenziano gli SMLC, al fine di verificare quale lotto induce l'espressione appropriata di VCAM-1.

Saggio di adesione delle cellule immunitarie in condizioni statiche
Il numero di cellule immunitarie attaccate era correlato al livello di espressione delle molecole di adesione funzionale sulla superficie delle cellule simil-BMEC di EECM. La stimolazione con citochine infiammatorie ha sovraregolato l'espressione delle molecole di adesione endoteliale e ha promosso l'aumento del numero di cellule immunitarie che hanno aderito ai monostrati cellulari simili a EECM-BMEC (Figura 8). L'attuale esperimento ha dimostrato la funzionalità delle molecole di adesione su cellule simili a EECM-BMEC, rendendo questo modello adatto allo studio delle interazioni cellula immunitaria-EC.

Figura 2: Purificazione delle EC CD31⁺ . Grafici a punti di dati rappresentativi di citometria a flusso da scatter gating di EC e colorazione CD31 marcata con FITC di popolazioni cellulari prima (fase 1.4.7) e dopo (fase 1.4.14) MACS. MACS migliora la purezza delle EPC CD31⁺ nella popolazione. Abbreviazioni: SSC = side scatter; FSC = forward scatter; FITC = isotiocianato di fluoresceina; MACS = ordinamento cellulare attivato magneticamente. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figura 3: Permeabilità del monostrato EECM-BMEC (^10-3 cm/min) calcolata dall'intensità di fluorescenza grezza della fluoresceina di sodio. La pendenza lineare del volume di gioco viene calcolata utilizzando la regressione lineare per ciascun filtro (Figura 3A). La permeabilità della fluoresceina di sodio è calcolata utilizzando due formule (Figura 3B). (A) La pendenza lineare del volume di gioco rispetto al tempo è stata calcolata utilizzando la regressione lineare per il filtro 1 (m_c1) e il filtro bianco (m_f). m c1 e m f sono coefficienti di X_c1 e X_f, rispettivamente. (B) Formula per il calcolo della permeabilità alla fluoresceina (Pe) utilizzando m_c e m_f (Formula 1). Le unità Pe sono state convertite utilizzando la superficie di un filtro (Formula 2). Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figura 4: Le cellule simil-EECM-BMEC mostrano giunzioni cellulari mature. Colorazione a immunofluorescenza per claudina-5, occludina o VE-caderina (rosso) in cellule simil-settec cresciute su membrane di filtri a inserto. I nuclei sono stati colorati usando 4′,6-diamidino-2-fenilindolo (DAPI) (blu). La colorazione è stata eseguita sugli stessi inserti filtranti utilizzati per i saggi di permeabilità. Barra di scala = 50 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figura 5: Espressione di molecole di adesione endoteliale da parte di cellule simil-EECM-BMEC. La colorazione a immunofluorescenza è stata eseguita su cellule simil-EECM-BMEC cresciute su membrane di inserti filtranti in presenza di CM derivata da SMLC. L'immunocolorazione per ICAM-1 o VCAM-1 (rosso) è mostrata per cellule non stimolate e TNF-α 1 ng/mL + 20 UI/mL IFN- γ stimolate da cellule simil-settec stimolate. I nuclei sono stati colorati con DAPI (blu). Barra di scala = 50 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figura 6: Caratterizzazione delle SMLC. Viene mostrata l'immunocitochimica dell'actina α-liscia (SMA), della calponina o della proteina 22-alfa (SM22a) (rossa) per SMLC cresciuti su vetrini da camera. I nuclei sono stati colorati con DAPI (blu). Barra di scala = 50 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figura 7: Espressione della superficie cellulare endoteliale di molecole di adesione su cellule simil-settec EECM. Vengono mostrati i risultati dell'analisi citometrica a flusso dell'espressione della molecola di adesione superficiale EC su cellule simil-EECM-BMEC. Le cellule simil-EECM-BMEC sono state coltivate utilizzando terreno condizionato derivato da SMLC. Le linee blu, rosse e grigie delle sovrapposizioni dell'istogramma mostrano rispettivamente la condizione non stimolata (NS), 1 ng/mL TNF-α + 20 UI/mL IFN-γ-stimolata e il controllo isotipo. È stata valutata l'espressione della superficie cellulare delle molecole di adesione endoteliale, tra cui la molecola di adesione intercellulare 1 (ICAM-1), ICAM-2, la molecola di adesione delle cellule vascolari 1 (VCAM-1), la P-selectina, la E-selectina, CD99 e la molecola di adesione delle cellule endoteliali piastriniche-1 (PECAM-1). Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figura 8: Adesione di cellule immunitarie su cellule simil-settec (A) Immagini di cellule immunitarie aderenti marcate fluorescentmente su monostrati cellulari non stimolati (NS) e 0,1 ng/mL TNF-α + 2 UI/mL IFN-γ-stimolati (TNF-α + IFN-γ) EPEM-BMEC-like. Le immagini corrispondono ai centri dei pozzi. Barra di scala = 50 μm. (B) Il numero di cellule immunitarie marcate fluorescentmente su monostrati di NS e TNF-α + cellule simil-EPEM-BMEC-stimolate da IFN-γ. Le cellule immunitarie aderenti / campi visivi (FOV) sono stati conteggiati automaticamente utilizzando il software FIJI. I punti rappresentano il numero di cellule T collegate. Le barre mostrano il valore medio e le barre di errore mostrano la deviazione standard (SD) di otto prove. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Tabella 1: Dettagli dei reagenti specifici per i saggi. Vengono descritti il nome e la quantità esatta di ingredienti per ciascun reagente specifico. Clicca qui per scaricare questa tabella.

Tabella 2: Esempio di dati grezzi del lettore di piastre a fluorescenza per il calcolo di Pe. I numeri in grassetto sono l'intensità di fluorescenza grezza della fluoresceina di sodio misurata da un lettore di piastre. Al fine di analizzare accuratamente i dati, è necessario rimuovere il segnale di fondo dai valori grezzi e tenere conto di eventuali perdite di segnale derivanti dal campionamento della camera inferiore e successivamente correggere il segnale. Ad esempio, dopo aver sottratto lo sfondo, il campione di 15 minuti mostra un segnale di 100 unità di fluorescenza relativa (RFU) e il campione di 30 minuti mostra un segnale di 150 RFU. Il segnale corretto a 30 min è (150 RFU + i valori mancanti a 15 min [100 RFU x 150 μL/1.500 μL]), ovvero 150 RFU + 10 RFU = 160 RFU. Il volume di gioco = (1.500 x [S B,t])/(S T,60 min), dove 1.500 è il volume della camera inferiore (1.500 μL), S B,t è il segnale corretto al tempo t e S_T,60 min è il segnale della camera superiore a_{60 min}. Clicca qui per scaricare questa tabella.

Discussione

Punti critici e risoluzione dei problemi
Prima di iniziare la differenziazione EPC, i ricercatori devono assicurarsi che non si siano verificati eventi di differenziazione cellulare spontanea nelle colture hiPSC. L'assenza di cellule spontaneamente differenziate e l'uso di colonie hiPSC pure è fondamentale per ottenere risultati riproducibili. La densità di semina dell'hiPSC al Day -3 è importante per ottenere un'elevata purezza delle EPC CD31⁺ dopo MACS. La densità di semina per ogni linea hiPSC e ogni passaggio può richiedere un'ottimizzazione. A seconda della linea hiPSC e del numero di passaggio, la densità di semina può variare tra 75 x 10 3 a 400 x 10 3 hiPSC per pozzetto di una piastra a 12 pozzetti (20-100 x 10 ³/cm²). Il checkpoint di densità minima delle hiPSC è la densità cellulare del giorno 2. Gli hiPSC dovrebbero raggiungere il 100% di confluenza entro il giorno 2 al più tardi. Se le hiPSC non sono confluenti entro il giorno 2, la purezza delle EPC CD31⁺ dopo MACS sarà di solito piuttosto bassa. In questo caso, la densità di semina hiPSC può essere aumentata. Se un gran numero di cellule differenzianti si stacca dalla piastra tra il giorno 3 e il giorno 5, la densità iniziale di semina dell'hiPSC può essere ridotta. Il 7-8 μM CHIR99021 nella nostra esperienza è la concentrazione ottimale per le linee hiPSCs utilizzate qui, ma la concentrazione potrebbe dover essere ottimizzata per altre linee hiPSC che potrebbero rispondere in modo diverso al trattamento inibitore. La purezza delle EPC CD31⁺ deve essere confermata prima e dopo MACS. Prima di continuare con il MACS, la miscela di cellule pre-ordinate deve essere costituita da cellule ^CD31+ al >10%. Le percentuali delle cellule CD31⁺ del <6% si traducono tipicamente in EPC del <80% dopo MACS. In questa situazione è necessaria l'ottimizzazione della densità iniziale di semina e/o della concentrazione di CHIR99021.

Per il successo del passaggio selettivo e della generazione di monostrati EC puri, la purezza post-MACS delle EPC CD31⁺ è fondamentale. Se la purezza dopo MACS è <90%, si consigliano uno o due lavaggi aggiuntivi (passaggi 1.4.11-1.4.12). Idealmente, la purezza post-MACS dovrebbe essere >95%. La densità di semina EPC su piastre rivestite di collagene deve essere ottimizzata in base alla linea hiPSC per ottenere il 100% di confluenza entro 3-7 giorni. Aspettare che le EC siano confluenti al 100% di solito porterà a un passaggio selettivo di successo. Tuttavia, anche per EC confluenti al 100%, anche gli SMLC di alcune linee hiPSC si staccano presto. In questo caso, il passaggio selettivo a confluenza inferiore (ad esempio, ≤80%) può essere efficace. Se alcuni SMLC si staccano prima degli EC, gli EC spesso non possono essere salvati dalla popolazione mista EC-SMLC. In questo caso, può essere utile abbreviare il tempo di attivazione del reagente di dissociazione nel passaggio di EC e passare selettivamente ripetitivo. L'uso di un reagente di dissociazione commerciale piuttosto che di tripsina come reagente di dissociazione è vantaggioso per il passaggio selettivo, poiché la tripsina non consente il distacco separato di EC e SMLC. I nostri saggi di permeabilità che utilizzano traccianti di piccole molecole e test di giunzione stretta e livelli di espressione di molecole di adesione indicano che EPC, cellule simili a EECM-BMEC e SMLC possono essere conservati in azoto liquido per almeno 2 anni.

Significato e limiti del metodo
Il metodo differenzia le EPC CD31⁺ dalle hiPSCs attraverso l'uso di inibitori chimici GSK-3 per attivare la segnalazione Wnt/β-catenina. Dopo la selezione positiva delle EPCs CD31⁺ da parte di MACS, le EPCs vengono coltivate in un mezzo endoteliale definito che promuove la differenziazione in popolazioni endoteliali e SMLC miste. Il passaggio selettivo di queste popolazioni miste con diverse proprietà adesive consente la separazione delle EC dalle SMLC. Dopo uno o due passaggi, le cellule simil-EECM-BMEC mostrano proprietà barriera e l'espressione di molecole di adesione endoteliale che ricapitolano quelle dei BMEC umani primari. La co-coltura con SMLC o loro surnatanti induce l'espressione indotta da citochine di VCAM-1.

In vivo, la BBB mantiene l'omeostasi del SNC stabilendo una bassa permeabilità paracellulare e transcellulare delle molecole, attraverso il trasporto di nutrienti attraverso trasportatori specifici e il controllo del traffico di cellule immunitarie nel SNC. Per gli studi sulla BBB, è essenziale un modello adatto che mostri le rispettive molecole e funzioni di interesse. La produzione di cellule simili a EECM-BMEC utilizzando reagenti definiti e campioni di pazienti o soggetti sani fornisce un modello di BBB umano scalabile. I vantaggi di un modello che utilizza cellule simil-EECM-BMEC rispetto ad altri modelli di BBB sono: 1) un profilo morfologico e di trascrittoma endoteliale³⁰ che assomiglia a quello dei BMEC umani primari; 2) la presenza di giunzioni strette mature; 3) proprietà barriera desiderabili; e 4) la robusta espressione di molecole di adesione endoteliale, tra cui ICAM-1, ICAM-2, VCAM-1, E- e P-selectina, CD99, molecola di adesione delle cellule di melanoma (MCAM) e molecola di adesione delle cellule leucocitarie attivate (ALCAM)²². Pertanto, questo modello è particolarmente utile per studiare le interazioni tra cellule immunitarie e BMEC. Sebbene la permeabilità dei traccianti di piccole molecole sia più elevata per le cellule simil-BMEC di EECM rispetto a quella precedentemente riportata per le cellule simili a BMEC derivate da iPSC^14,15, le proprietà barriera si confrontano abbastanza bene con quelle descritte per i BMEC umani primari. Questa somiglianza indica che le cellule simil-BMEC sono probabilmente un buon modello in vitro della BEE. L'espressione di E-selectina su cellule simili a EECM-BMEC in condizioni fisiologiche deve essere presa in considerazione quando si utilizza questo modello per studiare BBB non infiammate che mancano di espressione costitutiva di E-selectina in vivo³¹. Nel nostro studio precedente, abbiamo dimostrato che le cellule simil-EECM-BMEC potrebbero fenocopiare la BBB, come osservato nel cervello dei pazienti con SM rispetto alle giunzioni strette interrotte. Ciò si traduce in una maggiore permeabilità delle piccole molecole e in una maggiore espressione della molecola di adesione funzionale, mediando l'aumento dell'adesione e della trasmigrazione delle cellule immunitarie attraverso le cellule BMEC-simili³². Inoltre, abbiamo dimostrato che l'attivazione della segnalazione Wnt/β-catenina può migliorare la rottura delle giunzioni strette e aumentare l'espressione di VCAM-1 in cellule simil-simil-settec derivate da MS³². Questi risultati indicano che il modello è effettivamente utile per studiare il ruolo della BBB nelle malattie neuroimmunologiche, come la SM.

Nel loro insieme, le cellule simil-EECM-BMEC sono uno strumento promettente per una comprensione approfondita dei meccanismi fisiopatologici a livello della BEE e come strumento per sviluppare nuovi bersagli terapeutici per la stabilizzazione della BEE. In futuro, il modello può essere applicato per studiare la disfunzione della BEE in uno spettro più ampio di malattie e potrebbe aprire strade per nuovi approcci terapeutici.

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.22 mm Syringe filter	TPP	99722
15 mL Centrifuge tube	Falcon	352196
40 μm Falcon cell strainer	Falcon	352340
5 mL Round-bottom tube	SPL	40005
50 mL Centrifuge tube	Falcon	352070
96-Well plate, round bottom	SPL	34096
Accutase	Sigma-Aldrich	A6964-500ml
Acetic acid	Sigma-Aldrich	695092
Advanced DMEM/F12	Life Technologies	12634
All-in-One Fluorescence Microscope	Keyence	BZ-X810
B-27 Supplement (503), serum free	Thermo Fischer Scientific	17504044
Bovine serum albumin (BSA), 7.5% in dPBS	Sigma-Aldrich	A8412
CellAdhere Dilution Buffer	STEMCELL Technologies	ST-07183
CellTracker Green CMFDA Dye	Invitrogen	C7025
Chamber slides	Thermo Fischer Scientific	178599
CHIR99021	Selleck Chemicals	S1263
Collagen IV from human placenta	Sigma-Aldrich	C5533
Corning tissue culture plates (12-well)	Corning	3512
Corning tissue culture plates (6-well)	Corning	3506
Cryo tube innercap 2.0 mL	Watson	1396-201S
Dimethylsulfoxide (DMSO), sterile	Sigma-Aldrich	D2650
DMEM (13), [+] 4.5 g/L D-glucose, [-] L-glutamine, [-] pyruvate	Thermo Fischer Scientific	31053-028
Dulbecco’s (d) PBS (without calcium, magnesium)	Thermo Fisher	14190250
Dulbecco’s modified Eagle’s medium/nutrient mixture F-12 (DMEM-F12)	Thermo Fischer Scientific	11320074
EasySepFITC Positive Selection Kit II	STEMCELL Technologies	18558
EasySepMagnet	Stemcell Technologies	18000
Ethylenediaminetetraacetic Acid Solution0.02% in DPBS	Sigma	E8008-100ML
Fetal Bovine Serum, qualified	Thermo Fischer Scientific	10270106
Fibronectin from bovine plasma	Sigma-Aldrich	F1141
Ficoll-Paque PLUS	Sigma-Aldrich	GE17144002
FIJI software (Version 2.0.0)	Image J, USA
FlowJo version10	BD
Fluorescein sodium salt	Sigma-Aldrich	F6377
GlutaMAX Supplement	Thermo Fischer Scientific	35050-061
Glutaraldehyde solution	Sigma-Aldrich	G6257
HCL	Sigma-Aldrich	H1758
HEPES buffer solution	Thermo Fischer Scientific	15630-056
Human Endothelial Serum Free Medium (hESFM)	Thermo Fischer Scientific	11111-044
Human fibroblast growth factor 2 (FGF2)	Tocris	233-FB-500
iPS human induced pluripotent stem cells	Riken RBC	HPS1006
Kanamycin Sulfate (100x)	Thermo Fischer Scientific	15160-047
L-Ascorbic acid 2-phosphate sesquimagnesium salt hydrate	Sigma-Aldrich	A8960-5G
L-Glutamine 200 mM (1003)	Thermo Fischer Scientific	25030-024
Matrigel, growth factor reduced	Corning	354230
MEM NEAA (1003)	Thermo Fischer Scientific	11140-035
Methanol	Sigma-Aldrich	32213
Mowiol	Sigma-Aldrich	81381
mTeSR Plus-cGMP	STEMCELL Technologies	ST-100-0276
mTeSR1 complete kit (basal medium plus 53 supplement)	STEMCELL Technologies	85850
NaCl	Sigma-Aldrich	71376
Paraformaldehyde	Millipore	104005
Pen Strep	Thermo Fischer Scientific	15140-122
Recombinant Human IFN-gamma Protein	R&D Systems	285-IF-100
Recombinant Human IL-2	BD Biosciences	554603
Recombinant Human TNF-alpha Protein	R&D Systems	210-TA-020
ROCK inhibitor Y-27632	Tocris	1254
RPMI medium 1640	Thermo Fischer Scientific	21875-034
Scalpel	FEATHER	2975-11
Skim milk	BD Biosciences	232100
Sodium azide (NaN3)	Sigma-Aldrich	71290
Sodium pyruvate	Thermo Fischer Scientific	11360-039
Transwells, PC Membrane, 0.4 mm, 12 mm, TC-Treated	Corning	3401
Tris base	Sigma-Aldrich	93362
Triton X-100	Sigma-Aldrich	X100
Vitronectin XF	STEMCELL Technologies	078180
Water, sterile, cell culture	Sigma-Aldrich	W3500